CC BY
202021, т. 11, № 2
УДК 616.697-021.6. DOI: 10.37279/2224-6444-2021-11-2-6-10
МОРФОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА СЕМЕННИКОВ В УСЛОВИИ КОРРЕКЦИИ ГИПОСПЕРМАТОГЕНЕЗА (ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ)
Демяшкин Г. А.1,2, Корякин С. Н.2, Вадюхин М. А.1, Щекин В. И.1,2
'ФГАОУ ВО «Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова (Сеченовский Университет), 119048 Трубецкая улица, 8 стр.2, Москва, Россия
2Федеральное государственное бюджетное учреждение Медицинский радиологический научный центр им. А.Ф. Цыба - филиал ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр радиологии» Минздрава РФ (ФГБУ «НМИЦ радиологии»), 249036, ул.Королева, 4, Обнинск, Россия.
Для корреспонденции: Демяшкин Григорий Александрович, кандидат медицинских наук, ФГАОУ ВО «Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова (Сеченовский Университет), e-mail: dr.dga@mail.ru
For correspondence: Grigory Demyashkin, PhD, I. M. Sechenov First Moscow State Medical University (Sechenov University), e-mail: dr.dga@mail.ru
Information about authors:
Demyashkin G. A., https://orcid.org/0000-0001-8447-2600 Koryakin S. N., https://orcid.org/0000-0003-0128-4538 Vadyukhin M. A., https://orcid.org/0000-0002-6235-1020 Shchekin V. I., https://orcid.org/0000-0003-3763-7454
РЕЗЮМЕ
В настоящее время бесплодие затрагивает до 15% супружеских пар во всем мире, половина из которого обусловлено «мужским фактором». Для изучения механизмов нарушения сперматогенеза требуется создание моделей с использованием лекарственных препаратов, обладающих высокой гонадотоксичностью или облучения с последующим применением методов, способствующих повышению функции и качества сперматозоидов, одним из которых является плазма, обогащенная тромбоцитами (Leukocyte-poor platelet-rich plasma, LP-PRP). Цель исследования: морфологическая оценка сперматогенеза при использовании плазмы, обогащенной тромбоцитами, после облучения электронами в дозе 2 Грей. Материал и методы. Самцы Wistar (220±20 г; 9 - 10 недель; n=60) были случайным образом поделены на 3 группы (условные названия): I -Контроль; II - облучение электронами, доза 2 Гр; III - введение LP-PRP+IGF после облучения в течение 35 дней. Результаты. Через неделю после облучения обнаружили снижение количества половых клеток, уменьшение высоты сперматогенного эпителия. Положительные эффекты после применения LP-PRP+IGF наблюдали уже на второй неделе, которые сохранялись на протяжении всего эксперимента. Заключение. Компоненты плазмы, обогащенной тромбоцитами, способствуют активации сперматогоний и восстановлению пула половых клеток, тем самым оказывая положительное влияние на сперматогенез.
Ключевые слова: сперматогенез, бесплодие, облучение, обогащенная тромбоцитами плазма.
MORPHOLOGICAL CHARACTERISTICS OF THE TESTIS UNDER CONDITIONS OF CORRECTION OF HYPOSPERMATOGENESIS (EXPERIMENTAL RESEARCH)
Demyashkin G. A.12, Koryakin S. N.2, Vadyukhin M. A.1, Shchekin V. I.12
1I. M. Sechenov First Moscow State Medical University (Sechenov University), Moscow, Russia.
2Medical Radiological Scientific Center named after A.F. Tsyba - branch of the National Medical Research Center
of Radiology, Obninsk, Russia.
SUMMARY
Currently, infertility affects up to 15% of married couples worldwide, half of which is due to the «male factor». To study the mechanisms of impaired spermatogenesis, it is required to create models using drugs with high gonadotoxic-ity or radiation, followed by the use of methods that improve the function and quality of spermatozoa, one of which is Leukocyte-poor platelet-rich plasma (LP-PRP). Purpose of the study: morphological assessment of spermatogenesis using platelet-rich plasma after electron irradiation at a dose of 2 Gray. Material and methods. Wistar males (220±20 g; 9 - 10 weeks; n= 60) were randomly divided into 3 groups (conventional names): I - Control; II - electron irradiation, dose 2 Gray; III - administration of LP-PRP+IGF after irradiation for 35 days. Results. A week after irradiation, a decrease in the number of germ cells and a decrease in the height of the spermatogenic epithelium were found. Positive effects after the application of LP-PRP+IGF were observed already in the second week, which persisted throughout the entire experiment. Conclusion. The components of platelet-rich plasma contribute to the activation of spermatogonia and the restoration of the pool of germ cells, thereby having a positive effect on spermatogenesis.
Key words: spermatogenesis, infertility, radiation, platelet-rich plasma.
2021, т. 11, № 2
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
В настоящее время бесплодие затрагивает до 15% супружеских пар во всем мире, половина из которого обусловлена «мужским фактором», а у 2% мужчин наблюдаются субоптимальные параметры сперматозоидов (азооспермия), причинами которых могут быть один или сочетание нескольких факторов - инфекционный, аутоиммунный, идиопатический и др. [1; 2; 3].
Для изучения механизмов нарушения сперматогенеза требуется создание моделей с использованием лекарственных препаратов, обладающих гонадотоксичностью или облучения [4].
Облучение всего тела может вызвать обратимые или необратимые повреждения семенника - одного из наиболее радиочувствительных органов в дозах облучения от 0,1 Гр и выше из-за наличия сенсибилизированных активно про-лиферирующих половых клеток. Сообщалось о снижении количества и появлении морфологических аномалий сперматозоидов при дозах облучения крыс от 1 до 2 Гр. [5; 6].
Одним из методов, способствующих повышению функции и качества сперматозоидов, в последнее время является применение плазмы, обогащенной тромбоцитами (Leukocyte-poor platelet-rich plasma, LP-PRP), потенциальный терапевтический эффект которой обусловлен наличием биологически активных веществ, способных повышать качественные и количественные параметры сперматозоидов [7].
Одним из ключевых факторов роста тромбоцитов в LP-PRP является инсулиноподобный фактор роста-1 (Insuline-like growth factor-1, IGF-1), который может способствовать генерации округлых и удлиненных сперматид в культивируемых MTF (mouse testicular fragment) новорожденных.
Исходя из вышесказанного, мы полагаем, что LP-PRP улучшает морфофункциональные характеристики половых клеток и является регенеративным субстратом за счет выделения биологически активных веществ, играющих важную роль в процессе сперматогенеза, а дополнительное введение IGF приведет к повышению эффективности LP-PRP в экспериментальной модели гипосперматогенеза у животных.
Цель исследования: морфологическая оценка сперматогенеза при использовании плазмы, обогащенной тромбоцитами, после облучения электронами в дозе 2 Грей.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
Экспериментальное морфологическое исследование проводили на базах Сеченовского университета и Экспериментального сектора Медицинского радиологического научного центра имени А.Ф. Цыба.
Животные для исследования in vivo. Самцов крыс Wistar (220±20 г; 9 -10 недель; n=60) содержали в виварии при контролируемой температуре (22°C) и световом периоде (12L:12D) со свободным доступом к воде и крысиному корму.
Дизайн эксперимента.
Экспериментальные животные были случайным образом поделены на 3 группы (условные названия): I - Контроль, II - 2РТ, III - 2PT+LP-PRP+IGF. I группе (n=10) вводили 0,9% физиологический раствор NaCl интраперитонеально на протяжении всего эксперимента; II группа (n=30) однократное прицельное облучение электронами тазово-брюшного сегмента (фиксация животных в специально сконструированных распорках) с использованием линейного акселератора (линейный акселератор «NOVAC-ll», мощность дозы 1 Гр/мин, энергия 10 МэВ, частота 9 Гц, размер поля - 0 100 мм; доза - 2 Гр); III группа (n=20) после однократного облучения животные получали LP-PRP (200 мкл, интраперитонеальная инъекция один раз в неделю в течение 4 недель) и IGF (14 МЕ/кг, 0.333 мг/кг, подкожная инъекция один раз в неделю в течение 4 недель).
Животных всех групп (I - III) выводили из эксперимента путем введения высоких доз анестетика. Сроки умерщвления: I группа - на 42 сутки от начала эксперимента; II группа - по 5 крыс на 7, 14, 21, 28, 35, 42 сутки после облучения электронами; III группа - по 5 крыс на 14, 21, 28 и 35 сутки после облучения электронами. При выборе срока эксперимента учитывали физиологическую длительность сперматогенеза у крыс, которая, в среднем, составляет 45 дней.
Плазму, обогащенную тромбоцитами (LP-PRP), изготавливали согласно стандартной методике [8].
Морфологический блок.
После извлечения оценивали внешний вид семенников, состояние паренхимы на разрезе, взвешивали (в граммах) и измеряли, фиксировали в растворе Буэна, приготавливали парафиновые блоки, а затем срезы, которые окрашивали гематоксилином и эозином согласно стандартной методике.
Морфологический и морфометрический анализ проводили в 10-ти случайно выбранных полях зрения микроскопа при увеличении ><200 и х400 в 4-х рандомных срезах с каждого образца, перемещая предметные стёкла с равными интервалами вдоль осей X и Y, с использованием полуавтоматического анализатора изображения. Световую микроскопию осуществляли с помощью системы видео-микроскопии (микроскоп Leica DM2000, Германия; камера Leica ICC50 HD; компьютер Platrun LG), а морфометриче-
2021, т. 11, № 2
пользованием компьютерной программы SPSS 12.00 for Windows statistical software package (IBM Analytics, США). Сравнение между группами проводилось с использованием однофак-торного дисперсионного анализа ANOVA со значимостью p<0.01.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Макро- и микроскопическая оценка. В образцах второй группы отмечали деструктивные изменения семенников (площадь -2590000 мкм2): уменьшение количества извитых семенных канальцев в 1,5 раза и половых клеток по сравнению с нормой, дегенерацию сперматид и сперматозоидов; снижение количества клеток Сер-толи и Лейдига без изменений их структуры. На долю семенных канальцев со снижением высоты сперматогенного эпителия (ниже 50 мкм) и появлением признаков аплазии (площадь - 28079,84 мкм2; диаметр - 189,083 мкм; p<0.01) приходилось до 1/8 части семенника (1 - 2 поперечных среза канальцев в поле зрения); средний балл по Johnsen -7.00±0.4 при p<0.01. После введения LP-PRP+IGF отмечали восстановление гистоархитектоники, а также увеличение объема и размеров семенников (площадь - 2867000 мкм2), количества канальцев (до 1300) и гамет, восстановление высоты спер-матогенного эпителия и волокнистого компонента интерстициальной ткани практически до нормальных значений (табл. 1, 2, 3) (рис. 2).
Таблица 1
Вес и объем семенников в экспериментальных группах, при p<0.01
Группы Вес семенников, г Объем семенников, мкм3
контроль (42 сут.) 1.5±0.1 1397.5±14.3
2РТ (42 сут.) 0.8±0.05* 688.3±7.2*
2PT+LP-PRP+IGF (35 сут.) 1.06±0.09** 831±12.6**
Примечание: * р<0.01 (контроль и 2РТ); ** р<0.01 (контроль и 2РТ+LP-PRP+IGF)
Таблица 2
Морфометрические данные семенных канальцев в экспериментальных группах, при p<0.01
Группа Площадь семенного канальца, мкм2 Диаметр семенного канальца, мкм Объем интерсти-циальной ткани, мкм3 Высота спермато-генного эпителия, мкм
контроль (42 сут.) 224151.32±103.7 344.4±6.4 93.1±7.3 110.9±13.05
2РТ (42 сут.) 173252.09±72.07* 310.57±2.1* 189.2±14.1* 68.2±7.67*
2PT+LP-PRP+IGF (35 сут.) 196748.73±87.63** 328.69±4.9** 146.9±8.5** 87.8±10.86**
Примечание: * p<0.01 (контроль и 2РТ); ** p<0.01 (контроль и 2PT+LP-PRP+IGF)
Положительные эффекты после применения клеток и нормальное функционирование спер-LP-PRP+IGF наблюдали уже на второй неделе. матогенеза наблюдали к концу исследования (на Окончательное восстановление пула половых 35 сутки).
ские данные получали с использованием ПО Olympus DP2-BSW (с версий 2.1 по 2.2, сборка 6212, Токио, Япония) (рис.1).
В каждом из полей рассчитывали следующие параметры: объем семенника; диаметр извитых семенных канальцев; количество мужских гамет, клеток Сертоли и Лейдига; высоту сперматогенного эпителия; объем интерстициальной ткани.
Тестикулярную оценку проводили с использованием критериев S. Johnsen.
Рис. 1. Морфометрические данные семенников с использованием программных обеспечений для обработки и анализа изображения Leica Application Suite (LAS); синим цветом выделены семенные канальцы с признаками аплазии.
Статистический анализ. Полученные в результате подсчёта данные обрабатывали с ис-
2021, Т. 11, № 2 ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
Таблица 3
Количество половых клеток в семенных канальцах при облучении электронами разными дозами,
при р<0.01
Группы Сперматогонии (А и В)х106 Сперматоциты х106 Сперматиды х106 Клетки Серто-лих106 Клетки Лейди-га х106
контроль(42 сут.) 117.2±5.6 110.3±3.1 163.2±3.18 12.0±0.2 8.0±0.2
2РТ (42 сут.) 43.6±2.5* 101.0±1.5* 150.6±1.9* 10.0±0.5* 7.0±0.1*
2РТ+LP-PRP+IGF (35 сут.) 75.9±3.7** 105.8±2.2** 156.0 ± 2.5** 9.8 ± 0.6** 6.9 ± 0.11**
Примечание: * р<0.01 (контроль и 2РТ); ** р<0.01 (контроль и 2РТ+LP-PRP+IGF)
Рис. 2. Семенник, морфологическая картина экспериментальных групп; окраска - гематоксилином и эозином, увелич. х200. А - контроль; Б - на 7 сутки после облучения (2 Гр, однократно), маркер -семенные канальцы с признаками аплазии; В - на 35 сутки после облучения (2 Гр, однократно) и
введения LP-PRP+IGF.
ОБСУЖДЕНИЕ
Мужской фактор остается одной из ведущих причин, приводящей к бесплодию в супружеских парах, так как нарушение репродуктивной функции напрямую связано со структурными изменениями в яичках [9].
Для понимания механизмов нарушения сперматогенеза необходимо их изучение с использованием моделей, а также применение перспективных методов коррекции, что послужило темой настоящего исследования.
Для ингибирования сперматогенеза у животных впервые был использован импульсный ускоритель электронов <^ОУАС-11». Уже через неделю были обнаружены нарушения гистоар-хитектоники семенника, снижение количества половых клеток (после облучения происходит образование сшивок и подавление репликации ДНК, а также апоптоз, возникающий под действием ионизирующего излучения на митотиче-ски активные клетки [10]), уменьшение высоты сперматогенного эпителия, но с сохранением его целостности. Описанные патоморфологические
изменения в группе облученных животных (2РТ) сохранялись на протяжении всего эксперимента, что позволило вводить LP-PRP+IGF животным Ш-й группы многократно. Полученные результаты, на первый взгляд, противоречат данным других исследований [11], однако обнаруженные морфологические изменения можно объяснить более мягким действием электронов на структуры семенника в отличие от гамма-облучения. Преимуществом прицельного облучения, применяемого в данном исследовании в сравнении с введением химиопрепаратов, а также общего облучения, является протекция других органов и систем от возможной деструкции и других неблагоприятных последствий [4].
Согласно имеющимся данным в специализированной литературе, различные факторы роста играют важную роль в улучшении качественно-количественных характеристик мужских гамет и их микроокружения - улучшают пролиферацию, дифференцировку и предотвращают апоптоз [3].
Многие исследователи часто используют LP-PRP для восстановления семенников после моделирования в них бесплодия, однако резуль-
2021, т. 11, № 2
таты таких экспериментов противоречивы. В исследовании Mauduit et al. отмечали снижение экспрессии факторов роста на фоне облучения животных в дозах 0,5 Гр, 1 Гр, 2 Гр и 4 Гр, поэтому для усиления эффекта LP-PRP и ускорения процессов восстановления сперматогенеза после облучения мы дополнительно вводили IGF животным III группы, что, скорее всего, было обосновано, учитывая наблюдаемые положительные эффекты [10]. В то же время, исследования, в которых животным вводили только PRP не показали подобного эффекта [4].
Используемая для коррекции гипосперма-тогенеза плазма, обогащенная тромбоцитами, активированная CaCl2, в комбинации с IGF в настоящем исследовании привела к активации низкодифференцированных сперматогоний B-типа и восстановлению пула половых клеток, что частично совпадает с данными других исследователей [4]. Количество клеток Сертоли и Лейдига на протяжении эксперимента во всех группах практически оставалось неизменным в связи с их большей устойчивостью к воздействию радиации [11].
Следует отметить, что появление положительной динамики в семенниках животных на фоне комбинированного применения LP-PRP+IGF связано с правильно подобранной концентрацией и частотой введения LP-PRP и IGF.
Таким образом, возникшие патоморфологи-ческие изменения герминативного и стромаль-ного компонентов семенников под действием ионизирующего излучения приводят к гипо-сперматогенезу, что может быть использовано в качестве модели, например, секреторной формы мужского бесплодия, а все вышеперечисленные факторы и биохимические процессы могут быть вовлечены в механизм улучшения PRP-зависимых параметров сперматогенеза и морфологии сперматозоидов.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Компоненты плазмы, обогащенной тромбоцитами, способствуют активации сперматого-ний и восстановлению пула половых клеток, тем самым оказывая положительное влияние на сперматогенез. На основании выявленных качественных и количественных патоморфо-логических изменений семенных канальцев, возникших на фоне применения импульсного ускорителя электронов «NOVAC-11», можно использовать его при моделировании гипоспер-матогенеза.
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Conflict of interest. The authors have no conflict of interests to declare.
ЛИТЕРАТУРА / REFERENCE
1. Kumar N., Singh A. K. Trends of male factor infertility, an important cause of infertility: A review of literature. J Hum Reprod Sci. 2015;8(4):191-196. doi:10.4103/0974-1208.170370
2. Chalyi M. E., Akhvlediani N. D., Kharchilava R. R. Male infertility. Urologiia. 2017;(S2):4-19. (In Russ.)
3. Demyashkin G. A. Apoptosis in seminiferous tubules of human in normal and in idiopathic infertility. Tsitologiya. 2018;60:208-218. (In Russ.) doi:10.31116/tsitol.2018.03.07.
4. Dehghani F., Sotoude N., Bordbar H., Panjeshahin M., Karbalay-Doust S. The use of platelet-rich plasma (PRP) to improve structural impairment of rat testis induced by busulfan. Platelets. 2018;30(6):1-8. doi: 10.1080/09537104.2018.1478400
5. Khan S., Adhikari J. S., Rizvi M. A. Radioprotective potential of melatonin against 60Co y-ray-induced testicular injury in male C57BL/6 mice. J Biomed Sci. 2015;22:61. doi.org/10.1186/ s12929-015-0156-9
6. Dergilev A. A., Palyga G. F., Chibisova O. F., Ivanov V. L., Panfilova V. V., Zhavoronkov L. P. Radiation and spermatogenesis: experimental estimation of radiation effect at doses below castrate level on ontogenesis. Radiation and Risk. 2012;21(4):51-60. (In Russ.)
7. Al-Nasser R. The Effectiveness of Autologous Platelet-Rich Plasma (PRP) in the Therapy of Infertile Men with Non-Abstractive Azoospermia, J Reprod Med Gynecol Obstet. 2018;3:011. doi: 10.24966/RMG0-2574/100011
8. Filardo G., Kon E., Roffi A. Platelet-rich plasma: why intra-articular? A systematic review of preclinical studies and clinical evidence on PRP for joint degeneration // Knee Surg. Sports Traumatol. Arthrosc. 2015;23:2459-2474
9. Demyashkin G. A. Inhibin B in seminiferous tubules of human testes in normal spermatogenesis and in idiopathic infertility. Syst Biol Reprod Med. 2019;65(1):20-28. doi:10.1080/19396368.2018.147 8470
10. Marzban M., Anjamshoa M., Jafari P., Masoumi H., Ahadi R., Fatehi D. Effects of gamma rays on rat testis tissue according to the morphological parameters and immunohistochemistry: radioprotective role of silymarin. Electron Physician. 2017;9(6):4524-4532. doi: 10.19082/4524
11. Mauduit C., Siah A., Foch M., Chapet O., Clippe S., Gerard J., Benahmed M. Differential expression of growth factors in irradiated mouse testes. International journal of radiation oncology, biology, physics. 2001:50;203-12. doi:10.1016/ S0360-3016(01)01461-4.
