CC BY
4DOI: 10.24412/1999-6780-2023-3-27-36 УДК: 582.282.123.4:616.15:632.938
Для цитирования: Фролова Е.В., Шадривова О.В., Хостелиди С.Н., Филиппова Л.В., Учеваткина А.Е., Богомолова Т.С., Игнатьева С.М., Соловьева Г.И., Аак О.В., Десятик Е.А., Тен М., Борзова Ю.В., Тараскина А.Е., Васильева Н.В. Прогностическое значение показателей субпопуляционного состава лимфоцитов крови гематологических пациентов с инвазивным аспергиллезом легких, получающих полихимиотерапию. 2023; 25 (3): 27-36. DOI: 10.24412/1999-6780-2023-3-27-36
For citation: Frolova E.V., Shadrivova O.V., Khostelidi S.N., Filippova L.V., Uchevatkina A.E., Bogomolova T.S., Ignatieva S.M., Solovyova G.I., Aak O.V., Desyatik E.A, Ten M., Borzova Yu.V., Taraskina A.E., Vasilyeva N.V. Prognostic value of indicators of the subpopulation composition of blood lymphocytes of hematological patients with invasive pulmonary aspergillosis receiving polychemotherapy. 2023; 25 (3): 27-36. (In Russ). DOI: 10.24412/1999-6780-2023-3-27-36
ПРОГНОСТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ ПОКАЗАТЕЛЕЙ СУБПОПУЛЯЦИОННОГО СОСТАВА ЛИМФОЦИТОВ КРОВИ ГЕМАТОЛОГИЧЕСКИХ ПАЦИЕНТОВ С ИНВАЗИВНЫМ АСПЕРГИЛЛЕЗОМ ЛЕГКИХ, ПОЛУЧАЮЩИХ ПОЛИХИМИОТЕРАПИЮ
Фролова Е.В. (зав. лаб.)*, Шадривова О.В. (доцент), Хостелиди С.Н. (доцент), Филиппова Л.В. (с.н.с., доцент), Учеваткина А.Е. (с.н.с.), Богомолова Т.С. (зав. лаб.), Игнатьева С.М. (в.н.с.), Соловьева Г.И. (в.н.с.), Аак О.В. (в.н.с.), Десятик Е.А. (врач-миколог), Тен М. (зав. лаб. кафедры), Борзова Ю.В. (зав. клиникой, доцент), Тараскина А.Е. (зав. лаб.), Васильева Н.В. (директор института, зав. кафедрой)
Северо-Западный государственный медицинский университет им. И.И. Мечникова (кафедра клинической микологии, аллеоголоии и иммунологии; НИИ медицинской микологии им. П.Н. Кашкина), Санкт-Петербург, Россия
Инвазивный аспергиллез легких (ИАЛ) остается одной из ведущих причин заболеваемости и смертности у гематологических пациентов, получающих полихимиотерапию (ПХТ). На сегодняшний день существует потребность в поиске новых иммунологических маркеров для своевременной диагностики инвазивных плесневых инфекций и мониторинга эффективности лечения. Цель этого проспективного исследования состояла в определении прогностического значения показателей субпопуляцион-ного состава лимфоцитов крови больных ИАЛ в исходе инфекционного заболевания для поиска критериев определения длительности противогрибковой терапии.
В исследование включили 22 больных «вероятным» инвазивным аспергиллезом легких и 20 пациентов, у которых ИАЛ был исключен в ходе обследования. Контрольная группа состояла из 25 практически здоровых людей. Период наблюдения составил 6 месяцев. Проведено изучение субпопуляционного состава лимфоцитов и определение уровней иммуноглобулинов.
* Контактное лицо: Фролова Екатерина Васильевна, e-mail: ekaterina.frolova@szgmu.ru
У всех больных ИАЛ установлено достоверное снижение абсолютного количества СВ4+Т-хелперов на фоне повышения относительного числа CD4+CD25+CD127+ активированных Т-хелперов по отношению к показателям группы сравнения. Особенностью пациентов с неблагоприятным исходом ИАЛ было значимое снижение относительного и абсолютного числа NK-клеток, экспресси-рующих а-цепь CD8 (CD3-CD8+), по отношению к показателям группы сравнения. Отличием больных ИАЛ с благоприятным течением инфекционного процесса от пациентов с неблагоприятным исходом являлась положительная динамика абсолютного числа CD4+T-хелперов) цитоток-сических CDe+T-лимфоцитов, NKT-клеток. Важная роль CDÎCDS+NK-клеток в клиническом исходе грибковой инфекции подтверждается положительной корреляционной связью их числа с количеством CD4+T-клеток, цито-токсических CDS+T-клеток и CD3'CD56+NK-клеток.
Установлено, что низкое абсолютное число CD3' CDS+NK-клеток является прогностическим фактором, связанным с неблагоприятным клиническим исходом ИАЛ.
Ключевые слова: инвазивный аспергиллез легких, гематологические пациенты, естественные киллеры, прогностические факторы
PROGNOSTIC VALUE OF INDICATORS OF THE SUBPOPULATION COMPOSITION OF BLOOD LYMPHOCYTES OF HEMATOLOGICAL PATIENTS WITH INVASIVE PULMONARY ASPERGILLOSIS RECEIVING POLYCHEMOTHERAPY
Frolova E.V. (head of the laboratory), Shadrivova O.V. (associate professor), Khostelidi S.N. (associate professor), Filippova L.V. (senior scientific researcher, associate professor), Uchevatkina A.E. (senior scientific researcher), Bogomolova T.S. (head of the laboratory), Ignatieva S.M. (leading scientific researcher), Solovyova G.I. (leading scientific researcher), Aak O.V. (leading scientific researcher), Desyatik E.A. (physician-mycologist), Ten M. (head of the department's laboratory), Borzova Yu.V. (head of the clinic, associate professor), Taraskina A.E. (head of the laboratory), Vasilyeva N.V. (director of the Institute, head of the department)
North-Western State Medical University named after I.I. Mechnikov (Department of Clinical Mycology, Allergology and Immunology; Kashkin Research Institute of Medical Mycology, St. Petersburg, Russia
Invasive pulmonary aspergillosis (IPA) remains one of the leading causes of morbidity and mortality in hematological patients receiving polychemotherapy (PCT). To date, there is a need to search the new immunological markers for the timely diagnosis of invasive mold infections and monitoring the effectiveness of treatment. The purpose of this prospective study was to determine the prognostic value of indicators of the subpopulation composition of blood lymphocytes of patients with IPA in the outcome of an infectious disease to find criteria for determining the duration of antifungal therapy.
The study included 22 patients with "probable" invasive pulmonary aspergillosis and 20 patients in whom IPA was excluded during the examination. The control group consisted of 25 practically healthy people. The follow-up period was 6 months. The study of the subpopulation composition of lymphocytes and determination of immunoglobulin levels was carried out.
In all patients with IPA, a significant decrease in the absolute number of CD4+T-helpers was found against the background of an increase in the relative number of CD4+CD25+CD127+ activated T-helpers in relation to the indicators of the comparison group. A feature of patients with an unfavorable outcome of IPA was a significant decrease in the relative and absolute number of NK cells expressing the a-chain of the CD8 antigen (CD3-CD8+) in relation to the indicators of the comparison group. The difference between patients with IPA with a favorable course of the infectious process from patients with an unfavorable outcome was the positive dynamics of the absolute number of CD4+T-helpers, cytotoxic CD8+T-lymphocytes, NKT cells. The important role of CD3-CD8+NK cells in the clinical outcome of fungal infection is confirmed by a positive correlation between their number and the number of CD4+T cells, cytotoxic CD8+T cells and CD3-CD56+NK cells.
It was found that a low absolute number of CD3-CD8+NK cells is a prognostic factor associated with an unfavorable clinical outcome of IPA.
Key words: invasive pulmonary aspergillosis, hemato-logical patients, natural killers, prognostic factors
ВВЕДЕНИЕ
Особенностью грибов рода Aspergillus является небольшой размер конидий и способность существовать при температуре человеческого тела (термотолерантность), что позволяет микромицетам проникать в нижние отделы дыхательных путей и длительно сохраняться при температуре тела человека [1]. Инвазивный аспергиллез легких (ИАЛ) возникает у лиц с тяжелым иммунодефицитом, включая пациентов со злокачественными новообразованиями, реципиентов трансплантатов гемопоэтических стволовых клеток (ТГСК) и солидных органов, с нейтропенией или получающих химиотерапию и/или кортикостероиды [2]. В последнее время ИАЛ все чаще описывают у больных в критическом состоянии, находящихся в отделениях интенсивной
терапии с вирусным острым респираторным дистресс-синдромом (ОРДС) [3, 4]. Учитывая существующие трудности в диагностике, а также появление лекарственной устойчивости Aspergillus spp. и связанной с этими факторами высокой смертности от ИАЛ (30-68%), Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) внесла A. fumigatus в список приоритетных грибковых патогенов, причислив к группе критически важных для здравоохранения возбудителей [5]. Однако эффективность противогрибковой профилактики и терапии у пациентов групп высокого риска развития ИАЛ может быть значительно снижена вследствие нарушений иммунитета, возникновения резистентных штаммов микромицетов, а также токсичности и высокой стоимости противогрибковых препаратов [6]. В то же время нерациональная профилактика и терапия, проводимая без верификации диагноза, могут привести к осложнениям, связанным с токсичностью препаратов или лекарственным взаимодействиями, и неоправданным дополнительным медицинским расходам [7]. В настоящее время крайне актуальным является выявление иммунологических суррогатных маркеров как для своевременного выявления грибкового поражения, так и для определения тактики лечения [8].
Считается, что CD4+Т-хелперы являются критически важными клетками, участвующими в противогрибковом иммунитете. Tbet+T-хелперы 1-го типа (Th1) мигрируют в легкие и продуцируют цитокины, прежде всего IFN-y, которые активируют противогрибковую активность макрофагов и нейтрофилов. RORyt+T-хелперы 17 борются с грибками, секрети-руя IL-17, за счет привлечения нейтрофилов в очаг инфекции [1]. В соответствии с современными представлениями, Th1 и Th17 обеспечивают защиту против Aspergillus spp., тогда как Th2 оказывают негативное влияние на формирование специфического иммунного ответа [9]. Помимо классических лимфоцитов, естественные клетки-киллеры (NK-клетки) также способны участвовать в защите от грибковой инфекции [10], демонстрируя способность непосредственно уничтожать грибы рода Aspergillus [11]. NK-клетки традиционно рассматриваются как врожденные иммунные клетки, составляющие первую линию защиты от злокачественных клеток и вирусов
[12]. В периферической крови человека были описаны различные субпопуляции NK-клеток. Примерно 30% NK-клеток периферической крови экспресси-руют гомодимер CD8a. Addison E.G. и соавторами показано, что эти клетки демонстрируют лучшую выживаемость при уничтожении клеток-мишеней
[13]. В недавнем экспериментальном исследовании установлено, что связывание ß-глюкана клеточной стенки A. fumigatus с паттерн-распознающим рецептором Dectin-1 запускает синтез IL-15 - ростового фактора NK-клеток и обеспечивает защиту от грибковой инфекции [14]. Однако существует ограни-
ченное число клинических данных, подтверждающих важную роль NK-клеток в защите от аспергил-лезной инфекции. В основном эти исследования были сосредоточены на гематологических больных после аллогенной ТГСК и пациентах, перенесших трансплантацию почки или печени [15, 16].
Эти исследования необходимы, так как в настоящее время, наряду с совершенствованием антифун-гальной терапии, большое внимание уделяется изучению подходов к восстановлению иммунной системы человека для успешной борьбы с инвазивны-ми грибковыми инфекциями. Для решения данной проблемы следует идентифицировать конкретные нарушения иммунной системы, ответственные за элиминацию возбудителя. Также обращается особое внимание на то, что для эффективного уничтожения микроорганизмов неконтролируемая воспалительная реакция может быть так же вредна, как и состояние иммуносупрессии [17]. Однако до сих пор детально не исследована динамика восстановления иммунологических показателей у гематологических пациентов, получающих полихимиотерапию.
Цель этого проспективного исследования состояла в определении прогностического значения показателей субпопуляционного состава лимфоцитов крови больных ИАЛ в исходе инфекционного заболевания для поиска критериев определения длительности противогрибковой терапии.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В исследование включили взрослых гематологических пациентов. Основную группу составили 22 больных ИАЛ. В группу сравнения вошли 20 человек с клиническими и радиологическими признаками поражения легких, у которых ИАЛ был исключен в ходе обследования. Период наблюдения — 6 месяцев. Контрольную группу составили 25 практически здоровых людей. Для диагностики инвазивного ас-пергиллеза использовали клинические и лабораторные критерии EORTC/MSG (European Organisation for Research and Treatment of Cancer/ Mycoses Study Group), 2020 [2]. Все участники подписали добровольное информированное согласие на проведение исследования в соответствии с Хельсинкской декларацией. Пациентам выполняли компьютерную томографию органов грудной клетки (КТ ОГК) в режиме высокого разрешения, фиброброн-хоскопию с забором бронхоальвеолярного лаважа (БАЛ). Лабораторная диагностика ИАЛ включала микроскопическое, культуральное и серологическое исследования. Из образцов БАЛ готовили препараты в просветляющей жидкости (10% раствор КОН в 10% водном растворе глицерина) с добавлением флуоресцирующего маркера (калькофлуор белый). Окрашенный препарат просматривали в люминесцентном микроскопе, отмечали наличие септирован-ных нитей мицелия, ветвящихся под углом 45о. Га-
лактоманнан в БАЛ определяли иммуноферментным методом с использованием специфической диагностической тест-системы PLATELIA® Aspergillus (BIO-RAD Laboratories, США). Наличие галакто-маннана оценивали путем сравнения оптической плотности исследуемого материала и контрольного образца, содержащего 1 нг/мл галактоманнана. Диагностически значимым считали индекс выше «1,0».
Иммунофенотипирование лимфоцитов периферической крови выполняли методом 6-цветного ци-тофлуориметрического анализа с помощью проточного цитофлуориметра Navios™ (BeckmanCoulter, США). Подготовку образцов периферической крови и настройку цитометра проводили в соответствии с национальными рекомендациями «Исследование субпопуляционного состава лимфоцитов периферической крови с применением проточных цитофлюо-риметров-анализаторов» (Хайдуков С.В. и др., 2012). Лимфоциты окрашивали моноклональными антителами, меченными флуорохромами, согласно рекомендациям производителя: CD45-PC5/5, CD4-FITC, CD8-ECD, CD3-APC, CD19-FITC, CD56-PC7 и CD25-PE (Beckman Coulter, США). После внесения антител образцы тщательно перемешивали, затем инкубировали при комнатной температуре 15 минут в защищенном от света месте. По завершении инкубации при постоянном перемешивании добавляли лизирующий раствор VersaLyse Lysing Solution (Beckman Coulter, США), инкубировали еще 10 минут в тех же условиях. При цитометриче-ском анализе для каждого из образцов набирали не менее 5000 лимфоцитов. Полученные результаты изучали с применением программного обеспечения Navios™ Software v1.2 (Beckman Coulter, США). Для дополнительной характеристики Т-клеточного звена иммунной системы вычисляли иммунорегуля-торный индекс (ИРИ) - соотношение CD3+CD4+/ CD3+CD8+.
Оценку Т-регуляторных лимфоцитов (Treg) также проводили методом проточной цитометрии при окрашивании лимфоцитов периферической крови моноклональными антителами CD4-FITC, CD127-PC7 и CD25-PE (Beckman Coulter, США). Инкубацию осуществляли в тех же условиях, что и при 6-цветном анализе. После инкубации добавляли 500 мкл лизирующего раствора VersaLyse Lysing Solution и 12,5 мкл фиксирующего раствора Fixative Solution IOTest 3 (Beckman Coulter, США). Через 10 минут инкубации при комнатной температуре в темноте образцы отмывали в 4 мл фосфатно-солевого буфера (ФСБ) 5 минут при 1500 оборотах в минуту, удаляли надосадок, и восстанавливали лейкоцитарную взвесь в 400 мкл ФСБ. При цитометри-ческом анализе популяцию CD4+T-хелперов на основании позитивного/ негативного гейтирования разделяли на CD4+CD25+CD127" Treg и
CD4+CD25+CD127+ Т-хелперы активированные (Th act), получая их относительное (%) количество.
Уровень общих иммуноглобулинов А, М, G в сыворотке крови исследовали иммунотурбодимет-рическим методом с использованием коммерческих наборов (Vital, Россия).
Полученные в процессе исследования данные обрабатывали с помощью программной системы STATISTICA 10 (StatSoft, США). Нормальность распределения количественных данных проверяли с применением критерия Колмогорова-Смирнова и Шапиро-Уилка. Изучаемые характеристики представляли медианами, нижним и верхним квартилями (Ме (Qo,25;Qo,75). Для оценки различий между независимыми выборками использовали непараметрический критерий Манна-Уитни, зависимыми выборками — критерий Вилкоксона. Выявление корреляционных взаимосвязей между двумя количественными параметрами выполняли непараметрическим методом ранговой корреляции по Спирмену c вычислением коэффициента ранговой корреляции (г). Различия считали статистически значимыми при р<0,05.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Демографические характеристики пациентов исследуемых групп были сходными. Отсутствовали различия по полу между больными ИАЛ и группой сравнения, мужчины составили по 52% и 55% соответственно. Возраст пациентов с ИАЛ варьировал от 31 до 76 лет, медиана - 60, в группе сравнения - от 22 до 77 лет, медиана - 68.
Больные ИАЛ были разбиты на две группы в зависимости от исхода заболевания. В первую группу вошли 13 человек с благоприятным течением аспер-гиллезной инфекции (благоприятный исход или отсутствие рецидивов в течение 6 месяцев, (ИАЛ исход (+)). Вторую группу составили 9 пациентов с неблагоприятным исходом (ИАЛ исход (-)). Фоновые гематологические заболевания больных ИАЛ и группы сравнения представлены в таблице 1.
Таблица 1
Фоновые заболевания гематологических пациентов
Нозологическая форма ИАЛ исход (+) n=13 ИАЛ исход (-) n=9 Группа сравнения n=20
Острый миелоидный лейкоз 6 (46%) 4 (44%) 5 (25%)
Острый лимфобластный лейкоз 1 (7,7%) 1 (11%) 2 (10%)
Лимфома Ходжкина 3 (23%) 2 (22,2%) 3 (15%)
Неходжкинская лимфома - - 2 (10%)
В-клеточная лимфома - - 1 (5%)
Хронический лимфолейкоз - 1 (11%) -
Хронический миелолейкоз 1 (7,7%) - -
Множественная миелома 1 (7,7%) - 1 (5%)
Миелодиспластический синдром - - 2 (10%)
Острый Т-лимфобластный лейкоз/лимфома - - 1 (5%)
Неуточненный лейкоз 1 (7,7%) 1 (11%) 3 (15%)
Установлено, что ИАЛ чаще развивался на фоне острого миелодного лейкоза - 46% и 44% vs 25%. Большинство пациентов обеих групп получали цито-статическую ПХТ по различным протоколам (Hyper-CVAD+R, COALL-92, ALL 2009, HAD, 7+3, FLAG и др.). У абсолютного большинства больных обеих групп с верифицированным ИАЛ в период, предшествовавший развитию ИАЛ, отмечали клинически значимую лимфоцитопению < 1х109/л (65%, медиана - 16 дней). Лабораторная диагностика ИАЛ включала микологическое и серологическое исследование БАЛ. При посеве БАЛ A. jumigatus выявили у 30% обследованных лиц. Тест на галактоманнан в БАЛ был положителен в 48% случаев.
Пациенты с момента постановки диагноза ИАЛ получали антимикотическую терапию: вориконазол, амфотерицин В, каспофунгин и позаконазол. Общая выживаемость в течение 6-ти месяцев составила
59%.
Всем гематологическим больным с подозрением на развитие ИАЛ выполнили иммунологическое исследование. Провели сравнение содержания основных субпопуляций лимфоцитов у пациентов с ИАЛ до назначения антимикотической терапии в зависимости от исхода заболевания (табл. 2). Общими признаками иммунных нарушений для обеих групп больных ИАЛ было достоверное снижение абсолютного числа CD4+T-хелперов (p=0,028 и p=0,017 соответственно) на фоне повышения относительного числа CD4+CD25+CD127+ активированных Т-хелперов (p=0,009, p=0,010 соответственно) по отношению к показателям группы сравнения. Не установлено различий в числе цитотоксических Т-лимфоцитов, NK-клеток, NKT-клеток и Treg CD4+CD25+CD127- между группами пациентов, включенных в исследование. Особенностью больных с неблагоприятным исходом ИАЛ было значимое снижение относительного и абсолютного числа NK-клеток, экспрессирующих а-цепь антигена CD8 (CD3"CD8+), по отношению к показателям группы сравнения (p=0,049, p=0,049 соответственно). Корреляционный анализ установил значимую положительную взаимосвязь между числом CD3"CD8+ NK-клеток и абсолютным количеством CD4+T-клеток (r=0,59, p<0,05), цитотоксических CD8+T-лимфоцитов (r=0,65, p<0,05) и NK-клетками (r=0,88, p<0,05). В целом эти данные указывают на важную роль CD3"CD8+ NK-клеток в благоприятном течении грибковой инфекции.
При оценке гуморального иммунного ответа не обнаружено достоверных различий в содержании В-лимфоцитов (табл. 2) и уровней IgА, IgM, IgG (табл. 3) между группами гематологических больных, включенных в исследование. На следующем этапе исследования провели сравнение иммунологических показателей у пациентов с ИАЛ до и после антифун-гальной терапии в зависимости от исхода заболевания (табл. 4).
Таблица 2
Субпопуляционный состав лимфоцитов крови гематологических больных ИАЛ до назначения антимикотической терапии
Показатели Группы наблюдения Достоверность различий, p
1 2 3
Группа сравнения (п=20) ИАЛ исход (+), (п=13) ИАЛ исход (-), (п=9)
Лейкоциты х109/л 6,40 (2,10-8,90) 2,47 (0,60-5,00) 2,35 (1,00-4,20) р1-2= 0,048 р1-3= 0,049
Лимфоциты % 30,00 (13,00-50,00) 43,00 (27,00-84,00) 78,5 (24,00-97,30) -
х109/л 1,16 (0,64-1,60) 0,77 (0,53-1,75) 1,09 (0,55-1,58) -
^лимфоциты CD3+ CD19- % 84,00 (79,00-90,00) 84,00 (80,00-95,00) 87,50 (68,00-93,00) -
х109/л 0,88 (0,59-1,30) 0,62 (0,50-1,25) 0,50 (0,34-1,21) -
^хелперы CD3+ CD4+ % 49,00 (35,00-61,00) 44,00 (19,00-60,00) 31,50 (8,45-50,00) -
х109/л 0,57 (0,34-0,78) 0,34 (0,15-0,37) 0,14 (0,06-0,27) р1-2= 0,028 р1-3= 0,017
T-цитотоксические CD3+CD8+ % 33,00 (23,00-42,00) 29,00 (24,00-60,00) 36,00 (16,00-41,00) -
х109/л 0,27 (0,19-0,47) 0,25 (0,14-0,46) 0,28 (012-0,54) -
В-лимфоциты CD3-CD19+ % 3,00 (1,20-9,50) 0,80 (0,30-7,00) 2,50 (0,50-17,00) -
х109/л 0,04 (0,01-0,18) 0,01 (0,00-0,06) 0,02 (0,00-0,05) -
NK-клетки CD3-CD56+ % 8,70 (3,20-10,6) 8,70 (3,40-12,00) 4,90 (3,00-9,10) -
х109/л 0,07 (0,03-0,16) 0,07 (0,02-0,16) 0,04 (0,01-0,10) -
NK-клетки CD3-CD8+ % 3,30 (2,20-5,40) 2,00 (1,10-3,60) 1,40 (0,60-2,60) р1-3= 0,049
х109/л 0,04 (0,01-0,08) 0,02 (0,01-0,06) 0,01 (0,01-0,02) р1-3= 0,049
NKT-клетки CD3+CD56+ % 2,50 (1,30-6,00) 2,60 (1,90-6,60) 3,75 (1,10-5,40) -
х109/л 0,03 (0,01-0,08) 0,03 (0,02-0,03) 0,02 (0,01-0,07) -
Тreg CD4+CD25+CD127- % 11,40 (8,70-13,10) 13,00 (9,00-20,70) 11,00 (9,80-13,10) -
Тh аС CD4+CD25+CD127+ % 20,0 (15,0-24,70) 26,40 (25,10-35,30) 29,20 (23,20-36,50) р1-2= 0,009 р1-3= 0,010
ИРИ 1,40 (1,00-2,70) 1,50 (0,30-2,20) 1,30 (0,20-1,60) -
Примечания. Представлены медианные значения с интерквартильным размахом Ме ^25^75). Статистически значимые различия р между группами выявлены с использованием критерия Манн-Уитни.
Таблица 3
Уровни иммуноглобулинов гематологических больных_
Группы наблюдения Достоверность различий, p
Показатели 1 2 3
Группа сравнения, (п=20) ИАЛ исход (+), (п=13) ИАЛ исход (-), (п=9)
ДО г/л 2,23 (1,14-4,19) 1,16 (0,37-2,34) 2,48 (0,77-3,18) -
|дм г/л 0,90 (0,26-1,19) 0,42 (0,22-0,82) 1,14 (1,04-1,66) -
№ г/л 10,83 (6,48-14,93) 6,89 (3,57-11,53) 8,66 (5,59-10,90) -
Примечания. Представлены медианные значения с интерквартильным размахом Ме ^25^75). Статистически значимые различия р между группами выявлены с использованием критерия Манн-Уитни.
Таблица 4
Динамика субпопуляционного состава лимфоцитов гематологических больных ИАЛ до и после антифунгальной терапии в зави-_симости от исхода заболевания_
Показатели Группы наблюдения
ИАЛ исход (+), (п=6) ИАЛ исход (-), (п=5) Контрольная группа (п=25)
до после до после
Лейкоциты х109/л 2,49 (1,00-2,50) р* = 0,001 4,45 (3,90-6,37) р = 0,046 2,80 (2,10-5,90) 1,90 (1,80-2,70) р = 0,043, р* = 0,000 5,70 (5,30-6,30)
Лимфоциты % 47,50 (27,00-79,20) 37,8 (22,0 -51,00) 56,00 (24,00-74,00) 59,00 (43,00-83,00) р = 0,043, р* = 0,039 36,00 (34,00-37,00)
х109/л 0,77 (0,53-1,48) р* = 0,001 2,07 (1,30-2,50) р = 0,028 1,44 (0,74-2,76) 0,77 (0,42-1,58) р* = 0,026 1,98 (1,89-2,28)
Т-лимфоциты CD3+ CD19- % 82,00 (73,00-95,00) 80,5 (54,00-96,00) 84,00 (68,00-85,00) 80,00 (69,00-91,00) 76,00 (70,00-77,00)
х109/л 0,58 (0,50-0,75) р* = 0,000 1,20 (0,95-1,88) р = 0,028 0,50 (0,38-1,21) 0,62 (0,29-1,47) 1,48 (1,32-1,65)
Т-хелперы CD3+ CD4+ % 54,00 (44,00-65,00) 52,00 (31,00-65,00) 47,00 (33,00-47,00) 43,00 (16,00-46,00) 45,00 (42,00-49,00)
х109/л 0,35 (0,33-0,37) р* = 0,001 0,69 (0,53-1,19) р = 0,028 0,35 (0,15-0,69) р* = 0,045 0,18 (0,12-0,26) р* = 0,005 0,88 (0,83-1,01)
Т-цит. CD3+CD8+ % 25,5 (22,00-27,00) 24,00 (22,00-27,00) 37,00 (16,00-38,00) 34,00 (20,00-60,00) 26,00 (24,00-29,00)
х109/л 0,20 (0,14-0,39) р* = 0,001 0,48 (0,36-0,59) р = 0,028 0,20 (0,12-0,55) 0,46 (0,08-0,54) 0,54 (0,45-0,63)
NK-клетки CD3-CD56+ % 7,05 (3,30-10,6) 7,25 (3,80-11,00) 8,00 (3,50-9,10) р* = 0,016 5,80 (3,00-14,00) 12,00 (10,00-14,00)
х109/л 0,07 (0,02-0,17) р* = 0,001 0,18 (0,05-0,33) 0,10 (0,04-0,12) р* = 0,001 0,11 (0,05-0,12) р* = 0,001 0,25 (0,20-0,29)
NK-клетки CD3-CD8+ % 2,65 (1,10-3,60) 2,40 (1,70-4,20) 2,20 (0,60-2,60) р* = 0,006 1,00 (0,60-4,70) 4,70 (3,00-6,00)
х109/л 0,03 (0,01-0,06) р* = 0,010 0,06 (0,02-0,13) 0,02 (0,01-0,02) р* = 0,001 0,02 (0,01-0,04) р* = 0,001 0,10 (0,06-0,15)
NKT-клетки CD3+ CD56+ % 3,10 (1,90-5,40) 6,10 (3,10-10,60) р* = 0,031 4,80 (2,70-9,60) 6,00 (3,40-11,50) р* = 0,026 2,30 (1,30-3,00)
х109/л 0,03 (0,02-0,03) р* = 0,019 0,08 (0,07-0,16) р = 0,046 0,04 (0,02-0,07) 0,13 (0,01-0,14) 0,05 (0,03-0,06)
Тreg CD4+CD25+CD127- % 11,85 (9,75-17,80) р* = 0,046 10,30 (10,00-16,50) 13,10 (9,80-14,60) р* = 0,024 12,10 (10,50-16,95) р* = 0,029 7,90 (6,75-9,30)
Тh аС CD4+CD25+CD127+ % 32,30 (26,10-39,85) р* = 0,006 41,10 (29,40-41,80) р* = 0,002 30,60 (24,30-36,50) р* = 0,003 24,65 (13,10-37,50) р* = 0,049 14,30 (7,20-20,20)
Примечания. Представлены медианные значения с интерквартильным размахом ^25^75). Статистически значимые различия с использованием критерия Манн-Уитни (р - с контрольной группой), с использованием критерия Вилкоксона (р* - до и после антифунгальной терапии).
Отличием больных ИАЛ с благоприятным течением была положительная динамика абсолютного числа CD4+T-хелперов ф=0,028), цитотоксических CD8+T-лимфоцитов (p=0,028), NKT-клеток (p=0,046). Установлено повышение количества клеток и CD3"CD8+NK-клеток в 67% случаев. У больных ИАЛ с летальным исходом абсолютное число CD4+T-хелперов (p=0,045, p=0,005 соответственно), ^^клеток (p=0,001, p=0,001 соответственно), CD3"CD8+NK-клеток (p=0,001, p=0,001 соответственно) было значимо ниже контрольных значений как при первичном исследовании, так и через 1-2 месяца от начала антифунгальной терапии. Достоверно более высокое число CD4+CD25+CD127+ активированных Т-хелперов по сравнению с контрольными значениями сохранялись у пациентов с ИАЛ обеих групп на протяжении всего периода исследования. Количество CD4+CD25+CD127" Treg нормализовалось в группе больных с благоприятным исходом, однако относительное число NKT-клеток было достоверно выше контрольных значений, что может свидетельствовать о сохраняющемся воспалительном процессе в слизистых оболочках дыхательных путей.
ОБСУЖДЕНИЕ
За последние десятилетия существенно расширились знания об особенностях иммунопатогенеза инвазивных грибковых инфекций. В защитной реакции на вторжение грибкового патогена участвуют различные клетки врожденного и адаптивного иммунитета, такие как моноциты, нейтрофилы, дендритные клетки (ДК), Т- и В-лимфоциты, а также множество иммунных медиаторов, например, кол-лектины, дефенсины и цитокины, включая интерфе-роны [1]. Известно, что тяжелая и продолжительная нейтропения (абсолютное число нейтрофилов <500/мкл и длительностью >10 дней) является важным фактором риска инвазивного аспергиллеза и мукормикоза у пациентов, получающих цитотокси-ческую химиотерапию или перенесших аллогенную ТГСК. Однако считается, что нейтрофилы играют важную роль на ранней стадии инфекционного процесса [18]. После поглощения микроорганизма ДК переносят грибковые антигены в дренирующие лимфатические узлы, где происходит активация и дифференцировка Т-клеток [19]. Ряд субпопуляций лимфоцитов имеет важное значение в формировании противогрибкового иммунитета. 1Ы активируют фагоцитирующие клетки к эффективному уничтожению патогенов, ^17 ответственны за привлечение нейтрофилов в очаг инфекции, 1Ь22 активируют эпителиальные клетки дыхательных путей к продукции антимикробных пептидов, Treg поддерживают тканевой гомеостаз [1]. Кроме того, некоторые ци-токины играют важную роль в сложных взаимодействиях между различными клетками иммунной си-
стемы, которые модифицируют и регулируют врожденные и адаптивные иммунные реакции, такие как индукция, пролиферация и дифференцировка, а также активация или подавление различных клеток-мишеней. Однако в последнее время, наравне с классическими лимфоцитами, большее внимание уделяют изучению роли NK-клеток в противогрибковой защите [10].
Нами установлено, что общими признаками иммунных нарушений для обеих групп пациентов с ИАЛ было достоверное снижение абсолютного числа CD4+T-хелперов по отношению к показателям группы сравнения. У больных ИАЛ с благоприятным течением инфекционного процесса выявлено постепенное восстановление на фоне антифунгаль-ной терапии абсолютного числа CD4+T-хелперов (p=0,028), цитотоксических CD8+T-лимфоцитов (p=0,028), NKT-клеток (p=0,046). Полученные данные согласуются с нашими предыдущими исследованиями и результатами других авторов [14, 20-22].
В нескольких клинических работах показано, что, наряду с клетками адаптивного иммунного ответа, NK-клетки имеют важное значение в благоприятном клиническом исходе инвазивной грибковой инфекции. Stuehler C. c соавторами установили, что снижение количества NK-клеток ниже порога 200 кл/мкл было связано с риском развития ИАЛ, при этом у больных с хорошо контролируемым ИАЛ по сравнению с пациентами с плохим исходом отмечали наиболее быстрое восстановление числа NK-клеток до нормативных показателей. Авторами было сделано предположение, что количество NK-клеток может служить ориентиром для определения длительности назначения противогрибкового лечения [15]. В другом исследовании наблюдали 396 пациентов, перенесших трансплантацию паренхиматозных органов. Снижение числа NK-клеток ниже 50 кл/мкл через 1 месяц после трансплантации было важным фактором риска возникновения инвазивного грибкового заболевания [16]. Нами не обнаружено достоверных различий в числе NK-клеток у гематологических больных ИАЛ по сравнению с пациентами без грибковой инфекции. Однако известно, что немногочисленный пул NK-клеток экспрессирует CD8 в виде гомодимера а-цепей (а/а). По данным Addison E.G. и др., отличием данной субпопуляции CD8+NK-клеток человека является более высокая цитолитическая активность по сравнению с классическими CD3"CD56+CD8"NK-клетками как в состоянии покоя, так и после культивирования [13]. Ahmad F. с коллегами подтвердили, что CD8+NK-клетки демонстрировали более высокую цитотокси-ческую активность в отношении вирусов, что определялось по их способности к продукции цитокинов и дегрануляции. Выявлено, что именно число CD8+NK-клеток было обратно пропорционально
вирусной нагрузке и связано с более медленным прогрессированием ВИЧ-инфекции [23]. Нами установлено, что отличием пациентов с неблагоприятным исходом ИАЛ было значимое снижение относительного и абсолютного числа «неклассических» активированных CD3"CD8+NK-клеток по отношению к показателям группы сравнения. Положительная корреляционная связь между числом CD3"CD8+NK-клеток, абсолютным количеством CD4+T-клеток, цитотоксическими CD8+T-лимфоцитами и классическими NK-клетками подтверждает важную роль CD3"CD8+NK-клеток в благоприятном течении грибковой инфекции, но, даже в этом случае, восстановление абсолютного числа CD3"CD8+NK-клеток не происходило у 33% пациентов, поэтому необходимы дальнейшие исследования.
В настоящее время число изолятов микромице-тов, устойчивых к антимикотикам, возрастает, и обычные противогрибковые препараты могут иметь серьезные побочные эффекты для хозяина. И наоборот, иммуномодулирующие терапевтические агенты, нацеленные на иммунный ответ хозяина, обещают улучшить традиционную антифунгальную терапию. Однако необходимы более точные знания об особенностях иммунных нарушений при инвазивных грибковых инфекциях [8, 9, 17, 24]. Так, IL-15 считается ключевым цитокином для развития и поддержания жизнеспособности NK-клеток [25]. Однонук-леотидные полиморфизмы в гене IL-15 уже были предложены в качестве фактора риска развития хронического аспергиллеза легких [26]. В экспериментальном исследовании установлено, что паттерн-распознающий рецептор фагоцитирующих клеток Dectin-1 присутствует в ограниченном количестве на NK-клетках. Dectin-1 распознает ß-глюкан, входящий в структуру клеточной стенки грибов рода Aspergillus, и стимулирует выработку IL-15, тем самым поддерживая активность популяции NK-клеток, что способствует уничтожению грибков, не вызывая чрезмерной воспалительной реакции [14]. Эти данные и проведенная нами работа подтверждают важную роль NK-клеток в защите от грибов рода Aspergillus. Следовательно, опираясь на имеющиеся сведения о роли NK-клеток в течении грибко-
вых заболеваний [27], можно предположить, что NK-клеточная терапия также обладает высоким потенциалом в отношении ИАЛ. Отметим что, несмотря на все многообещающие преимущества, иммуно-модулирующая терапия, используемая для лечения грибковых инфекций, все еще находится в стадии разработки. Определение основных клеточных субпопуляций лимфоцитов, в частности CD3"CD8+NK-клеток, может быть включено в алгоритмы ведения больных ИАЛ и, возможно, служить одним из критериев определения длительности антимикотической терапии.
выводы
1. Особенностью всех гематологических больных ИАЛ было значимое снижение абсолютного числа CD4+Т-хелперов на фоне повышения относительного числа CD4+CD25+CD127+ активированных Т-хелперов по сравнению с показателями группы сравнения.
2. Значимое снижение относительного и абсолютного числа CD3"CD8+NK-клеток по отношению к показателям группы сравнения установлено у пациентов с неблагоприятным исходом.
3. Важная роль CD3-CD8+NK-клеток в клиническом исходе грибковой инфекции подтверждается положительной корреляционной связью их числа с количеством CD4+T-клеток, цитотоксических CD8+T-клеток и CD3-CD56+NK-клеток.
4. На фоне антифунгальной терапии у пациентов с благоприятным течением ИАЛ установлено постепенное восстановление абсолютного числа CD4+T-хелперов, цитотоксических CD8+T-лимфоцитов, NKT-клеток.
Исследование выполнено в рамках темы Государственного задания Минздрава России «Молеку-лярно-генетические и иммунологические аспекты микозов легких, вызванных грибами рода Aspergillus. Фокус на адаптивный иммунный ответ и механизмы иммунной толерантности». Рег. номер ЕГИСУ: 122012100294-4
ЛИТЕРАТУРА
1. Heung L.J., Wiesner D.L., Wang K. et al. Immunity to fungi in the lung. Semin. Immunol. 2023; 3 (66): 101728. doi: 10.1016/j.smim.2023.101728
2. Donnelly J.P., Chen S.C., Kaufman C.A., et al. Revision and update of the consensus definitions of invasive fungal disease from the European Organization for Research and Treatment of Cancer and the Mycoses Study Group Education and Research Consortium. Clin Infect Dis. 2020; 71 (6): 13671376. doi: 10.1093/cid/ciz1008
3. Шадривова О.В., Рачина С.А., Стрелкова Д.А. и др. Инвазивный аспергиллез у больных COVID-19 в отделениях реанимации и интенсивной терапии: результаты многоцентрового исследования. Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. 2022; 24 (4): 295-302. [Shadrivova O.V., Rachina S.A., Strelkova D.A., et al. Invasive aspergillosis in patients with COVID-19 in intensive care units: results of a multicenter study. Clinical microbiology and antimicrobial chemotherapy. 2022; 24 (4): 295-302. (In Russ)]. doi: 10.36488/cmac.2022.4.295-302
4. Мелёхина Ю.Э., Шадривова О.В., Фролова Е.В. и др. Тяжелый грипп как фактор риска развития инвазивного аспергиллёза лёгких. Журнал инфектологии. 2020; 12 (1): 96-103. [Melekhina Yu.E., Shadrivova O.V., Frolova E.V., et al. Severe influenza as a risk factor for the development of invasive pulmonary aspergillosis. Journal of In-fectology. 2020; 12 (1): 96-103. (In Russ)]. doi: 10.22625/2072-6732-2020-12-1-96-103
5. WHO fungal priority pathogens list to guide research. development and public health action. Geneva: World Health Organization; 2022.
6. Шадривова О.В., Фролова Е.В., Тараскина А.Е., Климко Н.Н. Молекулярно-генетические и иммунологические аспекты инвазивного аспергиллеза. Журнал инфектологии. 2017; 9 (1): 47-54. [Shadrivova O.V., Frolova E.V., Taraskina A.E., Klimko N.N. Molecular genetic and immunological aspects of invasive aspergillosis. Journal Infec-tology. 2017; 9 (1): 47-54. (In Russ)]. doi:10.22625/2072-6732-2017-9-1-47-54
7. Dib R.W., Hachem R.Y., Chaftari A.M. et al. Treating invasive aspergillosis in patients with hematologic malignancy: diagnostic-driven approach versus empiric therapies. BMC Infect. Dis. 2018; 18 (1): 656. doi: 10.1186/s12879-018-3584-9
8. Jenks J.D., Rawlings S.A., Garcia-Vidal C., et al. Immune parameters for diagnosis and treatment monitoring in invasive mold infection. J Fungi (Basel). 2019; 16; 5 (4): 116. doi: 10.3390/jof5040116
9. Delliere S., Aimanianda V. Humoral immunity against Aspergillus fUmigatus. Mycopathologia. 2023; 8: 1-19. doi: 10.1007/s11046-023-00742-0
10. Schmidt S., Tramsen L., Lehrnbecher T. Natural killer cells in antifungal immunity. Front Immunol. 2017; 22 (8): 1623. doi: 10.3389/fimmu.2017.01623
11. Lehrnbecher T., Schmidt S. Why are natural killer cells important for defense against Aspergillus? Med. My-col. 2019; 57 (2): 206-210. doi: 10.1093/mmy/myy034
12. MaceE.M. Human natural killer cells: Form, function, and development. J. Allergy Clin. Immunol. 2023; 151 (2): 371-385. doi: 10.1016/j. jaci.2022.09.022
13. Addison E.G., North J., Bakhsh I., et al. Ligation of CD8alpha on human natural killer cells prevents activation-induced apoptosis and enhances cytolytic activity. Immunology. 2005; 116: 354-361. doi: 10.1111/j.1365-2567.2005.02235.x
14. Yoshikawa F.S.Y., Wakatsuki M., Yoshida K., et al. Dectin-1/IL-15 pathway affords protection against extrapulmonary Aspergillusfumigatus Infection by regulating natural killer cell survival. J Innate Immun. 2023; 15 (1): 1-15. doi: 10.1159/000527188
15. Stuehler C, Kuenzli E., Jaeger V.K., et al. Immune reconstitution after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation and association with occurrence and outcome of invasive aspergillosis. J. Infect. Dis 2015; 212: 959-67. doi:10.1093/infdis/jiv143
16. Fernändez-Ruiz M., Lopez-Medrano F., San Juan R., et al. Low natural killer cell counts and onset of invasive fungal disease after solid organ transplantation. J. Infect. Dis. 2016; 213:873-874. doi: 10.1093/ infdis/jiv552
17. Ademe M. Immunomodulation for the treatment of fungal infections: opportunities and challenges. Front. Cell Infect. Microbiol. 2020; 15 (10): 469. doi: 10.3389/fcimb
18. Fisher B., Robinson P.D., Lehrnbecher T., et al. Risk factors for invasive fungal disease in pediatric cancer and hema-topoietic stem cell transplantation: a systematic review. J. Pediatric. Infect. Dis. Soc. 2018; 7 (3): 191-198. doi:10.1093/jpids/pix030
19. Borghi M, Renga G., Puccetti M. et al. Antifungal Th immunity: growing up in family. Front. Immunol. 2014; 5: 506. doi:10.3389/fimmu.2014.00506
20. Шадривова О.В., Фролова Е.В., Филиппова Л.В. и др. Клинико-иммунологические особенности инвазивного аспергиллеза у больных лимфомой Ходжкина. Клиническая онкогематология. Фундаментальные исследования и клиническая практика. 2014; 7 (2):233-238. [Shadrivova O.V., Frolova E.V., Filippova L.V., et al. Clinical and immunological features of invasive aspergillosis in patients with Hodgkin's lymphoma. Clinical oncohematology. Basic research and clinical practice. 2014; 7 (2): 233-238. (In Russ)].
21. Шадривова О.В., Фролова Е.В., Учеваткина А.Е. и др. Прогностическое значение иммунологических показателей у реципиентов трасплантатов аллогенных гемопоэтических стволовых клеток с инвазивным аспергиллезом. Проблемы медицинской микологии. 2015; 17 (1): 14-20. [Shadrivova O.V., Frolova E.V., Uchevatkina A.E., et al. Prognostic value of immunological parameters in recipients of allogeneic hematopoietic stem cell transplants with invasive aspergillosis. Problems in Medical Mycology. 2015; 17 (1): 14-20. (In Russ)].
22. Фролова Е.В., Шадривова О.В., Филиппова Л.В. и др. Прогностическое значение иммунологических показателей у гематологических больных инвазивным аспергиллезом. Проблемы медицинской микологии. 2014; 16 (3): 37-43. [Frolova E.V., Shadrivova O.V., Filippova L.V., et al. Prognostic value of immunological parameters in hematological patients with invasive aspergillosis. Problems in Medical Mycology. 2014; 16 (3): 37-43. (In Russ)].
23. Ahmad F., Hong H.S., Jackel et al. High frequencies of polyfunctional CD8+ NK cells in chronic HIV-1 infection are associated with slower disease progression. J. Virol. 2014; 88 (21):1 2397-12408. doi: 10.1128/JVI.01420-14
24. Song L., Zhao Y., Wang G, et al. Investigation of predictors for invasive pulmonary aspergillosis in patients with severe fever with thrombocytopenia syndrome. Sci. Rep. 2023; 13 (1): 1538. doi: 10.1038/s41598-023-28851-2.
25. Pfefferle A., Jacobs B., Haroun-Izquierdo A., et al. Deciphering natural killer cell homeostasis. Front. Immunol. 2020; 11: 812. doi:10.3389/fimmu.2020.00812
26. Smith N.L.D., Hankinson J., Simpson A., et al. A prominent role for the IL-1 pathway and IL-15 in susceptibility to chronic cavitary pulmonary aspergillosis. Clin. Microbiol. Infect. 2014; 20 (8): O480-488. doi: 10.1111/14690691.12473
27. Liu S., Galat V., Galat Y. et al. NK cell-based cancer immunotherapy from basic biology to clinical development. J Hematol. Oncol. 2021; 14 (1): 7. doi: 10.1186/s13045-020-01014-w
Поступила в редакцию журнала 01.09.23 Принята к печати 12.09.23
