CC BY
112022, т. 12, № 4
крымский журнал экспериментальной и клинической медицины
УДК 615.849.12 DOI: 10.29039/2224-6444-2022-12-4-54-58
МОРФОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ЭПИТЕЛИЯ ТОЛСТОЙ КИШКИ ПРИ ОБЛУЧЕНИИ ЭЛЕКТРОНАМИ ДОЗАМИ 2 ГР И 8 ГР
Шаповалова Е. Ю.1, Демяшкин Г. А.2, Саакян С. В.1, Каракаева Э. Б-Г1, Зорин И. А.2, Марукян А. Х.1
'Институт «Медицинская академия имени С. И. Георгиевского» ФГАОУ ВО «Крымский- федеральный университет имени В. И. Вернадского», 295051, бульвар Ленина, 5/7, Симферополь,*Россия
2ФГАОУ ВО «Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова (Сеченовский Университет), 119048, ул. Трубецкая, 8, стр.2, Москва, Россия
Для корреспонденции: Демяшкин Григорий Александрович, к.м.н., заведующий лабораторией гистологии ИТМиБ Первого МГМУ им. И.М. Сеченова (Сеченовский Университет); e-mail: [email protected]
For correspondence: Grigory Demyashkin, PhD, Head of Department of Hystology, ITM of Sechenov University, e-mail: [email protected]
Information about authors:
Shapovalova E. Y., http://orcid.org/0000-0003-2544-7696 Demyashkin G. A., https://orcid.org/0000-0001-8447-2600 Saakian S. V., https://orcid.org/0000-0001-8606-8716 Karakaeva E. B-G., https://orcid.org/0000-0001-9833-3433 Zorin I. A., https://orcid.org/0000-0002-1621-7015 Marukyan A. Kh., https://orcid.org/0000-0002-4619-7385
РЕЗЮМЕ
Для успешной терапии злокачественных новооборазований применяются различные методы, которые включают в себя хирургическое лечение, химиотерапию и лучевую терапию. Однако, прямое и косвенное воздействие ионизирующего сопряжено с рядом побочных эффектов для пациента. Эпителий толстой кишки относится к одной из наиболее радиочувствительных структур, так как занимает большую площадь и может быть подвержен действию облучения при абдоминальной, тазовой и торакальной лучевой терапии. В связи с активным внедрением в клиническую практику линейных ускорителей электронов исследования их эффектов на толстую кишку, а именно развитие гастроинтестинального синдрома и скорость регенерации эпителия, являются актуальными, а работы в данном направления практически отсутствуют. Цель исследования -морфологическая оценка эпителия толстой кишки после локального облучения электронами дозой 2 Гр и 8 Гр. Материалы и методы. Животные - половозрелые крысы линии Вистар (n=50) были поделены на три группы: I -контрольная (n=10); в остальных группах однократно локально облучали брюшной сегмент электронами дозами 2 Гр - II группа (n=20), и 8 Гр - III группа (n=20). Результаты. При микроскопическом изучении фрагментов II группы на 1 сутки наблюдали незначительные изменения с редукцией бокаловидных клеток, которые были восстановлены на 3 сутки. Во фрагментах толстой кишки животных III группы через 1 сутки после облучения (8 Гр) наблюдали морфологическую картину постлучевого колита с выраженной потерей бокаловидных клеток и снижением глубины кишечных крипт. На 3 сутки отмечали восстановление гистоархитектоники толстой кишки: расположение и строение кишечных крипт, количество бокаловидных клеток приблизились к контрольным значениям. Заключение. Облучение электронами способно вызвать нарушение гистоархитектоники толстой кишки, преимущественно с повреждением пула стволовых клеток. Однократное повреждение электронами толстой кишки дозами 2 Гр и 8 Гр носят обратимый дозозависимый характер.
Ключевые слова: облучение электронами, толстая кишка, крипта, бокаловидные клетки
MORPHOLOGICAL CHARACTERISTICS OF THE COLON EPITHELIUM AFTER ELECTRON IRRADIATION WITH DOSES OF 2 GY AND 8 GY.
Shapovalova E. Y.1, Demyashkin G. A.2, Saakian S. V.1, Karakaeva E. B-G.1, Zorin I. A.2, Marukyan A. Kh.1
'Institution «Medical Academy named after S. I. Georgievsky» of Vernadsky CFU, Simferopol, Russia 2I. M. Sechenov First Moscow State Medical University (Sechenov University), Moscow, Russia
SUMMARY
Various methods are used to successfully treat malignant neoplasms, which include surgery, chemotherapy and radiation therapy. However, direct and indirect exposure of irradiation is associated with several side effects for the patient. The epithelium of the colon is one of the most radiosensitive structures, as it occupies a large area and can be exposed to radiation during abdominal, pelvic and thoracic radiation therapy. In connection with the active introduction of linear electron accelerators into clinical practice, studies of their effects on the large intestine, namely the development of gastrointestinal syndrome and the rate of epithelial regeneration, are relevant, and there are practically no works in this direction. The purpose of the study was a morphological assessment of the colon epithelium after local electron
irradiation with a dose of 2 Gy and 8 Gy. Materials and methods. Animals - adult Wistar rats (n=50) were divided into three groups: I - control (n=10); in other groups, the abdominal segment was locally irradiated once with electrons at doses of 2 Gy - group II (n=20), and 8 Gy - group III (n=20). Results. Microscopic examination of fragments of II group on 1st day showed minor changes with a reduction in goblet cells, which were restored on 3rd day. In fragments of the large intestine of animals of group III, 24 hours after irradiation (8 Gy), a morphological picture of post-radiation colitis was observed with a pronounced loss of goblet cells and a decrease in the depth of intestinal crypts. On the 3rd day, the restoration of the histoarchitectonics of the large intestine was noted: the location and structure of the intestinal crypts, the number of goblet cells approached the control values. Conclusion. Irradiation with electrons can cause a violation of the histoarchitectonics of the colon, mainly with damage to the pool of stem cells. One-time electron damage to the colon with doses of 2 Gy and 8 Gy is reversible dose-dependent.
Key words: electron irradiation, colon, crypt, goblet cells
В настоящее время число онкологических пациентов по всему миру приближается к 25 миллионам человек, а в течение последующих 20 лет прогнозируется увеличение до 75 миллионов [1; 2]. Для успешной терапии злокачественных но-вооборазований применяются различные методы, которые включают в себя хирургическое лечение, химиотерапию и лучевую терапию [3]. Однако, прямое и косвенное воздействие ионизирующего сопряжено с рядом побочных эффектов для пациента.
Облучение приводит к повреждению генетического материала опухолевых клеток, что приводит к запуску апоптотических путей и деструкции клеток, а высвобождение большого количество свободных радикалов кислорода сопровождается дисбалансом в функционировании антиоксидант-ной системы: снижается количество глутатиона на фоне увеличения малондиальдегида [4].
Несмотря на активное развитие локальной радиотерапии, когда облучению подвергается только определенная область, лучевая терапия все еще остается неизбирательным методом, при котором совместно с пораженными клетками могут погибать окружающие ткани.
Эпителий толстой кишки относится к одной из наиболее радиочувствительных структур, так как занимает большую площадь и может быть подвержен действию облучения при абдоминальной, тазовой и торакальной лучевой терапии. Как уже было показано в предыдущих исследованиях, быстро обновляемые эпителиальные ткани являются наиболее зависимыми от радиационного облучения, так как при десква-мации эпителия и цитотоксическом воздействии на стволовые клетки невозможно адекватно восстановить функциональный слой. Однако, глубина и степень повреждения от вида и способа облучения [5; 6].
В связи с активным внедрением в клиническую практику линейных ускорителей электронов исследования их эффектов на толстую кишку, а именно развитие гастроинтестинального синдрома и скорость регенерации эпителия, являются актуальными, а работы в данном направления практически отсутствуют.
Цель исследования: морфологическая оценка эпителия толстой кишки после локального облучения электронами дозой 2 Гр и 8 Гр.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
Животные - половозрелые крысы линии Ви-стар (n=50) были поделены на три группы: I -контрольная (n=10); в остальных группах однократно локально облучали брюшной сегмент электронами дозами 2 Гр - II группа (n=20), и 8 Гр - III группа (n=20).
Облучение животных проводили в отделе радиационной биофизики МРНЦ имени А.Ф. Цыба (г. Обнинск, Россия) на линейном акселераторе "NOVAC-11" (мощность дозы 1 Гр/мин, энергия 10 МэВ и частота 9 Гц, размер поля - 0 100 мм).
По половине животных из каждой группы выводили из эксперимента на 1 и 3 сутки.
Все манипуляции выполняли согласно «Международным рекомендациям по проведению медико-биологических исследований с использованием животных» (ЕЭС, Страсбург, 1985) и Хельсинской декларации Всемирной медицинской ассоциации.
Гистологическое исследование.
Фрагменты ободочной кишки фиксировали в забуферном формалине, заливали в парафиновые блоки, нарезали на микротоме толщиной 3 мкм, окрашивали гематоксилином и эозином. Микроскопический анализ выполняли с помощью системы видео-микроскопии (микроскоп Leica DM2000, Германия; камера Leica ICC50 HD; компьютер Platrun LG), количество бокаловидных клеток подсчитывали в 10 различных полях зрения с захватом целой крипты.
Статистический анализ был выполнен с использованием t-критерия Стьюдента. Для всех сравнений значение p<0,05 считалось статистически значимым.
РЕЗУЛЬТАТЫ
При макроскопическом исследовании толстой кишки (ободочной) через 24 часа после облучения дозой 8 Гр наблюдали отек стенки, с единичными эрозиями слизистой оболочки, а на
крымскии журнал экспериментальном и клиническои медицины
2022, т. 12, № 4
3 сутки: наличие спаечного процесса, сужение просвета кишечника, гипертрофию мышечной оболочки.
При микроскопическом исследовании образцов толстой кишки после облучения электронами дозой 2 Гр на 1 сутки отмечали слабую редукцию бокаловидных клеток (табл. 1). Через 3 суток после облучения численность бокаловидных клеток была восстановлена. Количество клеток с фигурами митоза, то есть обладающие пролиферативной активностью, было незначительно увеличено по сравнении с предыдущим сроком (рис. 1).
Во фрагментах толстой кишки животных III группы через 1 сутки после облучения (8 Гр)
наблюдали морфологическую картину постлучевого колита: деструктивные изменения однослойного цилиндрического эпителия с наличием апоптотических телец и интраэпителиальной и интрамукозной воспалительной инфильтрации, интерстициальный отек. Количество бокаловидных клеток и глубина крипт были снижены, а сами кишечные крипты - незначительно расширены. В просветах кровеносных сосудов обнаружили единичные тромботические массы. На 3 сутки отмечали восстановление гистоархитек-тоники толстой кишки: расположение и строение кишечных крипт, количество бокаловидных клеток приблизились к контрольным значениям (табл. 1, рис. 1).
Таблица 1
Результаты гистоморфометрическихисследований глубиныкишечных крипт в контрольнойи экспериментальных группах
2 Гр (II) 8 Гр (III) Кк1ШОлк (I)
1сутки 3 сутки 1 сутки Зсуз1ш
Бокаловид rnie клетки 23,30±1,89а 23,8±1,8Т 21,65±2,1Зт 26,ОТ ±2i26 27,10±2,02
Примечание: аконтроль (I) и II группа, ьконтрол ь (I) и III группа; p <0.01
1 сутки
4 сутки
2 Гр
8 Гр
Рис.1.Микроскоплчеснабкалткнбыхишеонлех кблиттонстоболшки черео1 бЗ скткипосле ойлуче-ния электронами дозами 2 Гр и 8 Гр. Окраска: Гематоксилин и эозин, увелич. х200.
ОБСУЖДЕНИЕ
В настоящей работе изучали морфологические изменения в стенки толстого кишечника после острого лучевого повреждения электронами дозами 2 Гр и 8 Гр. Результаты эксперимента оценивали в двух временных точках, определение которых было основано на пролифератив-ных циклах эпителия толстой кишки.
При облучении электронами дозой 2Гр через 1 сутки после повреждения в толстой кишке не наблюдается существенных нарушений гисто-архитектоники, однако, оценивая сократившееся количество бокаловидных клеток, можно говорить об индуцированном запуске апопто-тических процессов в слизистой оболочке, что согласуется с исследованиями других авторов, в которых описываются другие виды острого лучевого повреждение толстой кишки [1; 7; 8]. Наблюдаемое через 3 суток увеличение количества митотических клеток свидетельствует об активном процессе пролиферации и регенерации кишечного эпителия. После облучения электронами в дозе 8 Гр на 1 сутки наблюдаются более существенные изменения в гистологическом строении толстой кишки. Обнаруженная миграция иммунных клеток, десквамация эпителия и изменение размера крипт позволяют сделать вывод о дозозависимом эффекте ионизирующего излучения на толстую кишку. Известно, что полное обновление клеток слизистой оболочки толстой кишки в норме занимает 3-5 дней, поэтому изменения, выявленные на 1 сутки, говорят о функциональной недостаточности стволовых клеток, которая вызвана острым лучевым повреждением электронами [9; 10].
Как уже было показано в работах других авторов, скорость регенерации эпителиоцитов зависит от количества стволовых клеток в кишечных криптах: при уменьшении количества стволовых клеток снижается скорость регенерации, однако, даже при наличии одной стволовой клетки возможна полная регенерация эпителия [11; 12]. Таким образом, можно говорить о том, что увеличение дозы ионизирующего излучения влияет не только на функциональные эпителио-циты, но и на стволовые клетки, что приводит к замедлению процессов пролиферации.
Через 3 суток после эксперимента в II и III группе наблюдали восстановление нормальной гистоархитектоники, однако у животных III группы количество бокаловидных клеток все еще не было полностью восстановлено, что указывает на незавершенный процесс регенерации.
Таким образом, по результатам нашего эксперимента, можно говорить о том, что в толстом кишечнике ярко выражен дозозависимый эффект
повреждения, а облучение электронами, по всей видимости, в наибольшей степени воздействует на стволовые клетки и замедляет естественные процессы пролиферации и регенерации ткани, что приводит к нарушение клеточного гомеоста-за. Так же необходимо отметить, что, облучение электронами в дозе 2 Гр и 8 Гр не является фатальным для экспериментальных животных и толстого кишечника, так как в течение эксперимента мы не наблюдали гибель животных и клинические признаки толстокишечной недостаточности. Тем не менее, стоит продолжить изучение влияния лучевого повреждения электронами на толстый кишечник с использованием иммуноги-стохимического, молекулярно-генетического и химических методов исследования для точного установления механизмов воздействия.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Облучение электронами способно вызвать нарушение гистоархитектоники толстой кишки, преимущественно с повреждением пула стволовых клеток. Однократное повреждение электронами толстой кишки дозами 2 Гр и 8 Гр носят обратимый дозозависимый характер.
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Conflict of interest. The authors have no conflict of interests to declare.
ЛИТЕРАТУРА
1. Mercantepe F., Topcu A., Rakici S., Tumkaya L., Yilmaz A. The effects of N-acetylcysteine on radiotherapy-induced small intestinal damage in rats. Exp Biol Med. 2019;244(5):372-9. doi:10.18926/AMO/30946.
2. Mathur P., Sathishkumar K., Chaturvedi M., Das P., Sudarshan K. L, Santhappan S., и др. Cancer Statistics, 2020: Report From National Cancer Registry Programme. India. JCO Glob Oncol. 2020;(6):1063-75. doi:10.1200/GO.20.00122
3. Koom W. S., Sai S., Suzuki M., Fujimori A., Yamada S., Tsujii H. Superior Effect of the Combination of Carbon-Ion Beam Irradiation and 5-Fluorouracil on Colorectal Cancer Stem Cells in vitro and in vivo. OncoTargets Ther. 2020;13:12625-35. doi:10.2147/OTT.S276035.
4. Wiehe M., Fernández García M., Hidalgo S., Moll M., Otero Ugobono S., Parzefall U., и др. Study of the radiation-induced damage mechanism in proton irradiated low gain avalanche detectors and its thermal annealing dependence. Nucl Instrum Methods Phys Res Sect Accel Spectrometers Detect Assoc Equip. 2021;986:164814. doi 10.1016/j. nima.2020.164814.
5. Muschel R. J., Hammond E. M., Dewhirst M. W. A New Assay to Measure Intestinal
2022, т. 12, № 4
крымский журнал экспериментальной и клинической медицины
Crypt Survival after Irradiation: Challenges and Opportunities. Cancer Res. 2020;80(5):927-8. doi: 10.1158/0008-5472.CAN-19-4045.
6. Kumagai T., Rahman F., Smith A. M. The Microbiome and Radiation Induced-Bowel Injury: Evidence for Potential Mechanistic Role in Disease Pathogenesis. Nutrients. 2018;10(10):1405. doi:10.3390/nu10101405.
7. Pejchal J., Novotny J., Marak V., Österreicher J., Tichy A., Vavrova J., h gp. Activation of p38 MAPK and expression of TGF-ß1 in rat colon enterocytes after whole body Y-irradiation. Int J Radiat Biol. 2012;88(4):348-58. doi: 10.3109/09553002.2012.654044.
8. Weiber S., Bjelkengren Gör., Rank
F., Jiborn H., Zederfeldt B. Radiation Effects in the Colon: An Experimental Study in the Rat. Acta Oncol. 1993;32(5):565-9. doi: 10.3109/02841869309096119.
9. Karmakar S., Deng L., He X. C., Li L. Intestinal epithelial regeneration: active versus reserve stem cells and plasticity mechanisms. Am J Physiol-Gastrointest Liver Physiol. 2020;318(4):G796-802. doi: 10.1152/ ajpgi.00126.2019.
10. Liu Y., Chen Y. G. Intestinal epithelial plasticity and regeneration via cell dedifferentiation. Cell Regen. 2020;9:14. doi: 10.1186/s13619-020-00053-5.
11. Hageman J. H., Heinz M. C., Kretzschmar K., van der Vaart J., Clevers H., Snippert H. J.
G. Intestinal Regeneration: Regulation by the Microenvironment. Dev Cell. 2020;54(4):435-46. doi: 10.1016/j.devcel.2020.07.009.
12. Rees W. D., Tandun R., Yau E., Zachos N. C., Steiner T. S. Regenerative Intestinal Stem Cells Induced by Acute and Chronic Injury: The Saving Grace of the Epithelium? Front Cell Dev Biol. 2020;8. doi: 10.3389/fcell.2020.583919.
REFERENCES
1. Mercantepe F., Topcu A., Rakici S., Tumkaya L., Yilmaz A. The effects of N-acetylcysteine on radiotherapy-induced small intestinal damage in rats. Exp Biol Med. 2019;244(5):372-9. doi:10.18926/AM0/30946.
2. Mathur P., Sathishkumar K., Chaturvedi M., Das P., Sudarshan K. L, Santhappan S., h gp. Cancer Statistics, 2020: Report From National Cancer Registry Programme. India. JCO Glob Oncol. 2020;(6):1063-75. doi:10.1200/G0.20.001223. Koom W. S., Sai S., Suzuki M., Fujimori A., Yamada S., Tsujii H. Superior Effect of the Combination of
Carbon-Ion Beam Irradiation and 5-Fluorouracil on Colorectal Cancer Stem Cells in vitro and in vivo. OncoTargets Ther. 2020;13:12625-35. doi:10.2147/ OTT.S276035.
4. Wiehe M., Fernández García M., Hidalgo S., Moll M., Otero Ugobono S., Parzefall U., h gp. Study of the radiation-induced damage mechanism in proton irradiated low gain avalanche detectors and its thermal annealing dependence. Nucl Instrum Methods Phys Res Sect Accel Spectrometers Detect Assoc Equip. 2021;986:164814. doi 10.1016/j. nima.2020.164814.
5. Muschel R. J., Hammond E. M., Dewhirst M. W. A New Assay to Measure Intestinal Crypt Survival after Irradiation: Challenges and Opportunities. Cancer Res. 2020;80(5):927-8. doi: 10.1158/0008-5472.CAN-19-4045.
6. Kumagai T., Rahman F., Smith A. M. The Microbiome and Radiation Induced-Bowel Injury: Evidence for Potential Mechanistic Role in Disease Pathogenesis. Nutrients. 2018;10(10):1405. doi:10.3390/nu10101405.
7. Pejchal J., Novotny J., Marák V., Österreicher J., Tichy A., Vávrová J., h gp. Activation of p38 MAPK and expression of TGF-ß1 in rat colon enterocytes after whole body y-irradiation. Int J Radiat Biol. 2012;88(4):348-58. doi: 10.3109/09553002.2012.654044.
8. Weiber S., Bjelkengren Gör., Rank
F., Jiborn H., Zederfeldt B. Radiation Effects in the Colon: An Experimental Study in the Rat. Acta Oncol. 1993;32(5):565-9. doi: 10.3109/02841869309096119.
9. Karmakar S., Deng L., He X. C., Li L. Intestinal epithelial regeneration: active versus reserve stem cells and plasticity mechanisms. Am J Physiol-Gastrointest Liver Physiol. 2020;318(4):G796-802. doi: 10.1152/ ajpgi.00126.2019.
10. Liu Y., Chen Y. G. Intestinal epithelial plasticity and regeneration via cell dedifferentiation. Cell Regen. 2020;9:14. doi: 10.1186/s13619-020-00053-5.
11. Hageman J. H., Heinz M. C., Kretzschmar K., van der Vaart J., Clevers H., Snippert H. J.
G. Intestinal Regeneration: Regulation by the Microenvironment. Dev Cell. 2020;54(4):435-46. doi: 10.1016/j.devcel.2020.07.009.
12. Rees W. D., Tandun R., Yau E., Zachos N. C., Steiner T. S. Regenerative Intestinal Stem Cells Induced by Acute and Chronic Injury: The Saving Grace of the Epithelium? Front Cell Dev Biol. 2020;8. doi: 10.3389/fcell.2020.583919.
