CC BY
70
РОЛЬ ИОНОВ ZN2+ В ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ ИЗМЕНЕНИЯХ СЛИЗИСТОЙ ОБОЛОЧКИ ДИСТАЛЬНОГО ОТДЕЛА ТОНКОГО КИШЕЧНИКА ПРИ ДЕЙСТВИИ ДИКЛОФЕНАКА
Гороховский Егор Юрьевич
преподаватель Запорожского национального университета,
Украина, г. Запорожье E-mail: yehor.horokhovskvi@gmail.com
ROLE OF ZN2 + IONS IN THE FUNCTIONAL CHANGES OF THE MUCOUS MEMBRANE OF THE DISTAL SMALL INTESTINE BY THE ACTION OF DICLOFENAC
Horokhovskiy Yehor
Lecturer, Zaporozhye National University,
Ukraine, Zaporozhye
АННОТАЦИЯ
Функциональные изменения слизистой оболочки дистального отдела тонкой кишки, сопровождающие воспалительную реакцию, индуцированную диклофенаком (снижение концентрации цинка в ткани кишечника, ульцерогенез, увеличение проницаемости эпителия, дисбаланс оксидантно-антиоксидантной системы, повышенная секреторная активность клеток Панета и дисбаланс микрофлоры), носят обратимый кратковременный характер. Модуляция трансмембранного транспорта ионов ионов Zn2+ при действии диклофенака приводит к значительно более выраженным и длительным изменениям слизистой оболочки дистального отдела тонкой кишки.
Гороховский Е.Ю. Роль ионов Zn2+ в функциональных изменениях слизистой оболочки дистального отдела тонкого кишечника при действии диклофенака //
Universum: Химия и биология : электрон. научн. журн. 2014. № 10-11 (10) .
URL: http://7universum.com/ru/nature/archive/item/1698
ABSTRACT
Functional changes of the mucous membrane of the distal small intestine, accompanying inflammatory reaction induced by diclofenac (decrease in the concentration of zinc in the intestinal tissue, ulcerogenesis, increasing the permeability of the epithelium, the imbalance of the oxidant-antioxidant system, increased secretory activity of Paneth cells and microflora imbalance) are short-term and reversible. Modulation of transmembrane transport of Zn2 + ions by the action of diclofenac leads to a much more pronounced and long-term changes of the mucous membrane of the distal small intestine.
Ключевые слова: ионы цинка, модуляция трансмембранного транспорта цинка, диклофенак, слизистая оболочка, тонкая кишка, воспаление.
Keywords: zinc ions, transmembrane modulation of zinc influx, diclofenac, mucous membrane, small intestine, inflammation.
Для большинства живых организмов цинк является незаменимым микроэлементом, а нарушения его обмена сопровождаются дисфункцией нервной, эндокринной и иммунной систем. За последние 30 лет однозначно доказано, что в клетках цинк выполняет функции антиоксиданта, стабилизатора органелл, антиапоптотического агента, кофактора синтеза ДНК, противовоспалительного агента, принципиально важного компонента процесса репарации тканей, неорганического регулятора сигнальных путей клеток, обеспечивает целостность эпителиальных барьеров слизистых оболочек [16, с. 3646; 24, с. 1110]. В свете этих данных изучение физиологических механизмов, благодаря которым ионы цинка принимают участие в обеспечении барьерной функции слизистой оболочки тонкой кишки, является актуальной научной проблемой. Действительно, характерным признаком воспалительных заболеваний кишечника является нарушение защитной функции его эпителиального барьера [15, с. 710; 23, с. 454], поэтому более глубокое понимание того, каким образом ионы цинка вовлечены
в механизмы реализации барьерной функции слизистой оболочки кишечника, может иметь в том числе и практическое значение для разработки новых стратегий диагностики и лечения этой группы заболеваний.
Целью работы являлось изучение влияния модуляции трансмембранного транспорта ионов цинка на функциональные изменения слизистой оболочки дистального отдела тонкого кишечника, сопровождающих воспалительную реакцию, индуцированную введением диклофенака.
Материалы и методы
Исследования проведены на нелинейных половозрелых крысах массой 180—220 г в количестве 300 особей. Животные были разделены на пять групп, по 60 особей в каждой: интактные животные (И), контрольные группы К1 и К2, экспериментальные группы Э1 и Э2. Животным группы К1 с целью модуляции трансмембранного транспорта цинка внутрибрюшинно вводили 10 % раствор натрия диэтилдитиокрабамата тригидрата (ДЭДТК) в дозе 1000 мг/кг [8, с. 141]; животным группы К2 с целью индукции воспалительного ответа в тонкой кишке подкожно вводили Диклофенак-Дарница (ДФ) в виде 2,5 % раствора в дозе 50 мг/кг [13, с. 1539]; животным группы Э1 вводили ДФ, 50 мг/кг и ДЭДТК, 400 мг/кг, а животным группы Э2 — ДФ, 50 мг/кг и ДЭДТК , 1000 мг/кг. Интактным животным внутрибрюшинно вводили физиологический раствор. Через 1, 3, 5 и 7 суток из каждой группы выводили по 15 животных, из которых 5 особей использовали для оценки барьерной функции кишечного эпителия и 10 особей — для исследования всех остальных показателей. Все манипуляции проводили с соблюдением принципов биоэтики и правил обращения с лабораторными животными [4, с. 76].
Оценку степени язвенных поражений слизистой оболочки кишки проводили путем измерения их площади на цифровых изображениях участка слизистой оболочки тонкой кишки длиной 10 см, результаты выражали как процентное соотношение площади поражений к 1 см2 площади слизистой оболочки [22, с. 366]. На цифровых изображениях микропрепаратов кишки,
окрашенных гематоксилин-эозином, измеряли длину и ширину ворсинок, глубину крипт, количество бокаловидных клеток и клеток Панета [1, с. 118].
Для оценки барьерной функции кишечного эпителия использовали метод, основанный на оценке количества адсорбированного слизистой оболочкой тонкой кишки витального красителя нигрозина [21, с. 39].
Для определения катионных белков в клетках Панета на гистологических срезах тонкого кишечника использовали модифицированный метод Шубича [10]. Для определения цинка гистологические срезы окрашивали 0,2 % водно-аммиачным раствором дитизона (ДТЗ) [3, с. 928]. Площадь окрашенных гранул измеряли на цифровых изображениях микропрепаратов с помощью программы ImageJ.
Определение концентрации цинка в органах и сыворотке крови проводили спектрофотометрически по методике Homsher [17, с. 1311]. Для определения активности миелопероксидазы использовали метод Бояркина [2, с. 41]. Активность супероксиддисмутазы (СОД) определяли по способности фермента ингибировать фотохимическое восстановление нитросинего тетразолия [9, с. 687]. Активность каталазы определяли по методу Королюка [5, с. 17]. Для определения нитрит-иона использовали метод, основанный на способности сульфаниловой кислоты и а-нафтиламина в присутствии азотистой кислоты образовывать интенсивно окрашенные диазоединения [6, с. 16].
Для бактериологического анализа состава микрофлоры соскобы поверхности слизистой оболочки кишки высевали на селективные среды: Эндо, Плоскирева, ВСА для определения патогенных энтеробактерий, желчносолевой агар и среда Сабуро для определение стафилококков; среда Эндо и цитрат Симмонса для определения кишечной палочки и условно-патогенных энтеробактерий; 5 % кровяной агар и среда ЭДДС для определение энтерококков; среда Блаурока для бифидобактерий и среда MRS для лактобациллл [11].
Статистическая обработка данных заключалась в использовании методов вариативной статистики (расчет среднего арифметического (М), стандартного
отклонения (SD)) и методов сравнения групп (непараметрический критерий Мана-Уитни). Расчеты проводили с использованием программы STATISTICA 6.1.
Результаты и их обсуждение
При оценке концентрации цинка в ткани подвздошной кишки и паренхиме печени (табл. 1) было установлено, что у животных группы К1 увеличение концентрации цинка в подвздошной кишке на 17 % (p<0,01) по сравнению с интактной группой происходило только в I сутки.
Таблица 1.
Концентрация цинка (M±SD) в паренхиме печени и в ткани
подвздошной кишки
Группа N Концентрация цинка, нмоль/г сырого веса
"кань тонкой кишки Паренхима печени
I сутки III сутки V сутки VII сутки I сутки III сутки V сутки VII сутки
I 40 328±31,6 332±49,7 316±36,4 327±35,3 227±18,0 220±19,6 219±24,8 237±14,3
К1 40 384±44,1 ** 338±36,7 315±34,0 302±48,7 253±14,5 ** 230±16,8 224±12,0 229±12,0
К2 40 232±30,1 *** 237±61,4 *** 298±30,0 358±57,8 329±25,5 *** 302±20,0 *** 255±10,7 ** 234±13,1
Э1 40 307±37,2 ## ++ 218±43,7 *** ### ++ 213±38,3 *** ### ++ 194±37,4 *** ### +++ 274±11,0 ** ## +++ 271±15,1 ** ## +++ 272±9,8 ** ### ++ 256±11,5 ** ## ++
Э2 40 337±59,9 # +++ 180±30,4 *** ### +++ $ 186±29,0 *** ### +++ 191±28,2 *** ### +++ 284±7,4 ** ### +++ $ 277±10,3 ** ### ++ 281±22,4 ** ### ++ 283±17,1 ** ### +++ $$
Условные обозначения: здесь и дальше — р<0,05; — р<0,01;
*** #
— р<<0,001 по сравнению с интактными животными; — по сравнению
с группой К1; + — по сравнению группой К2; $ — по сравнению с группой Э1.
У животных группы К2 наблюдалось снижение концентрации цинка на 41 % (p<0,001) в I и III сутки и повышение до контрольных значений на V—VII сутки. У животных групп Э1 и Э2 в I сутки значимых изменений сравнительно с интактной группой не наблюдалось. На III—VII сутки, наоборот, концентрация цинка в подвздошной кишке была в среднем на 52 % (p<0,001) для группы Э1 и на 84 % (p<0,001) — для группы Э2 ниже, чем в интактной. Значимые отличия между группой К2 и группами Э1 и Э2 наблюдались на протяжении всего исследования. В I сутки рассматриваемый показатель у животных группы Э1 превышал значения группы К2 на 55 %
(p<0,01), а группы Э2 — на 68 % (p<0,001), а В последующем концентрация цинка в подвздошной кишке была ниже, чем у группы К2: на III сутки на 9 % (p<0,01) и 24 % (p<0,001), на V сутки— на 29 % (p<0,01) и 38 % (p<0,001) и на VII сутки — на 46 % (p<0,001) и 47 % (p<0,001) соответственно для группы Э1 и Э2.
При определении концентрации цинка в паренхиме печени было установлено, что у животных группы К1 увеличение его концентрации происходит лишь в I сутки, поскольку в данное время данный показатель превышал значения интактной группы на 12 % (p<0,01).
У животных группы К2 максимальное повышение концентрации цинка в паренхиме печени наблюдалось в I и III сутки (на 45 % (p<0,001) и 40 % (p<0,001) соответственно), а с V суток начала снижаться, превышая в этот момент значения интактных крыс лишь на 16 % (p<0,01), и на VII сутки достигла нормы. У животных групп Э1 и Э2 концентрация цинка в печени в I сутки также повышалась (на 21 % (p<0,01) и 25 % (p<0,01) соответственно), но не достигала значений животных группы К2. Более того, повышенная концентрация цинка в паренхиме печени у животных этих групп сохранялась до VII суток включительно. По сравнению с животными группы К2 у крыс групп Э1 и Э2 также были выявленные существенные отличия: в I сутки рассматриваемый показатель был выше на 17 % (p<0,001) и 14% (p<0,001), а на III сутки — на 11 % (p<0,01) и 9 % (p<0,001) ниже, чем у животных группы К2. На V и VII сутки, наоборот, наблюдалось увеличение концентрации цинка в печени на 6 % (p<0,01) и 10 % (p<0,01) и 9 % (p<0,01) и 21 % (p<0,001) соответственно для группы Э1 и Э2.
Концентрация цинка в сыворотке крови животных (табл. 2) группы К1 в I сутки была существенно ниже, чем у интактных, составляя при этом лишь 64 % (p<0,001) от нормы, однако в дальнейшем не было выявлено значимых отличий между указанными группами.
У животных группы К2 временное снижение концентрации цинка на 43 % (p<0,001) и 35 % (p<0,001) было установлено лишь в I—III сутки. У животных
группы Э1 в I сутки рассматриваемый показатель, был на 42 % (p<0,001), а группы Э2 — на 54 % (p<0,001) ниже по сравнению с интактной группой. На III сутки концентрация цинка была меньше на 52 % (p<0,001) и 58 % (p<0,001), на V сутки — на 47 % (p<0,001) и 51 % (p<0,001) и на VII сутки — на 36 % (p<0,001) и 52 % (p<0,001) для групп Э1 и Э2 соответственно. Кроме этого, были выявлены отличия между контрольной группой К2 и группами Э1 и Э2. Так, концентрация цинка в сыворотке крови крыс групп Э1 на I—VII сутки была ниже, чем у животных группы К2 на 27 % (p<0,01), 48 % (p<0,001) и 40 % (p<0,001), а у животных группы Э2 на 21 % (p<0,05), 37 % (p<0,001), 53 % (p<0,001) и 56 % (p<0,001) соответственно.
Таблица 2.
Концентрация цинка (M±SD) в сыворотке крови
Группа N Концентрация цинка, мкмоль/л
I сутки III сутки V сутки VII сутки
I 40 12,7±1,40 12,1±1,35 11,1±1,42 10,8±1,20
К1 40 *** 8,1±0,71 11,2±1,12 10,5±1,12 10,8±1,30
К2 40 7,3±1,30 7,9±1,17 11,4±0,67 11,5±1,20
Э1 40 7,4±1,53 *** 5,8±1,26 ### ++ 5,9±1,36 ### +++ 6,9±0,83 *** ### +++
Э2 40 5,8±1,22 *** ### + $ 5,0±0,77 ### +++ 5,4±0,94 ### +++ 5 1±0 53 *** ### +++ $$$
Полученные результаты (снижение концентрации цинка в сыворотке крови и тонкой кишке и повышение — в паренхиме печени при остром воспалительном процессе) у животных группы К2 в целом подтверждаются рядом исследований обмена цинка при воспалительных заболеваниях [14, с. 6954]. У животных группы К1 модуляция трансмембранного транспорта цинка, осуществленная путем введения ДЭДТК в дозе 1000 мг/кг, по-видимому, вызвала перераспределение данного микроэлемента в организме, на что указывает увеличение его концентрации в подвздошной кишке и паренхиме печени и уменьшение — в сыворотке крови в I сутки исследования. Таким образом, модуляция трансмембранного транспорта цинка у животных групп Э1 и Э2 нарушает физиологические
механизмы перераспределения цинка в организме в самом начале индуцированной диклофенаком воспалительной реакции в тонкой кишке.
Оценка барьерной функции слизистой оболочки дистального отдела тонкой кишки. У животных группы К2 в I сутки наблюдалось увеличение абсорбции нигрозина в дистальном отделе тонкой кишки (табл. 3) на 38 % (p<0,01) и на III сутки — на 17 % (p<0,05); на V сутки этот показатель уже не отличался от интактной группы. В группе Э1 на I и III сутки количество абсорбированного кишечным эпителием нигрозина было больше на 75 % (p<0,01) и 51 % (p<0,01), а в группе Э2 — на 92 % (p<0,01) и в 2 раза (p<0,01) больше, чем у интактных животных. На V и VII сутки данный показатель для группы Э1 был больше, чем у интактной на 52 % (p<0,01) и 26 % (p<0,05), а для группы Э2 соответственно в 2 раза (p<0,01) и на 82 % (p<0,01) больше.
Таблица 3.
Количество нигрозина (M±SD), абсорбированного эпителием
тонкой кишки
Группа N Экстрагированный нигрозин, мкг/г сухого веса кишки
I сутки III сутки V сутки VII сутки
I 20 24,6±2,24 24,6±2,63 24,1± 1,18 25,3±2,52
К1 20 24,9±1,54 24,8±2,79 24,8±2,16 24,2±2,06
К2 20 ** 33,9±4,43 * 28,8±4,59 27,4±6,01 25,3±1,74
Э1 20 43,0±5,503**#+ 37,2±7,72**##+ 36,6±6,99**##++ 31,8±6,08*#+
Э2 20 47,2±6,775**##+ 49,3±5,86**##++$ 49,5±5,49**##++$ 46,1±5,23**##++$
Данные изменения свидетельствуют о том, что временное увеличение трансмембранного транспорта цинка в клетки кишечного эпителия при действии диклофенака приводит к более выраженному и продолжительному повреждению эпителиального барьера тонкой кишки, нежели при обычном действии диклофенака.
Выявленные нарушения барьерной функции слизистой оболочки тонкой кишки обусловлены степенью язвенных поражений слизистой оболочки тонкой кишки животных (табл. 4). У интактных крыс и у животных группы К1 наличие язв слизистой оболочки тонкой кишки на протяжении всего срока исследования
установлено не было. У животных групп К2 и Э1 и Э2 площадь язвенных поражений в I сутки составляла 7 %, 13 % и 17 % на 1 см поверхности, на III сутки значения этого показателя для указанных групп были равны 5 %, 11 % и 16 %, на V сутки — 3%, 10% и 14% соответственно. На VII сутки язвы определялись только у животных групп Э1 и Э2, при этом их площадь
л
соответственно составляла 6 % и 9 % на 1 см слизистой оболочки кишки. Важно заметить, что площадь язвенных поражений слизистой оболочки животных группы Э2 была большей, чем в группе Э2 на 28 % (p<0,05), 49 % (p<0,01), 40 % (p<0,01) и 45 % (p<0,01) соответственно для I—VII суток
исследования.
Таблица 4.
Относительная площадь язвенных поражений (M±SD) слизистой оболочки
дистального отдела тонкой кишки
Группа N 2 Площадь язвенных поражений %, см
I сутки III сутки V сутки VII сутки
I 40 — — — —
К1 40 — — — —
К2 40 6,8±2,82 5,5± 1,61 3,1±1,68 —
Э1 40 13,4±2,92++ 11,0±3,02++ 10,2± 1,70 + 6,5±0,97
Э2 40 17,2±3,75++$ 16,4±4,84++$$ 14,3± 1,88+++$$ 9,5±2,43$$
Поскольку одним из главных условий обеспечения барьерной функции кишечного эпителия является целостность слоя эпителиальных клеток [22; 23], можно утверждать, что именно язвенные поражения слизистой оболочки кишки обусловливают повышенную способность кишечного эпителия к абсорбции нигрозина у животных групп К2, Э1 и Э2. Степень этих поражений подтверждает то, что временное увеличение поступления цинка в клетки кишечного эпителия при воспалении, индуцированном диклофенаком, приводит к более выраженной и продолжительной дисфункции эпителиального барьера тонкой кишки.
Состояние оксидантно-антиоксидантной системы слизистой оболочки дистального отдела тонкой кишки. Активность миелопероксидазы (МПО)
(табл. 5) у крыс группы К1 только в I сутки исследования была ниже в 4,1 раза (p<0,001), чем у интактных, что может быть объяснено ингибирующим действием ДЭДТК на МПО [19]. У животных группы К2 активность МПО в I—VII сутки была повышенной в 2,7 раза (p<0,01), 2,1 раза (p<0,01), на 73 % (p<0,01) и 16 % (p<0,01) соответственно, то есть наблюдалась постепенная нормализация значений этого показателя.
У животных группы Э1 активность МПО в I сутки превышала показатели интактной группы на 96 % (p<0,001), у животных группы Э2 — на 18 % (p<0,05)). В дальнейшем (III-VII сутки ) у крыс групп Э1 и Э2 наоборот отмечалось повышение активности данного энзима в 3,9 (p<0,001) и 6,2 раза (p<0,001) соответственно.
Таблица 5.
Активность миелопероксидазы (M±SD) в гомогенатах ткани тонкой кишки
Группа N Активность миелопероксидазы, у.о./г сырого веса кишки
I сутки III сутки V сутки VII сутки
I 40 3,3±0,28 3,4±0,50 3,0±0,70 3,1±0,60
К1 40 0,8±0,11 3,2±0,64 3,4±0,67 3,1±0,44
К2 40 9,0±09,0,87*** 7,2±0,67*** 5,2± 0,67*** * 3,6± 0,52
Э1 40 6,5±1,29***###++ 13,5±1,86***###+++ 12,2±1,85***###+++ 12,2±2,25***###+++
Э2 40 ^ ^^*###+++$$$ 21 0±3 щ***###+++$$$ 19 4±2 х g***###+++$s$ 18 4±3 63***###+++$$$
Учитывая крайне агрессивные свойства продуктов МПО по отношению к клеткам, такая продолжительная ее активация у крыс групп Э1 и Э2 может быть причиной повреждений клеток эпителия тонкой кишки. Больше того, продолжительное увеличение активности МПО у животных групп Э1 и Э2 прямо указывает на выраженную лейкоцитарной инфильтрацию ткани тонкой кишки в течение всего исследования и свидетельствует о переходе острого воспалительного процесса в хроническую форму.
Концентрация нитритов в ткани тонкой кишки (табл. 6) у крыс группы К1 в I сутки исследования была ниже, чем у интактных животных, на 17 % (p<0,01), но в последующем отличий в указанных группах выявлено не было.
У животных группы К2 концентрация нитритов в I сутки увеличивалась в 2,2 раза (p<0,001), на III сутки превышала показатели интактных животных на 81 % (p<0,001), на V сутки была большей на 35 % (p<0,001) а на VII сутки — лишь на 15% (p<0,05).
У крыс группы Э1 в I сутки исследования концентрация нитритов в ткани тонкой кишки была большей, чем у интактных животных, на 58% (p<0,001), а у группы Э2 — лишь на 9% (p>0,05). На III сутки наблюдалось увеличение значений этого показателя в 3,7 и 4,5 раза (p<0,001) в обеих группах, и дальнейшего его снижения за весь срок исследования не происходило.
Таблица 6.
Концентрация нитритов (M±SD) в гомогенатах ткани тонкой кишки крыс
Группа животн ых N Концентрация нитритов, нмоль/г сырой массы кишки
I сутки III сутки V сутки VII сутки
I 40 13,8±1,33 14,4± 2,15 13,7±2,48 12,9±1,27
К1 40 ** 11,5±1,02 13,5±1,76 13,3±2,51 13,3±1,62
К2 40 29,8±2,29*** 26,1±3,96*** 18,5±2,51*** * 14,8 ±2,03
Э1 40 21,8±2,48*** ###+++ 50,5±2,34*** ### +++ 51,6±2,84*** ###+++ 51,1±2,18*** ### +++
Э2 40 54## +++$$$ 60 0±4 24*** ### +++ $$$ 62,0±5,49*** ###+++$$$ ^g***### +++$$$
Полученные результаты свидетельствуют о временной активации механизмов синтеза активных форм азота (АФА) у животных группы К2, которая происходит во время максимально выраженного воспалительного ответа, а в дальнейшие сроки генерации АФА постепенно снижается. У животных групп Э1 и Э2 уровень синтеза АФА хотя и был в I сутки ниже, чем у животных группы К2, однако в дальнейший срок значительно возрастал и удерживался на высоком уровне до конца исследования, что также подтверждает факт продолжительного воспалительного процесса в слизистой оболочке кишки у крыс обеих указанных групп.
Анализ показателей антиоксидантной системы кишки позволил установить наличие нарушений у животных групп К1, К2 и Э1, Э2, что подтверждается снижением активности супероксиддисмутазы (СОД) и каталазы (КАТ) (табл. 7).
У животных группы К1 в I сутки исследования наблюдалось уменьшение активности СОД на 38 % (p<0,001) и увеличение активности КАТ на 27 % (p<0,05). У животных группы К2 снижение активности СОД на 33 % (p<0,001) и КАТ на 24 % (p>0,05) в I—III сутки указывает на дисбаланс оксидантно-антиоксидантной системы слизистой оболочки тонкой кишки в ранние сроки исследования, однако на V—VII сутки активность вышеупомянутых энзимов нормализовалась. У животных групп Э1 и Э2 активность СОД была в среднем ниже в 2—2,3 раза (p<0,001), а КАТ — в 2— 3,7 раза (p<0,001) ниже по сравнению с интактной группой уже в I сутки и удерживалась на таком уровне на протяжении всего исследования.
Таблица 7.
Активность супероксиддисмутазы и каталазы (M±SD) в ткани тонкой кишки
Группа N Активность супероксиддисмутазы, усл. ед./мг протеина Активность каталазы, ммоль/мин/мг протеина
I сутки III сутки V сутки VII сутки I сутки III сутки V сутки VII сутки
I 40 1,22±0,15 1,16±0,07 1,23±0,17 1,18±0,09 0,29±0,09 0,31±0,04 0,29±0,07 0,33±0,09
К1 40 0,75±0,10 *** 1,22±0,11 1,23±0,07 1,15±0,10 0,37±0,04 * 0,31±0,075 0,31±0,03 0,29±0,08
К2 40 0,82±0,15 *** 0,96±0,11 *** 1,01±0,13 *** 1,33±0,11 ** 0,23±0,06 0,24±0,03 ** 0,21±0,09 0,30±0,03
Э1 40 0,60±0,08 *** ## ++ 0,63±0,10 *** ### +++ 0,62±0,14 ***### ++ 0,72±0,13 *** ### +++ 0,18±0,04 ** ### + 0,15±0,05 *** ### ++ 0,14±0,06 *** ### 0,15±0,07 *** ## +++
Э2 40 0,52±0,06 *** ### ++$ 0,47±0,11 *** ### 0,49±0,13 *** ### +++$ 0,48±0,13 *** ### +++$$ 0,13±0,04 *** ### ++ 0,12±0,06 *** ### +++ 0,11±0,04 *** ### + 0,09±0,04 *** ### +++ $$$
Острое воспаление — это защитный механизм тканей организма, направленный против эндогенных и экзогенных антигенов, а хроническое воспаление — это продолжительное патологическое состояние, которое на клеточном уровне совершает ряд негативных эффектов, главным образом путем синтеза свободных радикалов и истощения резервов антиоксидантных систем [20, с. 39]. Тот факт, что в отличие от животных группы К2, у которых снижение активности антиоксидантных энзимов носило временный характер, животные групп Э1 и Э2 характеризовались снижением активности СОД и КАТ на протяжении всего исследования, указывает, во-первых, на высокий уровень
генерации АФК и АФА, а во-вторых, снова подтверждает факт продолжительного воспаления ткани тонкой кишки у крыс обеих указанных групп.
Состав микрофлоры слизистой оболочки дистального отдела тонкой
кишки. Бактериологический анализ соскобов слизистой оболочки тонкой кишки (рис. 1) у животных группы К1 в I сутки исследования показал лишь количественные изменения состава микрофлоры: уменьшение logio КОЕ/г лактобацилл на 20 % (p<0,001), бифидобактерий на 14 % (p<0,001))
и увеличение log10 КОЕ/г кишечной палочки на 29 % (p<0,001) и энтерококка — почти в 2 раза (p<0,001)), что указывает на признаки нарушения механизмов поддержки оптимального состава кишечной микрофлоры.
Рисунок 1. Видовой состав микрофлоры тонкой кишки крыс в I сутки исследования (log10 КОЕ/г). А —группа К1, Б — группа К2, В — группа Э1,
Г — группа Э2. N = 10. Условные обозначения: 1 — Bifidobacterium spp,
2 — Lactobacillus spp, 3 — Escherichia coli, 4 — Enterococcus faecalis,
5 — Candida spp, 6 — Cronobacter (Enterobacter) sakazakii, 7 — Staphylococcus epidermidis, 8 — Streptococcus viridans, 9 — Acinetobacter haemolyticus
У животных группы К2 наблюдалось увеличение как logi0 КОЕ/г кишечной палочки в 11,5 (p<0,001) и энтерококка в 29,5 раза (p<0,001), так и бифидобактерий в 8,7 (p<0,001) и лактобацилл в 4, 5 раза (p<0,001)). Данное явление можно рассматривать как компенсаторный эффект со стороны бактерий-симбионтов в ответ на воспаление ткани тонкой кишки, течение которого происходит при адекватной активации физиологических механизмов местной антибактериальной защиты [12].
У животных групп Э1 и Э2 был выявлен грубый дисбаланс кишечной микрофлоры. Так, log10 КОЕ/г бифидобактерий снизился в 2,7 (p<0,001) и 20,3 (p<0,001) лактобацилл в 7,8 (p<0,001) и 140 (p<0,001) раз кишечной палочки и энтерококка, наоборот, возрос в 17,6 p<0,001) и 21 (p<0,001) и 29 (p<0,001) и 143 раза (p<0,001) соответственно для группы Э1 и Э2.
Появление условно-патогенной микрофлоры (Cronobacter (Enterobacter) sakazakii, Staphilococcus epidermidis, Staphilococcus viridans, Acinetobacter haemolyticus) прямо свидетельствует о грубых нарушениях механизмов местной антимикробной защиты слизистой оболочки тонкой кишки у животных обеих рассматриваемых групп [18, с. 586].
Секреторная активность клеток Панета. У животных группы К1 через 24 часа после введения ДЭДТК определялось существенное снижение содержания катионных белков и цинка в секреторных гранулах клеток Панета (табл. 8).
Таблица 8.
Площадь секреторных гранул клеток Панета (M±SD), окрашенных дитизоном и бромфеноловым синим
с Q. Я и В N Площадь секреторных гранул, мкм2
Окраска дитизоном Окраска бромфеноловым синим
I сутки III сутки V сутки VII сутки I сутки III сутки V сутки VII сутки
I 40 80,1±3,63 81,4±5,79 79,4±5,51 84,3±4,33 80,1±9,43 81,4±7,15 79,4±6,99 84,3±7,65
К1 40 13,6±2,03 *** 76,0±7,00 * 77,6±6,04 83,9±3,30 13,6±2,93 *** 76,0±7,00 *** 77,6±6,00 * 83,9±5,45
К2 40 45,5±3,61 *** 53,3±2,66 *** 71,7±3,52 * 84,7±2,32 45,5±4,11 *** 53,3±3,82 *** 71,7±6,90 84,7±3,69
Э1 40 26,1±3,54 ***###+++ 25,8±2,64 ***###+++ 25,6±3,15 ***###+++ 31,1±3,48 ***###+++ 26,1±4,04 ***###+++ 25,8±3,30 ***###+++ 25,6±2,58 ***###+++ 31,1±3,46 ***###+++
Э2 40 10,8±4,83 ***#+++$$$ 20,0±2,80 ***###+++$$ 18,8±2,27 ***###+++$$$ 19,8±3,47 ***###+++$$$ 10,8±1,96 ***#+++$$$ 20,0±3,70 ***###+++$$$ 18,8±1,85 ***###+++ 19,8±2,32 ***###+++$$$
Об этом свидетельствует уменьшение площади гранул, окрашенных ДТЗ, на 83 % (р<0,001), а БФС — на 69 % (р<0,001). На III сутки площадь гранул, окрашенных ДТЗ, в этой группе животных была на 7 % (р<0,05), а окрашенных БФС — на 13 % (р<0,001) ниже, чем в интактных, а на V сутки только лишь площадь гранул, окрашенных БФС, была меньшей на 7 % (р<0,05).
У животных группы К2 также наблюдалось уменьшение площади секреторных гранул. В I сутки этот показатель для гранул, окрашенных ДТЗ, был на 43 % (р<0,001), а БФС — на 36 % (р<0,001) меньшим, чем у интактных животных. На III сутки площадь гранул была меньше на 35 % (р<0,001) для ДТЗ и на 28 % (р<0,001) — для БФС. На V сутки площадь гранул постепенно увеличивалась, поскольку в данный период этот показатель для гранул, окрашенных ДТЗ, был на 10 % (р<0,05), а БФС на 6 % (р>0,05), а на VII сутки оба показатели не отличались от интактных животных.
У животных группы Э1 площадь секреторных гранул, окрашенных ДТЗ, была в I—VII сутки меньше на 67 % (р<0,001), 68 % (р<0,001), 68 % (р<0,001), 63 % (р<0,001), чем в интактной группе, а у животных группы Э2 соответственно на 87 % (р<0,001), 75 % (р<0,001), 76 % (р<0,001), 77 % (р<0,001) меньше. Для площади гранул, окрашенных БФС, в I—VII сутки были получены следующие результаты: для группы Э1 на 59 % (р<0,001), 64 % (р<0,001), 66 % (р<0,001), 49 % (р<0,001), а для группы Э2 — на 73 % (р<0,001), 68 % (р<0,001), 68 % (р<0,001) и 69 % (р<0,001) меньше, чем у интактных животных.
Повышенная на протяжении всего срока исследования секреторная активность клеток Панета у животных групп Э1 и Э2, вероятно, обусловлена большею тяжестью поражений эпителиального барьера тонкой кишки, а также может быть связана со значительными изменениями состава кишечной микрофлоры.
Выводы
Модуляция трансмембранного транспорта цинка при введении диклофенака существенно изменяет течение воспалительной реакции в слизистой оболочке дистального отдела тонкого кишечника:
1. блокирует изменение концентрации цинка в тонкой кишке в первые сутки после индукции воспаления;
2. приводит к более выраженному ульцерогенезу и более продолжительному увеличению проницаемости кишечного эпителия;
3. приводит к дисбалансу оксидантно-антиоксидантной системы тонкой кишки (высокой активности миелопероксидазы, увеличенной концентрации нитритов и низкой активности супероксиддисмутазы и каталазы) в течение всего срока исследования;
4. сопровождается выраженными дисбиотическими изменениями состава
микрофлоры тонкой кишки и появлением условно-патогенных
микроорганизмов;
5. обусловливает значительное и продолжительное повышение секреторной активности клеток Панета.
Список литературы:
1. Автандилов Г.Г. Введение в количественную патологическую
морфологию. — М.: Медицина, 1980. — 216 с.
2. Ермаков А.И., Арасимович В.В., Ярош Н.П. Методы биохимического исследования растений. — Л.: Агропромиздат, 1987. — C. 41—45.
3. Ещенко В.А. Гистохимическое исследование цинка // Цитология. — 1978. — № 8. — с. 927—933.
4. Кополадзе Р.А. Регламентация экспериментов на животных — этика, законодательства, альтернативы // Успехи физиологических наук. — 1998. — Т. 29. — № 4. — с. 74—89.
5. Королюк М.А., Иванова Л.И., Майорова И.Г. и др. Метод определения активности каталазы // Лаб. дело. — 1988. — № 1. — с. 16—19.
6. Метельская В.А., Гуманова Н.Г. Скрининг-метод определения уровня метаболитов оксида азота в сыворотке крови // Клиническая лабораторная диагностика. — 2005. — № 6. — с. 15—18.
7. Методы биохимического анализа растений / под ред. В.В. Полевой, Г.Б. Максимова. — Л.: изд-во Ленингр. ун-та. — 1978. — 192 с.
8. Новицкий В.В. Ещенко Ю.В., Бовт В.Д. и др. Содержание цинка в клетках Панета и предстательной железы при действии хелатирующих и стрессовых факторов // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. — 2011. —№ 8. — С. 140—143.
9. Полесская О.Г., Каширина Е.И., Алехина Н.Д. Изменение активности антиоксидантных ферментов в листьях и корнях пшеницы в зависимости от формы и дозы азота в среде // Физиология растений. — 2004. — Т. 51. — с. 686—691.
10. Способ определения катионных белков в клетках : пат. 65514 Украина. № u200701472 ; заявл. 12.02.11 ; опубл. 27.08.07, Бюл. № 13. — 3 с.
11. Эпштейн-Литвак Р.В. Бактериологическая диагностика дисбактериоза кишечника : методические рекомендации. — М., 1977. — 20 с.
12. Янковский Д.С. Микробная экология человека: современные возможности ее поддержания и восстановления. — К.: Эксперт ЛТД, 2005. — 362 с.
13. Atchison C.R., West A.B., Balakumaran A. Drug enterocyte adducts: Possible causal factor for diclofenac enteropathy in rats // Gastroenterology. — 2000. — V. 119. — № 6. — P. 1537—1547.
14. Cousins R.J., Blanchard R.K., Popp M.P. A global view of the selectivity of zinc deprivation and excess on genes expressed in human THP-1 mononuclear cells // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. — 2003. — V. 100. — № 12. — P. 6952—6957.
15. Economou M., Pappas G. New global map of Crohn's disease: Genetic, environmental, and socioeconomic correlations // Inflamm. Bowel Dis. — 2008. — V. 14. — № 5. — P. 709—720.
16. Fukada T., Civic N., Furuichi T. The zinc transporter SLC39A13/ZIP13 is required for connective tissue development; its involvement in BMP/TGF-beta signaling pathways // PLoS One. —2008. — V. 3. — № 11. — P. 3642—3648.
17. Homsher R., Zak B. Spectrophotometric investigation of sensitive complexing agents for the determinationof zinc in serum // Clin. chem. — 1985. — V. 31. — № 8. — Р. 1310—1313.
18. Hunter C.J. Singamsetty V.K., Chokshi N.K. Enterobacter sakazakii enhances epithelial cell injury by indusing apoptosis in a rat model of necrotizing enterocolotis // J. Inf. Dis. — 2008. — V. 198. — № 4. — P. 586—593.
19. Izumi Y., Ogino K., Murata T. Effects of diethyldithiocarbamate on activating mechanisms of neutrophils // Pharmacol. Toxicol. —1994. — V. 74. — № 4—5. — P. 280—286.
20. Khansari N., Shakiba Y., Mahmoudi M. Chronic Inflammation and Oxidative Stress as a Major Cause of Age-Related Diseases and Cancer // Recent Pat. Inflamm. Allergy Drug Discov. — V. 3. — № 1. — Р. 73—80.
21. Lange S., Delbro D.S., Jennische E. Evans blue permeation of intestinal mucosa in the rat // Scand. J. Gastroenterol. — 1994. — V. 29. — № 1. — P. 38—46.
22. Stadnickia R., Sartorc B., Janardhamc R. Kallikrein-kininogen system activation and bradykinin (B2) receptors in indomethacin induced enterocolitis in genetically susceptible Lewis rats // Gut. — 1998. — V. 43. — P. 365—374.
23. Teitelbaum A.A., Gareau M.G., Jury J. Chronic peripheral administration of corticotropin-releasing factor causes colonic barrier dysfunction similar to psychological stress // Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. — 2008. — V. 295. — P. 452—459.
24. Zhou H., Zhang T., Harmon J.S. Zinc, Not Insulin, Regulates the Rat a-Cell Response to Hypoglycemia In Vivo // Diabetes. — 2007. — V. 56. — № 4. — P. 1107—1112.
