CC BY
46
УДК 611.341+611.42]:547.475.2:616-092.9
E. R. Pereverzeva, I. D. Treschalin, D. A. Bodyagin, M. I. Treschalin, M. N. Preobrazhenskaya, V. M. Bukhman
ORAL ADMINISTRATION OF ASCORBIGEN ACCELERATES THE REGENERATION OF SMALL INTESTINE AND LYMPHOID ORGANS OF MICE AFTER INJURY CAUSED BY CYCLOPHOSPHAMIDE
Gause Institute of New Antibiotics RAMS, Moscow
ABSTRACT
The influence of ascorbigen (ASG), which is a component of cruciferous vegetables, on the mucous tunic of small intestine and immune system organs in normal mice and mice, received cyclophosphamide (Cy), was evaluated by morphological examination. A significant increase of number of Paneth cells in the crypts and goblet cells in the villi was found in mice, received ASG per os in daily dose of 100 mg/kg for 14 days. The amount of eosinophylic granules in Paneth cells and their sizes also sharply increased. Germinative centers arose in lymphoid follicles of lymph nodes. ASG accelerated the processes of the damage reparation of a small intestine mucous tunic, caused by the single dose of 200 mg/kg Cy intraperitoneally. ASG administration after Cy as well as before it prevented atrophy of lymphoid tissue in lymphoid organs.
Key words: ascorbigen, cyclophosphamide, mice, small intestine, Paneth cells, goblet cells, thymus, spleen, lymph nodes.
Э. P. Переверзева, И. Д. Трещалин, Д. А. Бодягин, М. И. Трещалин, М. Н. Преображенская, В. М. Бухман
ПЕРОРАЛЬНОЕ ПРИМЕНЕНИЕ АСКОРБИГЕНА С ЦЕЛЬЮ УСКОРЕНИЯ РЕПАРАЦИИ ИНДУЦИРОВАННЫХ ЦИКЛОФОСФАМИДОМ ПОВРЕЖДЕНИЙ ТОНКОЙ КИШКИ И ЛИМФОИДНЫХ ОРГАНОВ МЫШЕЙ
ГУ НИИ по изысканию новых антибиотиков им. Г. Ф. Гаузе РАМН, Москва
РЕЗЮМЕ
Проведено морфологическое изучение влияния аскорбигена (АСГ), компонента растений семейства крестоцветных, на слизистую оболочку тонкой кишки и органы иммунной системы интактных мышей и мышей, получавших циклофосфамид (ЦФ). Показано, что 14-кратное пероральное введение АСГ в разовой дозе 100 мг/кг вызывает значительное увеличение количества клеток Панета в криптах и бокаловидных клеток в ворсинках желез. В клетках Панета происходит увеличение количества, размеров и степени эозинофилии гранул. В лимфоидных фолликулах лимфатических узлов появляются центры размножения. Применение АСГ после однократного внутрибрюшинного введения ЦФ в дозе 200 мг/кг приводит к ускорению репарации повреждений слизистой оболочки тонкой кишки и препятствует развитию атрофических изменений в лимфоидных органах при введении его как до, так и после цитостатика.
Ключевые слова: аскорбиген, циклофосфамид, мыши, тонкая кишка, клетки Панета, бокаловидные клетки, тимус, селезенка, лимфатические узлы.
ВВЕДЕНИЕ
Терапевтический потенциал химиотерапии злокачественных новообразований часто ограничен токсическими эффектами противоопухолевых лекарств. В настоящее время в клиническую практику вошел ряд препаратов, обладающих способностью ослаблять повреждающее действие цитостатиков на нормальные клетки или ускорять их репарацию после повреждения [4]. Их относят к группе модификаторов токсических реакций (МТР). МТР улучшают качество жизни больных и в комплексе с противоопухолевыми лекарствами играют важную роль в лечении онкологических заболеваний [24]. С помощью МТР были достигнуты большие успехи в борьбе с наиболее частым осложнением цитостатической химиотерапии — угнетением гемопо-эза [1]. Успех же в преодолении других видов токсичности цитостатиков менее значителен. В частности, это касается так называемого индуцированного цитостатиками энтерита и поражения иммунокомпетентных органов. Многие МТР были найдены среди веществ природного происхождения, а затем были созданы их синтетические дериваты или аналоги. АСГ — соединение природного происхождения. Он образуется при обработке растений семейства крестоцветных [5, 13], к которым относятся все виды кочанной капусты, брюссельская и цветная капуста, брокколи, репа, брюква, редиска и др. АСГ был выделен в 1937 г., а в 1966 г. была установлена его структура. Он представляет собой 2-с-(индол-3-ил)метил-а-£-ксило-гекс-3-улофуранозо-но-1,4-лактон. Его получают синтетически из Ь-аскор-биновой кислоты и индолил-3-карбинола.
Хотя АСГ известен давно, его биологическая активность изучена очень мало. Во многих эпидемиологических исследованиях и экспериментах на животных было показано, что употребление в пищу большого количества овощей семейства крестоцветных уменьшает риск заболевания раком различных органов [6, 10, 19], и установлено, что антиканцерогенные свойства растений семейства крестоцветных во многом определяются АСГ. Последний обладает способностью ослаблять токсические эффекты отдельных веществ и усиливать активность ряда ферментов, участвующих в метаболизме ксенобиотиков [2].
ЦФ — противоопухолевый препарат, относящийся к группе алкилирующих агентов, обладает широким спектром действия и включается во многие схемы комбинированной химиотерапии [1]. Хотя среди хлорэти-ламинных противоопухолевых средств ЦФ является одним из наименее токсичных алкилирующих соединений, для него характерен ряд побочных эффектов, в частности миело- и иммунодепрессия и диспептиче-ский синдром, возникающий на основе повреждения слизистой оболочки желудочно-кишечного тракта.
Поскольку поиск модификаторов токсичности противоопухолевых препаратов остается актуальным, нам представлялось важным на модели введения мышам ЦФ изучить способность АСГ модифицировать побочные реакции цитостатиков.
Целью исследования было изучение влияния АСГ на слизистую оболочку желудочно-кишечного тракта и структуру органов иммунной системы мышей при пероральном введении, а также определение способности препарата изменять токсическое воздействие ЦФ на эти органы.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Животные
Исследование проведено на 70 половозрелых (2месячного возраста) самцах конвенциональных мышей-гибридов (CBAx C57Bl) F1, массой тела 20-22 г, разводки питомника РАМН «Крюково». Животные получали стандартный гранулированный корм и воду ad libitum. Опыты проводили в соответствии с правилами этической группы ГУ НИИ по изысканию новых антибиотиков им. Г. Ф. Гаузе РАМН.
Препараты
АСГ синтезирован в Институте по изысканию новых антибиотиков РАМН профессором М. Н. Преображенской и сотр. [18, 20]. Синтетический продукт по данным ЯМР, ВЭЖХ и ТСХ полностью идентичен природному [3]. Субстанцию АСГ растворяли в дистиллированной воде и в 1% концентрации вводили в желудок при помощи шприца с металлической канюлей.
В работе использован коммерческий препарат ЦФ для инъекций. Перед введением ЦФ растворяли в физиологическом растворе и в 0,1% концентрации вводили однократно внутрибрюшинно (в/бр) в дозе 200 мг/кг (доза, близкая к максимально переносимой).
Методика эксперимента
Было проведено 2 серии экспериментов. В 1-й серии животные получали АСГ в разовых дозах 10, 50 и 100 мг/кг в желудок в течение 7 и 14 дней. Группы содержали по 5 животных, которых забивали по окончании курса введений. Во 2-й серии экспериментов изучались влияние АСГ на морфологические проявления кишечной токсичности ЦФ и его повреждающее действие на органы иммунной системы. АСГ вводили в разовой дозе 100 мг/кг ежедневно в течение 14 дней. Животные были разделены на 5 групп по 8 мышей в каждой, получавших АСГ и его комбинации с ЦФ в следующих режимах: 1) АСГ, забой на 1-е и 8-е сутки по окончании курса введений препарата; 2) ЦФ, через 24 ч АСГ, забой на 1-е сутки по окончании введений АСГ; 3) АСГ, на следующие сутки ЦФ, забой на 8-е сутки после курса введений АСГ; 4) ЦФ, забой на 8-е и 15-е сутки после введения; 5) интакт-ный контроль.
Для гистологического исследования брали участки подвздошного отдела тонкой кишки, тимус, селезенку, паховый лимфатический узел. Органы фиксировали в 10% растворе нейтрального формалина, по стандартной методике заливали в парафин, короткие серии срезов окрашивали гематоксилин-эозином. Оценку морфологических изменений производили с помощью светового микроскопа OLYMPUS BX41 (Япония). Фотографии выполнены цифровой фотокамерой OLYMPUS Camedia C3030 (Япония).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Микроскопическое исследование показало, что применение АСГ в разовых дозах 10 и 50 мг/кг в течение как 7, так и 14 дней не оказывает влияния на структуру слизистой оболочки желудочно-кишечного тракта и лимфоидных органов. При использовании АСГ в разовой дозе 100 мг/кг в течение 14 дней в слизистой оболочке тонкой кишки было найдено резкое увеличение числа клеток Панета, а также количества и размеров эозинофильных гранул в них (рис. 1 и 2). Просвет крипт был расширен и заполнен гранулами, выделившимися из клеток. В области ворсинок кишечного эпителия увеличивалось содержание бокаловидных клеток. В собственной пластинке слизистой оболочки тонкой кишки было выявлено разрастание капиллярной сети по типу развития молодой грануляционной ткани. Отмечено также увеличение количества интраэпителиальных лимфоцитов.
Рис. 1. Тонкая кишка мыши, интактный контроль. Клетки Панета расположены в области дна крипты. Об. х 100:
1 — крипта железы; 3 — шейка железы; 5 — клетки Панета; 6 — гранулы клеток Панета
Рис. 2. Тонкая кишка мыши, первые сутки после курса введений АСГ. Клетки Панета выполняют всю крипту до шейки железы. Количество гранул в них резко увеличено. Об. х 100:
1 — крипта железы; 3 — шейка железы; 5 — клетки Панета; 6 — гранулы клеток Панета
Из исследованных органов иммунной системы на 14-кратное введение АСГ отреагировали селезенка и лимфатические узлы. В селезенке количество очагов экстрамедуллярного кроветворения значительно увеличилось по сравнению с контролем. В лимфатических узлах на 1-е сутки после курса появились центры размножения в лимфоидных фолликулах. Через неделю после окончания введений структура лимфатических узлов не отличалась от контроля.
На 8-е сутки после введения ЦФ в тонкой кишке мышей в зонах повреждения слизистой оболочки ворсинки либо отсутствовали, либо была восстановлена только их строма, просвет крипт расширен, собственная пластинка слизистой оболочки резко отечна. Часть клеток Панета находилась в состоянии деструкции, другие — в состоянии вакуольной дистрофии. В просвете крипт — множество крупных, интенсивно эозинофильных гранул клеток Панета. На 15-е сутки после введения ЦФ признаки повреждения слизистой оболочки сохранялись (рис. 3). В зонах повреждения количество клеток Панета было резко увеличено. Они были заполнены множеством гранул. В зонах регенерации, которые встречались наряду с очагами деструкции, уровень клеток Панета не отличался от нормы. Они содержали небольшое количество мелких эозинофильных гранул.
Рис. 3. Тонкая кишка мыши, 15-е сутки после введения ЦФ. Частичная регенерация ворсинок слизистой оболочки. Группы клеток в криптах в состоянии деструкции. Об. х40:
1 — крипты желез; 2 — ворсинки желез; 3 — шейка железы; 4 — однослойный цилиндрический эпителий ворсинок
Введение АСГ в течение 2 нед. перед применением ЦФ не предотвращало повреждения слизистой оболочки тонкой кишки, но вызывало некоторое увеличение количества клеток Панета в криптах желез и бокаловидных клеток в эпителии ворсин.
Введение АСГ после ЦФ приводило к практически полному восстановлению структуры ворсинок. Их повреждение выражалось лишь в наличии небольших очагов отека. На отдельных ворсинках в области вер-
хушки сохранялись зоны некроза цилиндрического эпителия (рис. 4). Клетки Панета по морфологическому строению и количеству не отличались от интактно-го контроля.
Рис. 4. Тонкая кишка мыши, 15-е сутки после введения ЦФ с последующим курсовым введением АСГ. Полное восстановление структуры желез слизистой оболочки. Об. х40:
1 — крипты желез; 2 — ворсинки желез; 3 — шейка железы; 4 — однослойный цилиндрический эпителий ворсинок
Как на 8-е, так и на 15-е сутки после введения ЦФ отмечены некоторое сужение корковой зоны и умеренная атрофия лимфоидной ткани корковой и мозговой зон тимуса, умеренная атрофия лимфоидной ткани корковой зоны лимфатических узлов и лимфоидной ткани селезенки.
У мышей, получивших АСГ после ЦФ, повреждающее действие последнего на лимфоидную ткань тимуса оказалось менее выраженным. На 15-е сутки после применения ЦФ была отмечена лишь небольшая атрофия лимфоидной ткани в мозговой зоне. Предварительное введение АСГ, по-видимому, сыграло защитную роль, т. к. на 8-е сутки после применения ЦФ структура тимуса не отличалась от контроля.
При применении АСГ как до, так и после ЦФ никаких признаков атрофии лимфоидной ткани селезенки и лимфатических узлов не выявлено.
Таким образом, АСГ ускорял репарацию лимфоидной ткани тимуса в случае его введения вслед за инъекцией ЦФ и предотвращал развитие атрофических изменений при его применении до ЦФ. Явления атрофии в селезенке и лимфатических узлах не возникали при введении АСГ как перед, так и после инъекции ЦФ.
Проведенные исследования показали, что перо-ральное введение АСГ приводит к увеличению количества и усилению активности (по морфологическим критериям) клеток Панета. Клетки Панета, или экзо-кринные энтероциты, или эпителиальные гранулоци-ты, — высокодифференцированные клетки. Они располагаются в основании кишечной крипты и выполняют барьерную функцию — функцию защиты
слизистой оболочки — посредством экзоцитоза крупных секреторных гранул, содержащих множество различных биологически активных веществ [15]. Среди них белки и пептиды, играющие важную роль в поддержании гомеостаза и в барьерной по отношению к микробам и токсинам функции кишечной стенки: ли-зоцим, обеспечивающий невосприимчивость кишки к бактериальной инфекции, антимикробные пептиды — дефенсины [9], ДНКаза 1 [21], фосфолипаза А2 [14], белок, богатый цистеином, основу которого составляет двойной цинк [8], ростовые факторы, стимулирующие рост и дифференцировку клеток [7].
Выявленные в данном исследовании увеличение количества и усиление активности клеток Панета, увеличение количества интраэпителиальных лимфоцитов, утолщение собственной пластинки слизистой оболочки и увеличение содержания слизеобразующих бокаловидных клеток позволяет предположить, что АСГ обладает способностью усиливать защитную функцию слизистой оболочки тонкой кишки. Его использование в комбинации с ЦФ приводило к значительному ослаблению кишечной токсичности цитостатика и более быстрому восстановлению повреждений слизистой оболочки тонкой кишки. Этот эффект, по-видимому, объясняется способностью АСГ активировать клетки Панета и бокаловидные клетки. Известно, что цитостатики повреждают в первую очередь пролиферирующие популяции клеток, а высокодифференцированные клетки, в данном случае клетки Панета и бокаловидные клетки, хотя и подвергаются патологическим изменениям [17], повреждаются в меньшей степени [22]. Это подтверждается данными литературы [11, 23], где было показано, что основной вклад в регенерацию слизистой оболочки тонкой кишки вносят именно эти два типа клеток.
Способность АСГ индуцировать появление центров размножения в лимфатических узлах указывает на наличие у него иммуномодулирующих свойств. При комбинированном применении АСГ с цитостатиком удалось предотвратить развитие атрофических изменений в органах иммунной системы.
По данным К. Мапёа и соавт. [12], 2-недельное предварительное введение мышам мелатонина, обладающего антиоксидантной активностью, предотвращало развитие окислительного стресса, индуцированного ЦФ. АСГ обладает антиоксидантной активностью [16], поэтому логично предположить, что предотвращение поражения лимфоидной ткани при предварительном введении мышам АСГ до инъекции ЦФ, может, по крайней мере частично, лежать в основе данного проявления защитной активности АСГ.
Таким образом, полученные результаты позволяют предположить, что применение АСГ усиливает барьерную функцию двух важнейших систем защиты организма, кишечника и лимфоидных органов, способствует ускоренному и более полному восстановлению повреждений, индуцированных ЦФ, либо препятствует развитию части из них при предварительном введении.
ВЫВОДЫ
1. АСГ вызывает увеличение количества и усиление активности клеток Панета.
2. АСГ инициирует процессы пролиферации в лимфатических узлах.
3. АСГ способствует более быстрому и полному восстановлению целости структур стенки тонкой кишки после применения ЦФ.
4. АСГ препятствует развитию атрофических изменений в лимфоидных органах при введении его как до, так и после ЦФ.
Полученные данные указывают на возможность использования АСГ в качестве модификатора гастроинтестинальной и иммунной токсичности цитостатиков.
ЛИТЕРАТУРА
1. Гершанович М. Л., Филов В. А., Акимов М. А., Акимов А. А. Введение в фармакотерапию злокачественных опухолей. — СПб.: Sotis, 1999. — 143 с.
2. Кравченко Л. В., Авренъева Л. И., Гусева Г. В. и др. Влияние пищевых индолов на активность ферментов метаболизма ксенобиотиков и токсичность Т-2 токсина для крыс // Бюлл. эксп. биол. мед. — 2001. — Т. 131. — С. 644-647.
3. Муханов В. И., Ярцева И. В., Кикотъ В. С. и др. Изучение аскорбигена и его производных // Биооргани-ческая химия. — 1984. — Т. 10, № 4-6. — С. 554-559.
4. Переводчикова Н.И. Противоопухолевая химиотерапия. — М., 1996. — 222 с.
5. Преображенская М. Н., Королев А. М. Индоль-ные соединения в овощах семейства крестоцветных // Биоорганическая химия. — 2000. — Т. 26, № 2. — С. 97-110.
6. Boyd J. N., Babish J. G., Stoewsand G. S. Modification by beet and cabbage diet of aflatoxin B-induced rat alfa-foetoprotein elevation, hepatic tumoro-genesis, and mutagenicity of urine // Food Chem. Toxic.
— 1982. — No. 2. — P. 47-50.
7. Bullow S., Skov O. P., Poulsen S. S., Kirkegaard P. Is epidermal growth factor involved in development of duodenal polyps in familial polyposis coli? // Am. J. Gastroenterol. — 1988. — Vol. 83. — P. 404-412.
8. Fernandes P. R., Samuelson D. A., Clark W. R., Cousins R. J. Immunohistochemical localization of cysteine-rich intestinal protein in rat small intestine // Am. J. Physiol. — 1997. — Vol. 272, No. 4. — P. 751-759.
9. Garabedian E. M., Roberts L. J. J., McNevin M. S., Gordon J. I. Examining the role of Paneth cells in the small intestine by lineage ablation in transgenic mice // J. Biol. Chem. — 1997. — Vol. 272, No. 38. — P. 23729-23740.
10. Graham S., Dayal H., Swanson M. et al. Diet in the epidemiology of cancer of the colon and rectum // J. Natl. Cancer Inst. — 1978. — No. 61. — P. 709-714.
11. Jeynes B. J., Altmann G. G. Light and scanning electron microscopic observations of the effects of sub-lethal doses of methotrexate on the rat small intestine // Anat. Rec. — 1978. — Vol. 191. — P. 1-17.
12. Manda K., Bhatia A. L. Prophylactic action of melatonin against cyclophosphamide-induced oxidative stress in mice // Cell Biol. Toxicol. — 2003. — Vol. 19, No. 6. — P. 367-372.
13. McDanell R., McLean A. E. M., Hanley A. B. et al. Chemical and biological properties of indole glucosino-lates (glucobrassicins): A Review // Food Chem. Toxicol.
— 1988. — No. 26. — P. 59-70.
14. Nevalainen T. J., Groenroos J. M., Kallajoki M. Expression of group II phospholipase A2 in the human gastrointestinal tract // Lab. Invest. — 1995. — Vol. 72, No. 2. — P. 201-208.
15. Ouellette A. J., SelstedM. E. Paneth cells defenses: Endogenous peptide components of intestinal host defense // FASEB J.. — 1996. — Vol. 10, No. 11. — P. 1280-1289.
16. Patil P. N., Preobrazhenskaya M. N., Bauer J. et al. Personal communication. — 2004.
17. Pinkerton C. R., Cameron C. H.,
Sloan J. M. Jejunal crypt cell abnormalities associated with methotrexate treatment in children with acute lymphoblastic leukaemia // J. Clin. Pathol. — 1982. — No. 35.
— P. 1272-1277.
18. Preobrazhenskaya M. N., Korolev A. M., Lazhko E. I. et al. Transformation of ascorbigen into 1-deoxy-1-(indol-3-yl)-a-L-sorbopyranose and 1-deoxy (indol-3-yl)-a-L-tagatopyranose // Tetrahedron Asymmetry. — 1996.
— No. 7. — P. 459-464.
19. Prochaska H., Santamaria A. B., Talalay P. Rapid detection of inducers of enzymes that protect against carcinogens // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. — 1992. — Vol. 89. — P. 2394-2398.
20. Reznikova M. I., Korolev A. M., Bodyagin D. A., Preobrazhenskaya M. N. Transformations of ascorbigen in vivo into ascorbigen acid and 1-deoxy-1-(indol-3-yl)ketoses // Food Chemistry. — 2000. — Vol. 71. — P. 469-474.
21. Shimada O., Ishikava H., Tosaka-Shimada H. et al. Detection of deoxyribonuclease I along the secretory pathway in Paneth cells of human small intestine // J. Histochem. Cytochem. — 1998. — Vol. 46, No. 7. — P. 833-840.
22. Verburg M., Renes I. B., Meijer H. P. et al. Selective sparing of goblet cells and Paneth cells in the intestine of methotrexate-treated rats // Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. — 2000. — Vol. 279. — P. 1037-1047.
23. Verburg M., Renes I. B., Van Nispen D. J. et al. Specific responses in rat small intestinal epithelial mRNA expression and protein levels during chemotherapeutic damage and regeneration // J. Histochem. Cytochem. — 2002. — Vol. 50. — P. 1525-1536.
1. Weitzman S. Alternative nutritional cancer therapies // Int. J. Cancer. — 1998. — No. 1. — P. 69-82.
