CC BY
92023, т. 13, № 1
КРЫМСКИЙ ЖУРНАЛ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ И КЛИНИЧЕСКОЙ МЕДИЦИНЫ
УДК 615.849.12 DOI: 10.29039/2224-6444-2023-13-1-46-49
ПРОЛИФЕРАТИВНО-АПОПТОТИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ЭПИТЕЛИОЦИТОВ ТОЛСТОЙ КИШКИ ПОСЛЕ ОБЛУЧЕНИЯ ЭЛЕКТРОНАМИ В ДОЗЕ 2 ГР
Саакян С. В.1, Шаповалова Е. Ю.1, Каракаева Э. Б-Г.1, Зорин И. А.2
'Институт «Медицинская академия имени С. И. Георгиевского» ФГАОУ ВО «Крымский- федеральный университет имени В. И. Вернадского», 295051, бульвар Ленина, 5/7, Симферополь, Россия
2ФГАОУ ВО «Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова (Сеченовский Университет), 119048, ул. Трубецкая, 8 стр.2, Москва, Россия
Для корреспонденции: Шаповалова Елена Юрьевна, д.м.н., профессор, зав. кафедрой гистологии и эмбриологии, Институт «Медицинская академия имени С. И. Георгиевского» ФГАОУ ВО «КФУ им. В. И. Вернадского», e-mail: Shapovalova_L@mail.ru
For correspondence: Shapovalova Yelena Yur'evna, MD, Professor, Head of the Department of Histology and Embryology, Institute «Medical Academy named after S. I. Georgievsky» of Vernadsky CFU, e-mail: Shapovalova_L@ mail.ru
Information about authors:
Saakian S. V., https://orcid.org/0000-0001-8606-8716 Shapovalova E. Y., http://orcid.org/0000-0003-2544-7696 Karakaeva E. B-G., https://orcid.org/0000-0001-9833-3433 Zorin I. A., https://orcid.org/0000-0002-1621-7015
РЕЗЮМЕ
Развитие и усовершенствование методов мультимодальной диагностики и лечения злокачественных новообразований позволило значительно продлить срок жизни у онкологических пациентов; таким образом вопрос предотвращения и коррекции побочных эффектов противоопухолевой терапии стало одной из основных проблем при оказании онкологической помощи в последние несколько десятилетий. Одним из наиболее радиочувствительных органов является кишечник. На сегодняшний день в работах различных авторов описаны эффекты облучения на здоровые ткани кишечника при использовании других методов излучения. В то же время информации о влиянии облучения электронами на структуры толстой кишки недостаточно: молекулярные механизмы пролиферативно-апоптотических процессов остаются неизученными и требуют значительного дополнения. Цель исследования - иммуногистохимическая оценка апоптоза и пролиферации эпителия толстой кишки после локального облучения электронами в дозе 2 Гр. Материалы и методы. Фрагменты толстой кишки половозрелых крыс линии Вистар (n=30) двух групп: I - контрольная (n=10); II - опытная группа (n=20; локальное однократное облучение электронами в дозе 2 Гр) исследовали методом световой микроскопии, используя окрашивание гематоксилином и эозином и иммуногистохимические реакции с антителами к Ki-67 и Cas3. Результаты. На 1 сутки количество каспаза-3-позитивных эпителиоцитов было увеличено в 1,33 раза по сравнению с контрольными значениями (44.61 ±3.68% против 33.48±2.35%). Пролиферативный индекс (Ki-67) через 24 часа после эксперимента был в 1.36 раза ниже в опытной группе, чем в контрольной (36.14±3.16% против 49.27±4.53%). На 3 сутки количество каспаза-3- и Ki-67-позитивных эпителиоцитов толстой кишки приблизились к контрольным значениям. Заключение. При локальном облучении электронами толстой кишки в дозе 2 Гр отмечается редукция эпителиоцитов на первых сутках с последующим восстановлением на третьих сутках.
Ключевые слова: радиотерапия, электроны, облучение, каспаза-3, Ki-67
PROLIFERATIVE-APOPTOTIC FEATURES OF COLONIC EPITHELIOCYTES AFTER IRRADIATED WITH ELECTRONS AT A DOSE OF 2 GY
Saakian S. V.1, Shapovalova E. Y.1, Karakaeva E. B-G.1, Zorin I. A.3
'Institution «Medical Academy named after S.I. Georgievsky» of Vernadsky CFU, Simferopol, Russia 2I. M. Sechenov First Moscow State Medical University (Sechenov University), Moscow, Russia
SUMMARY
The development and improvement of multimodal diagnosis and treatment of malignant neoplasms has significantly prolonged the life span of cancer patients; thus, the issue of prevention and correction of the side effects of antitumor therapy has become one of the main problems in cancer care over the past few decades. One of the most radiosensitive organs is the intestine. To date, the effects of radiation on healthy bowel tissue have been described in the works of various authors when other radiation methods are used. At the same time, the information on the effect of ionizing radiation on lower sections of the gastrointestinal tract is insufficient: the molecular mechanisms of proliferative-apoptotic processes remain unstudied and require significant supplementation. The aim of the investigation was immunohistochemical estimation of colon epithelium apoptosis and proliferation after local electron irradiation in dose 2 Gy. Materials and methods. Animals - sexually mature Wistar rats (n=30) were divided into two groups: I -
control (n=10); II - experimental group (n=20), local single electron irradiation at a dose of 2 Gy. Immunohistochemical method and hematoxylin and eosin staining were used to study colon fragments. Results. On day 1, the number of caspase-3 positive cells was 1.33 times higher than the control values (44.61 ±3.68% vs. 33.48±2.35%). The proliferative index (Ki-67) 24 hours after the experiment was 1.36 times lower in the experimental group than in the control group (36.14±3.16% vs. 49.27±4.53%). On day 3, the number of caspase-3- and Ki-67-positive cells approached the control values. Conclusion. Under local electron irradiation of the colon at the dose of 2 Gy, there was a reduction of epithelial cells on the 1st day, with a subsequent recovery on the 3rd day.
Key words: radiotherapy, electrons, irradiation, caspase-3, Ki-67
Развитие и усовершенствование методов мультимодальной диагностики и лечения злокачественных новообразований позволило значительно продлить срок жизни у онкологических пациентов; таким образом, вопрос предотвращения и коррекции побочных эффектов противоопухолевой терапии стало одной из основных проблем при оказании онкологической помощи в последние несколько десятилетий [1; 2]. На сегодняшний день больше половины всех пациентов со злокачественными новообразованиями на одном из этапов лечения сталкиваются с радиационной терапией. Наиболее распространенной остается экстракорпальная тазовая лучевая терапия (ЭТЛТ), которая используется при неоплазиях желудочно-кишечной и мочеполовой системы. ЭТЛТ может применяться в качестве неоадъювантной терапии перед хирургическим вмешательством, совместно с химиотерапией или являться самостоятельным методом терапии [3]. Однако облучение оказывает цитотоксическое действие не только на клетки опухоли, но и на окружающие здоровые ткани. Радиационная терапия характеризуется прямым действием на клеточную ДНК, за счет чего происходит необратимое нарушение структуры генетического материала и происходит гибель клетки, и опосредованным действием за счет ионизации внутриклеточных молекул [4].
Одним из наиболее радиочувствительных органов является кишечник [5]. Во-первых, из-за большой протяженности органа, возможны обширные участки повреждения. Во-вторых, эпителий кишечника является одной из наиболее активно делящихся и часто обновляемых тканей организма. Как известно, именно стволовые клетки наиболее уязвимы для воздействия радиационной терапии, за счет своей высокой митотической активности [6; 7].
Учитывая распространенность лучевой терапии брюшной и тазовой областей и уязвимость кишечника, радиационно-индуцированные травмы кишечника являются одним из наиболее распространенных осложнением в повседневной практике. Особенно поражение нижних отделов желудочно-кишечного тракта - постлучевой колит [8].
Одним из новейших методов лучевой терапии является ионизирующее облучение электро-
нами. На сегодняшний день в работах ряда авторов описаны эффекты облучения на здоровые ткани кишечника при использовании других методов излучения. В то же время информации о влиянии ионизирующего излучения на нижние отделы желудочно-кишечного тракта недостаточно: молекулярные механизмы пролифератив-но-апоптотических процессов остаются неизученными и требуют значительного дополнения.
Цель исследования - иммуногистохимиче-ская оценка апоптоза и пролиферации эпителия толстой кишки после локального облучения электронами в дозе 2 Гр.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
Животные - половозрелые крысы линии Ви-стар (n=30) были поделены на две группы: I -контрольная (n=10); II - опытная группа (n=20), локальное однократное облучение электронами в дозе 2 Гр.
Облучение животных проводили в отделе радиационной биофизики МРНЦ имени А.Ф. Цыба (г. Обнинск, Россия) на линейном акселераторе "NOVAC-11" (мощность дозы 1 Гр/мин, энергия 10 МэВ и частота 9 Гц, размер поля - 0 100 мм).
По половине животных из каждой группы выводили из эксперимента на 1 и 3 сутки.
Все манипуляции выполняли согласно «Международным рекомендациям по проведению медико-биологических исследований с использованием животных» (ЕЭС, Страсбург, 1985) и Хельсинской декларации Всемирной медицинской ассоциации.
Фрагменты толстой (ободочной) кишки фиксировали в забуференом формалине, заливали в парафиновые блоки, нарезали на микротоме толщиной 3 мкм, окрашивали гематоксилином и эозином. Микроскопический анализ выполняли с помощью системы видео-микроскопии (микроскоп Leica DM2000, Германия; камера Leica ICC50 HD).
Иммуногистохимическое исследование проводили по стандартному протоколу в автоматическом режиме в иммуногистостейнере BondMax («Leica», Германия). Первичные антитела: к каспаза-3 (Invitrogen/ Thermo Fisher Scientific; 74T2, 1:50) и Ki-67 (Abcam; ab15580, 1:100);
2023, т. 13, № 1
КРЫМСКИЙ ЖУРНАЛ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ И КЛИНИЧЕСКОЙ МЕДИЦИНЫ
вторичные - универсальные антитела (HiDef Detection™ HRP Polymer system, «Cell Marque». США). Количество иммунопозитивных клеток подсчитывали в 10 полях зрения, на увеличении х400. Для оценки индекса пролиферации на основе Ki-67 рассчитывали процент окрашенных клеток на одну крипту.
Полученные данные обрабатывали при помощи компьютерной программы SPSS 10.0 for Windows statistical software package (IBM Analytics, США) и вычислением средней арифметической, ошибки средней, критерия Стью-дента. Значимыми считали различия между средними показателями при p<0.05.
РЕЗУЛЬТАТЫ
При макроскопическом исследовании толстого кишечника опытной группы на первых и третьих сутках после локального однократного облучения электронами не выявили признаков воспалительного процесса, опухолевого роста, и деструктивных изменений.
При гистологическом исследовании микропрепаратов толстой кишки (ободочной) через 1 сутки наблюдали слабую редукцию бокаловидных клеток с тенденцией к восстановлению на 3 сутки. Количество эпителиоцитов толстой кишки с фигурами митоза на 3 сутки было увеличено по сравнению с 1 сутками.
При иммуногистохимическом исследовании изучали количество каспаза-3- и Ю-67-позитивных клеток.
На 1 сутки количество каспаза-3 позитивных клеток было увеличено в 1.33 раза по сравнению с контрольными значениями (44.61±3.68% против 33.48±2.35%). Пролифе-ративный индекс (Ю-67) через 24 часа после эксперимента был в 1,36 раза ниже в опытной группе, чем в контрольной (36.14±3.16% против 49.27±4.53%).
На 3 сутки количество каспаза-3- и Ю-67-позитивных клеток приблизились к контрольным значениям. Статистически значимой разницы не наблюдали, р<0.05 (табл. 1, рис. 1).
Таблица 1
Количество ИГХ-позитивных эпителиоцитов, в %, средняя ± стандартное отклонение
Маркер 2 Гр (II) Контроль (I)
1 сутки 3 сутки
каспаза-3 44.61±3.68a 33.97±3.96 33.48±2.35
Ki-67 36.14±3.16a 41.99±7.90 49.27±4.53
Примечание: аконтроль (I) и II группа; p <0.05
ОБСУЖДЕНИЕ
Настоящая работа посвящена исследованию эффектов локального облучения электронами в дозе 2 Гр на эпителий толстой кишки экспериментальных животных.
При гистологическом изучении образцов толстой кишки обнаружили признаки радиоци-онно-индуцированного повреждения, такие как редукция эпителиоцитов и слабая воспалительная инфильтрация. Стоит отметить, что такие изменения не являются клинически значимыми и не приводят к развитию кишечной недостаточности, однако являются чрезвычайно важными для понимания влияния ионизирующего излучения на эпителий толстой кишки [9]. Для более подробной характеристики клеточных процессов при облучении электронами мы исследовали уровень каспазы-3 и Ю-67.
При облучении электронами в дозе 2 Гр в эпителиоцитах толстой кишки отметили снижение каспаза-3 позитивных клеток. Такие результаты, по всей видимости, обусловлены цитоток-
сическим действием радиационного излучения, которые способны поражать не только клетки опухоли, но и здоровые ткани. Увеличение экспрессии каспазы-3 позволяет предположить механизм гибели энтероцитов толстого кишечника при остром лучевом повреждении: посредством запуска апоптотического каскада. Как известно, каскадный комплекс реализуется через внутренний и внешний путь, которые опосредованы и регулируются различными молекулами. Однако, каспаза-3 является терминальной эффекторной молекулой для обоих путей [10; 11].
Оценку пролиферативной и регенеративной способности проводили на основании митотиче-ского индекса, оцененного с помощью Ю-67. На 1 сутки после облучения митотический индекс снижался, однако уже на 3 сутки приближался к контрольным значениям. На основании полученных данных можно предположить, что облучение электронами в дозе 2 Гр не приводит к полному истощению пулу стволовых клеток и толстый кишечник может полностью восстановить свою функцию в кратчайшие сроки [12; 13].
Особенно стоит обратить внимание, что после локального облучения электронами в дозе 2 Гр на 3 сутки наблюдается практически полное восстановление эпителия толстой кишки и молекулярного гомеостаза. Известно, что увеличение экспрессии Ki-67 способно приводить к повышению числа митозов, и, как следствие, возможному развитию неоплазий [14]. В то же время чрезвычайно важно, чтобы количество каспаза-3 оставалось на оптимальном уровне для элиминации клеток с поврежденной ДНК [15; 16].
Таким образом, в настоящей работе мы выявили, что после однократного локального облучения электронами в дозе 2 Гр у экспериментальных животных отмечаются признаки радиационного поражения и запуск апоптотических процессов. Однако такие повреждения являются обратимыми за счет сохранения стволовых клеток и высокой митотической активности эпителия.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
При локальном облучении электронами толстой кишки в дозе 2 Гр отмечается редукция эпителиоцитов на 1 сутки с последующим восстановлением на 3 сутки.
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Conflict of interest. The authors have no conflict of interests to declare.
ЛИТЕРАТУРА / REFERENCES
1. Bentzen S. M. Preventing or reducing late side effects of radiation therapy: radiobiology meets molecular pathology. Nat Rev Cancer. 2006 Sep;6(9):702-13. doi: 10.1038/nrc1950.
2. Birgisson H., Páhlman L., Gunnarsson U., Glimelius B. Late adverse effects of radiation therapy for rectal cancer - a systematic overview. Acta Oncol. 2007 Jan 1;46(4):504-16. doi:10.1080/02841860701348670.
3. Bertholet J., Knopf A., Eiben B., McClelland J., Grimwood A., Harris E., Menten M., Poulsen P., Nguyen D. T., Keall P., Oelfke U. Real-time intrafraction motion monitoring in external beam radiotherapy. Phys Med Biol. 2019 Aug;64(15):15TR01. doi:10.1088/1361-6560/ ab2ba8.
4. Fiorino C., Valdagni R., Rancati T., Sanguineti G. Dose-volume effects for normal tissues in external radiotherapy: Pelvis. Radiother Oncol. 2009 Nov 1;93(2): 153-67. doi: 10.1016/j. radonc.2009.08.004.
5. Andreyev H. J. N. Gastrointestinal Problems after Pelvic Radiotherapy: the Past, the
Present and the Future. Clin Oncol. 2007 Dec 1;19(10):790-9. doi: 10.1016/j.clon.2007.08.011.
6. Lu L., Li W., Chen L., Su Q., Wang Y., Guo Z., Lu Y., Liu B., Qin S. Radiation-induced intestinal damage: latest molecular and clinical developments. Future Oncol. 2019 Dec;15(35):4105-18. doi:10.2217/fon-2019-0416.
7. McBride WH, Schaue D. Radiation-induced tissue damage and response. J Pathol. 2020;250(5):647-655. doi:10.1002/path.5389.
8. Ahmed M, Ahmed R. Radiation in Gastroenterology. Gastroenterol Res. 2022 Dec 17;15(6):285-96. doi:10.14740/gr1567.
9. Prieto S. P., Reed C. L., James H. M., Quinn K. P., Muldoon T. J. Differences in colonic crypt morphology of spontaneous and colitis-associated murine models via second harmonic generation imaging to quantify colon cancer development. BMC Cancer. 2019 May 9;19(1):428. doi:10.1186/ s12885-019-5639-8.
10. Brentnall M., Rodriguez-Menocal L., De Guevara R. L., Cepero E., Boise L. H. Caspase-9, caspase-3 and caspase-7 have distinct roles during intrinsic apoptosis. BMC Cell Biol. 2013 Jul 9;14(1):32. doi:10.1186/1471-2121-14-32.
11. Gu Q., Jiao S., Duan K., Wang Y. X., Petralia R. S., Li Z. The BAD-BAX-Caspase-3 Cascade Modulates Synaptic Vesicle Pools via Autophagy. J Neurosci Off J Soc Neurosci. 2021 Feb 10;41(6):1174-90. doi:10.1523/ JNEUROSCI.0969-20.2020.
12. Kanth P., Rajan T. Chromogranin A and Ki67 Marker in Normal Colon, Serrated Polyp and Colorectal Tubular Adenoma: 1470. Off J Am Coll Gastroenterol ACG. 2011 Oct;106:S562. doi:10.14309/00000434-201110002-01470.
13. Akedo I., Ishikawa H., Ioka T., Kaji I., Narahara H., Ishiguro S., Suzuki T., Otani T. Evaluation of epithelial cell proliferation rate in normal-appearing colonic mucosa as a high-risk marker for colorectal cancer. Cancer Epidemiol Biomark Prev Publ Am Assoc Cancer Res Cosponsored Am Soc Prev Oncol. 2001 Sep;10(9):925-30.
14. Andrés-Sánchez N., Fisher D., Krasinska L. Physiological functions and roles in cancer of the proliferation marker Ki-67. J Cell Sci. 2022 Jun 8;135(11):jcs258932. doi: 10.1242/jcs.258932.
15. Zhou M., Liu X., Li Z., Huang Q., Li F., Li C. Y. Caspase-3 regulates the migration, invasion and metastasis of colon cancer cells. Int J Cancer. 2018;143(4):921-930. doi: 10.1002/ijc.31374.
16. Olsson M., Zhivotovsky B. Caspases and cancer. Cell Death Differ. 2011 Sep;18(9):1441-9. doi:10.1038/cdd.2011.30.
