CC BY
9УДК 632.938:616.15:582.282.123.4
ПРОГНОСТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ
ИММУНОЛОГИЧЕСКИХ ПОКАЗАТЕЛЕЙ У ГЕМАТОЛОГИЧЕСКИХ БОЛЬНЫХ ИНВАЗИВНЫМ АСПЕРГИЛЛЕЗОМ
1 Фролова Е.В. (зав. лаб.)*, 1 Шадривова о.В. (аспирант), 1 Филиппова л.В. (н.с.), 1учеваткина А.Е. (с.н.с.), 2 Волкова А.г. (пульмонолог), 2 Попова м.о. (врач-гематолог), 2 Эубаровская л.с. (зав. отд.), 3зюзгин и.с. (зав. отд.), 3 ружинская о.с. (врач-гематолог), 1 Богомолова т.с. (зав. лаб.), 1 Васильева н.В. (директор нии), 2Афанасьев б.В. (директор), 1 климко н.н. (зав. кафедрой)
1 Северо-Западный государственный медицинский университет им. И.И. Мечникова (НИИ медицинской микологии им. П.Н. Кашкина и кафедра клинической микологии, аллергологии и иммунологии);
2 Институт детской гематологии и трансплантологии имени Р.М. Горбачёвой СПбГМУ им. И.П.Павлова;
3 Ленинградская областная клиническая больница, Санкт-Петербург, Россия
© Коллектив авторов, 2014
Инвазивный аспергиллез - тяжелаямикотическая инфекция, возникающая преимущественно у гематологических больных. Впервые мы представляем результаты исследования иммунологических показателей у гематологических больных инвазивным аспергиллезом, получающих цитостатическую полихимиотерапию, в зависимости от исхода заболевания. Установлено, что особенностью состояния иммунной системы у больных с неблагоприятным исходом инвазивного аспергиллеза было снижение абсолютного числа цитотоксических Т-лимфоцитов, естественных киллеров и угнетение продукции провоспалительных цито-кинов ИФН-у, ФНО-а, ИЛ-17 и ИЛ-6. Способность клеток крови к продукции ФНО-а является диагностически значимым маркером, позволяющим с высокой вероятностью прогнозировать неблагоприятный исход инвазивного аспергиллеза.
Ключевые слова: антифунгальная терапия, гемобластоз, иммунный ответ, инвазивный аспергиллез, цитостатическая полихимиотерапия
Контактное лицо: Фролова Екатерина Васильевна, тел.: (812) 303-51-40
PROGNOSTIC VALUE OF IMMUNOLOGICAL PARAMETERS IN HEMATOLOGICAL PATIENTS WITH INVASIVE ASPERGILLOSIS
1 Frolova E.v. (head of the laboratory),1 shadrivova o.v. (postgraduate student), 1 filippova L.v. (scientific collaborator), 2Uchevatkina A.E. (senior scientific collaborator), 2 volkova A.G. (pulmonologist), 2 Popova M.o. (hematologist), 2 Zubarovskaya L.s. (head of the department), 3 Zjuzgin l.s. (head of the department), 3 Ruzhinskaya o.s. (hematologist), 1 Bogomolova T.s. (head of the laboratory), 1 vasilyeva N.v. (directorof the institute), 2 Afanasyev B.v. (director), 1 Klimko N.N. (head of the chair)
1 North-West State Medical University named after I.I. Mechnikov (Kashkin Research Institute of Medical Mycology and Chair of Clinical Mycology, Allegology and Immunology); 2 R.M. Gorbacheva Institute of Children's Hematology and Transplantology of I.P. Pavlov State Medical University; 3 Leningrad Regional Clinical Hospital, St. Petersburg, Russia
© Collective of authors, 2014
Invasive aspergillosis is a severe mycotic infection occurs mainly in hematological patients. For the first time we present the study results of immunological parameters in haematological patients with invasive aspergillosis receiving cytotoxic therapy, depending on the outcome of the disease. It was found that the immune system peculiarities in patients with a poor outcome of invasive aspergillosis were the reduction in the absolute number of cytotoxic T-lymphocytes, natural killer cells and inhibition of the production of proinflammatory cytokines IFN-y, TNF-a, IL-17 and IL-6. The ability of blood cells to TNF-a is diagnostically significant marker, allowing a high probability to predict poor outcome of invasive aspergillosis.
Key words: antifungal therapy, cytotoxic therapy, hematological malignancies, immune response, invasive aspergillosis
введение
Инвазивные микозы у гематологических пациентов, в том числе заболевания, вызванные грибами рода Aspergillus, в настоящее время остаются актуальной клинической проблемой. В связи с применением высокодозной цитостатической полихимиотерапии (ПХТ) и современных методов лечения бактериальных инфекций возросло число иммуно-компрометированных пациентов с высоким риском развития инвазивного микоза.
Частота развития инвазивных микозов у гематологических пациентов составляет 19-20%. Инва-
■
зивный аспергиллез (ИА) является наиболее частой микотической инфекцией и составляет от 60% до 82% от всех инвазивных микозов [1, 2]. Наибольшему риску возникновения этого тяжелого осложнения подвержены пациенты с острым лейкозом во время цитостатической терапии (риск возникновения составляет » 10%), из них в 60% случаев ИА развивается на фоне нейтропении после первой линии химиотерапии (индукции ремиссии). У лиц после трансплантации аллогенных стволовых кроветворных клеток (алло-ТГСК) риск возникновения ИА - от 5% до 26% [3,4]. Среди больных ИА в Санкт-Петербурге пациенты с гемобластозами составляют 86-90%. Несмотря на раннюю диагностику и антифунгальную терапию, летальность остается высокой и при различных клинических вариантах ИА варьирует от 48% у пациентов с нейтропенией до 92% - у реципиентов алло-ТГСК [3].
Считают, что прогноз течения инфекционного заболевания зависит от ранней диагностики, своевременного и эффективного лечения. В настоящее время диагностика ИА основывается на оценке факторов риска и клинических признаков развития заболевания, результатов микологических, радиологических и цитологических и/или гистологических исследований [5]. Однако нет надежных критериев прогнозирования течения заболевания и определения сроков окончания антифунгальной терапии. На сегодняшний день известно, что у гематологических больных, получающих длительную цитостатическую или иммуносупрессивную терапию, имеют место нарушения в иммунной системе, являющиеся предрасполагающими факторами возникновения ИА [6, 7]. Также представлены немногочисленные данные изучения цитокинового профиля у гематологических больных ИА [8, 9]. Таким образом, изучение иммунологических особенностей ИА и определение их влияния на течение и прогноз заболевания необходимы для дальнейшей разработки перспективных стратегий лечения аспергиллезной инфекции.
Цель исследования - определить прогностическое значение иммунологических показателей у гематологических больных инвазивным аспергилле-зом, получающих цитостатическую ПХТ.
материалы и методы1
Иммунологическое исследование было проведено 48 гематологическим больным, у которых ИА развился после цитостатической ПХТ, (28 женщин и 20 мужчин) в возрасте от 18 до 78 лет (медиана - 46). С учетом исхода заболевания, пациенты были отнесены к двум группам: в группу I включили больных с неблагоприятным исходом (п=12), II группу составили пациенты, у которых была достигнута ремиссия в течение 12-месячного периода наблюдения и отменена антимикотическая терапия (п=36). В контрольной группе - 32 практически здоровых человека (медиана возраста - 29 лет).
Основанием для включения пациентов в иссле-
дование была постановка диагноза ИА на основании критериев EORTC/MSG, 2008 [10]. Обследование больных проводили в соответствии с рекомендациями EBMT (European Group for Blood and Marrow Transplantation), включавшее микологическое и инструментальное исследования. Всем пациентам выполняли фибробронхоскопию с отбором брон-хоальвеолярного лаважа (БАЛ). Лабораторная диагностика ИА заключалась в микроскопическом и культуральном исследованиях. Из образцов биосубстратов (мокрота, БАЛ) готовили препараты в просветляющей жидкости (10% раствор КОН в 10% водном растворе глицерина) с добавлением флуоресцирующего маркера (калькофлуора белого). Окрашенный препарат просматривали в люминесцентном микроскопе, отмечали наличие септированных нитей мицелия, ветвящихся под углом 45 о. Из операционного материала готовили гистологические препараты, окрашивая срезы гематоксилином-эозином, проводили PAS-реакцию и окраску по методу Гомори-Грокотта для выявления элементов гриба. Галактоманнан (ГМ) определяли в сыворотке крови и БАЛ иммуноферментным методом с использованием специфической диагностической тест-системы PLATELIA® Aspergillus (BIO-RAD Laboratories, США). Наличие ГМ оценивали путем сравнения оптической плотности исследуемого материала и контрольного образца, содержащего 1 нг/мл ГМ. Диагностически значимым считали индекс выше «0,5» в сыворотке крови и выше «1,0» - в БАЛ. Инструментальные методы диагностики: обязательно проводили компьютерную томографию легких в режиме высокого разрешения, а также (по показаниям) магнитную резонансную томографию, ультразвуковое исследование органов брюшной полости.
Иммунологическое исследование выполняли гематологическим больным на ранней стадии заболевания - через 1-4 недели от постановки диагноза ИА (медиана - 14 суток). Состояние иммунореактив-ности оценивали по показателям клеточного и гуморального звеньев иммунного ответа, а также факторов врожденной резистентности организма. Суб-популяционный состав лимфоцитов устанавливали иммуноцитохимическим методом с использованием моноклональных антител «DAKO». Киллерную активность нейтрофилов оценивали с применением референтного штамма Candida albicans. Продукцию ИФН-у, ИЛ-6, ИЛ-10, ИЛ-17, ФНО-а, Г-КСФ определяли с помощью коммерческих иммуноферментных тест-систем («Цитокин», «Вектор-Бест», Россия) в супернатантах клеток крови после 24-часовой индукции фитогемагглютинином. Уровни иммуноглобулинов в сыворотке крови оценивали нефелометриче-ским методом на анализаторе белков «Turbox plus».
Полученные в процессе исследования медико-биологические данные обрабатывали с помощью программной системы STATISTICA 6.0. Оценку различий между независимыми выборками осуществляли непараметрическим критерием Манна-Уитни.
Степень зависимости между различными параметрами внутри исследуемых групп определяли с помощью ранговой корреляции Спирмана. Для оценки диагностической значимости иммунологических показателей в прогнозировании течения ИА использовали ROC-анализ (receiver-operator characteristic) с расчетом площади под кривой. Построение ROC-кривой заключается в расположении на осях X и Y частоты истинно положительных результатов (чувствительность) и ложноположительных результатов (специфичность) для каждой точки разделения. Количественную оценку характеристической кривой выполняли, рассчитав площадь под ней (Area Under Curve, AUC). В соответствии с классификацией, площадь под ROC-кривой от 0,5 до 0,7 указывает на невысокую точность теста; тест с площадью под кривой ROC от 0,7 до 0,9 может быть использован в практике, и площадь под ROC кривой выше 0,9 характеризует тест, обладающий высокой точностью. На основе полученных зависимостей определяли пороговые значения наиболее значимых факторов (иммунологических показателей, достоверно связанных с исходом заболевания). Пороговое значение выбирали с учетом наибольших показателей чувствительности и специфичности теста при условии значимого отличия (p<0,05) площади построенной ROC-кривой от критического значения 0,5. Анализ выживаемости проводили по методу Каплана-Мейера, для оценки
достоверности применяли логарифмический ранговый тест - «log-rank test».
результаты
На основании критериев (EORTC/MSG 2008) вероятный ИА был диагностирован у 96% пациентов, доказанный - у 4%. Диагноз подтвержден микологически (положительные результаты микроскопии/ посева БАЛ) - у 28% обследованных. Основные возбудители: A. fumigatus - 65%, A. niger - 26%, A. flavus - 9%. Больные получали ПХТ по различным протоколам (Hyper-CVAD+R, COALL-92, ALL 2009, HAD, 7+3, FLAG). Интервал после последнего курса ПХТ до обследования - от 5 до 50 дней (медиана дней -30). При анализе фоновых заболеваний выявили, что ИА наиболее часто развивается у пациентов с острым миелоидным или острым лимфобластным лейкозом. Среди фоновых заболеваний острый лейкоз составил 52%. Другими фоновыми состояниями были хронический лейкоз, лимфомы, реже - миело-диспластический синдром и апластическая анемия.
Среди клинических вариантов ИА наиболее часто развивалось поражение легких - 97%. Экстрапуль-мональный аспергиллез с вовлечением центральной нервной системы (ЦНС) наблюдали в 3% случаев, изолированное поражение кишечника - у одного пациента. В единичных случаях диагностировали сочетанное поражение легких и ЦНС. У абсолютно-
Таблица 1.
сравнительная характеристика иммунологических показателей гематологических больных иА
Показатели Пациенты, получающие ПХТ I группа (n=12) Пациенты, получающие ПХТ II группа (n=36) Контрольная группа (n=32)
Медиана (25%+75%)
Лейкоциты (х109/л) 1,40 (0,65+4,65)* 4,45 (2,44- 6,05) * 5,90 (5,25+ 6,45)
Лимфоциты абс (х109/л) 0,52 (0,22+0,89) * ** 1,14 (0,71 + -2,17) * 2,19 (1,94+ 2,47)
Нейтрофилы абс (х109/л) 1,13 (0,25 +4,05) * 1,78 (0,94+ 2,85) * 3,06 (2,54+ 3,48)
CD3+ (%) 72,00 (66,00+85,00) 71,00 (56,00+84,00) * 68,00 (65,00+70,50)
CD3+ абс (х109/л) 0,51 (0,30+0,62) * ** 0,99 (0,58+1,83) 1,47 (1,27+1,67)
CD4+ (%) 35,00 (18,00+50,00) 34,00 (23,00+36,00) 41,00 (39,00+43,00)
CD4+ абс (х109/л) 0,26 (0,07+0,47) * 0,44 (0,26+0,74) * 0,87 (0,72+1,00)
CD8+(%) 43,00 (36,00+51,00) * 38,00 (30,00+49,00) * 26,50 (24,50+29,00)
CD8+ абс (х109/л) 0,25 (0,20+0,48) * ** 0,50 (0,30+0,93) 0,58 (0,52+0,67)
CD20+ (%) 6,00 (4,00+10,0) * 8,00 (5,00+10,00) * 15,00 (14,00+17,00)
CD20+ абс (х109/л) 0,05 (0,02+0,07) * ** 0,15 (0,05+0,20) * 0,33 (0,28+0,38)
CD25+ (%) 9,00 (4,00+12,00) 9,00 (6,00+11,00) * 12,00 (11,00+14,00)
CD25+ абс (х109/л) 0,05 (0,02+0,10) * 0,13 (0,04+0,23) * 0,26 (0,22+0,10)
CD16+ (%) 11,00 (7,00+13,00) 11,00 (8,00+14,00) 11,00 (10,00+13,00)
CD16+ абс(х109/л) 0,06 (0,03+0,10) * ** 0,15 (0,09+0,26) * 0,22 (0,19+0,28)
ИРИ CD4+/CD8+ 0,98 (0,44+1,05) * 0,85 (0,60+1,33) 1,56 (1,39+1,69)
КК (%) 8,0 (6,0+14,0) * 10,00 (7,50+ 17,50) * 24,00 (22,00+26,50)
IgA (г/л) 1,21 (0,72 +2,04) * 1,16 (0,45+ 2,78) * 1,80 (1,78+2,02)
IgM (г/л) 0,61 (0,30 +1,01) * 0,65 (0,34+ 0,92) * 1,16 (1,06+1,17)
IgG (г/л) 10,65 (5,80 +16,50) * 10,30 (5,50+ 16,70) * 13,50(12,95+14,70)
ИФН-у индуц (пг/мл) 94,00 (62,5+ 228,5) * ** 590,0 (239,5+865,5) * 768,0 (577,0+1258,0)
ФНО-а (пг/мл) 104,00 (7,00+ 177,00) * ** 387,5(253,0+463,0) * 468,0 (391,0 +550,0)
ИЛ-6 (пг/мл) 54,00 (14,00+ 360,50) * ** 476,0 (98,0+619,0) 430,0(354,0+ 602,0)
ИЛ-10 (пг/мл) 12,00 (0,50+184,50) * 87,5 (37,0+223,0) * 403,5 (280,0 +490,0)
ИЛ-17 (пг/мл) 16,50 (4,50+37,00) * ** 65,5 (23,0 + 170,0) * 166,0 (156,0 +191,0)
Г-КСФ (пг/мл) 27,50 (5,00+74,0) * 122,0 (37,0+284,0) * 299,0 (145,0 +281,0)
Примечание: представлены медианные значения с интерквартильным размахом (25% -75%); * - достоверность различий показателей по сравнению с контрольной группой (р < 0,05); ** - достоверность различий показателей между группами (р < 0,05)
го большинства больных отмечали нейтропению и лимфоцитопению в период, предшествовавший развитию ИА. Основными клиническими проявлениями ИА были лихорадка, рефрактерная к антибиотикам широкого спектра действия, и кашель, в редких случаях - кровохарканье.
Все пациенты с момента постановки диагноза ИА получали антимикотическое лечение: вориконазол, амфотерицин В, итраконазол, каспофунгин и поза-коназол.
Общая выживаемость в течение 3-х месяцев у больных составила 91%, в течение 12 месяцев - 75%.
При сравнении показателей иммунного статуса гематологических пациентов на ранней стадии ИА с данными контрольной группы обнаружили сходные изменения параметров, характеризующих состояние разных звеньев иммунного ответа, в обеих группах (табл. 1). Снижение количества лейкоцитов и абсолютного числа лимфоцитов установили у гематологических больных I и II групп. Соответственно, отмечали снижение абсолютного числа всех исследованных субпопуляций лимфоцитов, за исключением цитотоксических Т-лимфоцитов, у больных II группы. Однако обнаружили повышение процентного содержания цитотоксических Т-лимфоцитов, что является показателем изменения способности предшественников лимфоцитов к дифференциров-ке, и это подтверждается достоверными различиями в значениях иммунорегуляторных индексов (ИРИ). Также установлено снижение количества лимфоцитов с активационными маркерами - рецепторами к интерлейкину-2. Из полученных результатов следует, что имели место сдвиги показателей клеточного иммунитета, которые проявлялись снижением абсолютного числа Т-хелперов и уменьшением экспрессии на них активационных маркеров, что согласуется с данными литературы [6].
При оценке состояния нейтрофильного компонента системы фагоцитирующих клеток и гуморального иммунного ответа наблюдали снижение абсолютного числа нейтрофилов, их киллерной активности, количества В-лимфоцитов и их способности к продукции иммуноглобулинов всех исследованных классов в обеих группах гематологических больных ИА.
При изучении функциональной активности лейкоцитов периферической крови у гематологических больных ИА обеих групп отмечали снижение способности лейкоцитов к продукции как провоспали-тельных цитокинов ИФН-у, ФНО-а, ИЛ-17, Г-КСФ, так и противовоспалительного цитокина ИЛ-10. Снижение способности лейкоцитов к продукции ИЛ-6 выявили только у больных с неблагоприятным исходом.
На следующем этапе сравнивали иммунологические показатели у гематологических больных в зависимости от исхода ИА (табл.1). Анализ иммуно-фенотипического спектра лимфоцитов установил, что у пациентов с благоприятным течением инфек-
ционного процесса было достоверно выше абсолютное число Т-лимфоцитов за счет цитотоксических Т-лимфоцитов, В-лимфоцитов и естественных киллеров, по сравнению с больными с неблагоприятным исходом заболевания. Не обнаружили отличий между группами по показателям, характеризующим количественное содержание и киллерную активность нейтрофилов, уровням иммуноглобулинов. При исследовании цитокин-продуцирующей способности лейкоцитов у больных I группы наблюдали снижение выработки провоспалительных цитокинов ИФН-у, ФНО-а, ИЛ-6, ИЛ-17, привлекающих в очаг инфекционного процесса фагоцитирующие клетки и обеспечивающих их антифунгальную активность. Таким образом, исследованные группы больных различались как по количественным показателям лимфоцитов, так и их функциональной активности, что подтверждено данными корреляционного анализа. Установили положительную корреляционную связь абсолютного числа цитотоксических Т-лимфоцитов и естественных киллеров с их способностью к продукции ИФН-у и ИЛ-17 (г=0,61, г=0,54 и г=0,59, г=0,58 при р < 0,05 соответственно) и абсолютного числа естественных киллеров с ФНО-а (г=0,55; р < 0,05).
При построении ИОС-кривых выявили достаточно высокую информативность определения способности клеток крови к продукции ФНО-а и ИФН-у. При оценке прогностического значения способности клеток крови к продукции ФНО-а и ИФН-у, площадь под ИОС-кривой составила 0,795 (р = 0,001) и 0,810 (р=0,0001), что является показателем высокой точности теста в соответствии с классификацией площади под ИОС-кривой. На основании ИОС-кривых для показателей ФНО-а и ИФН-у, представленных на рисунках 1 и 2, были подсчитаны чувствительность и специфичность для различных точек разделения.
Рис. 1. ROC-анализ прогностического значения способности клеток крови гематологических больных ИА к продукции ФНО-а
Ч/зс тв ите лыюнь
Щ
щ--ж'''
8 В
5 ^ дис-о.вю
в г--*' 1 1 1 1 1
э.е
СП*цифтнвс1ъ
Рис. 2. КОС-анализ прогностического значения способности клеток крови гематологических больных ИА к продукции ИФН-у
Точки разделения, указывающие на максимальные значения чувствительности и специфичности, соответствовали уровню ФНО-а - 215 пг/мл, ИФН-у - 302 пг/мл (табл. 2).
Таблица 2.
координаты ВДС-кривой для прогноза 12-недельной выживаемости у гематологических больных ИА
ФНО-а пг/мл чувствительность специфичность ИФН-у пг/мл чувствительность специфич ность
123 0,824 0,545 177 0,800 0,667
164 0,824 0,636 219 0,771 0,667
190 0,824 0,727 238 0,771 0,750
215 0,824 0,818 302 0,771 0,833
229 0,794 0,818 346 0,743 0,833
253 0,765 0,818 350 0,714 0,833
256 0,735 0,818 358 0,686 0,833
Анализ общей выживаемости методом Каплана-Мейера в группах гематологических больных И А, в зависимости от порогового показателя способности клеток крови к продукции ФНО-а (менее 215 пг/ мл), доказано его значение как отрицательного прогностического фактора (р=0,03) (Рис. 3) в отличие от ИФН-у (р=0,06). Таким образом, значения продукции ФНО-а менее 215 пг/мл служат основой прогноза неблагоприятного исхода ИА в течение 12 недель со специфичностью 81,8% и чувствительностью 82,5%. Следовательно, нашими результатами подтверждено, что у гематологических больных, получающих цитостатическую ПХТ, определение способности клеток крови к продукции ФНО-а на ранней стадии ИА можно эффективно использовать для оценки прогноза заболевания.
Рис. 3. Анализ общей выживаемости методом Каплана-Мейера в группах гематологических больных ИА в зависимости от порогового показателя способности клеток крови к продукции ФНО-а
обсуждение
Впервые мы представляем результаты исследования иммунологических показателей у гематологических больных ИА, получающих цитостатическую ПХТ, в зависимости от течения инфекционного процесса. У всех обследованных пациентов выявили отклонения в количестве и функциональной активности клеток иммунной системы, отражающие особенности течения микотического процесса на ранней стадии заболевания. Обнаружили изменение способности предшественников лимфоцитов к дифференцировке в различные субпопуляции: снижение абсолютного числа Т-хелперов, естественных киллеров и повышение относительного количества цитотоксических Т-лимфоцитов по отношению к показателям контрольной группы. Эти результаты согласуются с данными о том, что именно субпопуляция Т-хелперов наиболее чувствительна к действию препаратов, используемых при цитотоксической ПХТ, которые позволяют значительно увеличить частоту достижения полной ремиссии при лечении гемобластозов [11]. Снижение числа нейтрофилов и нарушение их функциональной активности считают наиболее существенными факторами риска развития ИА у больных на фоне цитотоксической ПХТ [6]. В нашем исследовании у гематологических пациентов обеих групп выявили снижение абсолютного числа нейтрофилов и их киллерной активности. Это может являться признаком нарушения механизмов микро-бицидности фагоцитирующих клеток, активность которых во многом контролируется балансом про- и противовоспалительных цитокинов [12]. Благодаря изучению особенностей цитокинового профиля на ранней стадии ИА смогли установить снижение способности лейкоцитов к продукции как провоспали-тельных цитокинов ИФН-у, ФНО-а, ИЛ-17, Г-КСФ, так и противовоспалительного цитокина ИЛ-10.
При сравнении иммунологических показателей у гематологических больных, в зависимости от течения ИА, не наблюдали отличий между группами по
числу и функциональной активности нейтрофилов и уровням иммуноглобулинов. Эти данные согласуются с мнением о том, что нейтропения предрасполагает к возникновению ИА, в то время как состояние лимфоидного звена иммунного ответа определяет развитие заболевания [6]. Установлено, что у пациентов с неблагоприятным течением инфекционного процесса достоверно ниже абсолютное число цито-токсических Т-лимфоцитов и естественных киллеров, по сравнению с показателями у пациентов с благоприятным исходом заболевания. Роль цитотокси-ческих Т-лимоцитов и естественных киллеров в течении ИА до конца не изучена. Авторы немногочисленных исследований отмечают, что естественные киллеры способны как непосредственно повреждать гифы А. fumigatus, так и продуцировать ИФН-у на ранней стадии иммунного ответа [13]. Тешр^оп Б.Р. и соавторы обнаружили возрастание числа цитоток-сических Т-лимфоцитов, вырабатывающих ИФН-у, в БАЛ мышей, неоднократно зараженных конидиями А. fumigatus, и предположили, что эти клетки сдерживают прорастание грибов и препятствуют развитию инфекционного процесса [14]. Таким образом, полученные нами данные подтверждают, что цито-токсические Т-лимфоциты и естественные киллеры играют важную роль в обеспечении клеточного иммунного ответа при ИА.
Известно, что для оценки состояния иммунного ответа необходимо оценить не только субпопуля-ционный состав лимфоцитов, но и их функциональную активность. С этой целью проведено изучение способности клеток крови к продукции провоспа-лительных и противовоспалительных цитокинов. Оценка широкого спектра цитокинов необходима в связи с тем, что медиаторы иммунного ответа являются короткоживущими и во многом дублируют функции друг друга. Наиболее выраженные различия между двумя группами обнаружены при оценке резервной способности лейкоцитов к продукции провоспалительных цитокинов. У пациентов с неблагоприятным исходом ИА установлено достоверное снижение выработки ИФН-у, определяющего напряженность клеточного иммунного ответа. Ранее НеЬаг! Н. и соавторы обнаружили снижение выработки ИФН-у мононуклеарными клетками гематологических больных с неблагоприятным течением ИА, но, в отличие от наших данных, в этом исследовании выявлена повышенная продукция ИЛ-10 [15]. Проведенный нами анализ способности клеток крови к продукции других провоспалительных цитокинов показал, что выработка ФНО-а, ИЛ-17 и ИЛ-6 существенно снижена у гематологических больных с неблагоприятным исходом по сравнению с показателями пациентов с благоприятным течением ИА. Данные цитокины секретируются не только лимфоцитами, но и клетками миелоидного происхождения, в том числе альвеолярными макрофагами, дендритными клетками, моноцитами/макрофагами, нейтрофилами, и наряду с ИФН-у, играют важную
роль в поддержании противогрибковой активности фагоцитирующих клеток [16]. Корреляционным анализом установлена положительная связь абсолютного числа цитотоксических Т-лимфоцитов со способностью клеток крови к выработке ИФН-у и ИЛ-17 и абсолютного числа естественных киллеров с продукцией ФНО-а.
Количество клинических исследований по изучению диагностического значения цитокинов в прогнозировании течения ИА у гематологических пациентов немногочисленно. ИоШёез Е. и соавт. сообщили, что повышенное содержание ГЬ-10 в сыворотке крови больных ИА коррелируют с плохим прогнозом у гематологических больных без нейтропении, и ИЛ-10 может выступать в качестве маркера для выявления пациентов с риском возникновения ИА [8]. Другие исследователи установили, что высокие уровни в сыворотке крови таких провоспалительных цитокинов, как ИЛ-6 и ИЛ-8, могли быть ранними предсказателями неблагоприятного исхода ИА, а высокое содержание ИЛ-10 в течение недели лечения антифунгальными препаратами было связано с благоприятным исходом [9]. Было высказано предположение о том, что ИЛ-10 контролирует развитие инфекционного процесса, так как он может быть ключевым регулятором воспалительного ответа [6].
Противоречивость полученных данных может быть связана с тем, что в представленных работах изучено ограниченное число цитокинов, и оценку их уровней проводили в сыворотке крови. Известно, что цитокины являются короткоживущими белковыми молекулами и могут изменять свою активность при связи с белками сыворотки крови. Кроме того, определяемые концентрации цитокинов часто незначительно отличаются от пороговых значений, которые возможно оценить в тест-системах. Следовательно, изучение способности лейкоцитов к продукции ци-токинов предпочтительнее, так как мы определяем резервные способности клеток к выработке широкого спектра различных медиаторов. При оценке диагностической значимости показателей цитокинов в прогнозе течения ИА с применением ИОС-анализа подтвердили, что измерение этих маркеров может быть использовано для мониторинга иммунного ответа и прогнозирования клинических исходов.
выводы
1. Выявили характерные изменения иммунологических показателей на ранней стадии ИА у гематологических больных, получающих цито-статическую ПХТ: снижение абсолютного числа Т-хелперов, естественных киллеров и усиление способности Т-лимфоцитов к дифференцировке в ци-тотоксическую субпопуляцию; уменьшение числа В-лимфоцитов и уровней иммуноглобулинов всех классов (^в, 1дМ и 1дЛ); угнетение киллерной активности нейтрофилов и снижение продукции ИФН-у, ФНО-а, ИЛ-17, Г-КСФ и ИЛ-10.
2. Особенностью состояния иммунной системы
у больных с неблагоприятным исходом ИА было снижение абсолютного числа цитотоксических Т-лимфоцитов, естественных киллеров и угнетение продукции провоспалительных цитокинов ИФН-у, ФНО-а, ИЛ-17 и ИЛ-6.
3. Способность клеток крови к продукции ФНО-а является диагностически значимым маркером, определяющим с высокой вероятностью прогноз неблагоприятного исхода инвазивного аспергиллеза.
цитированная литература
1. Kousha M., Tadi R., Soubani A.O. Pulmonary aspergillosis: a clinical review // Eur. Respir. Rev. - 2011. - Vol. 20, №21. - P. 156-172.
2. Попова М.О., ЗубаровскаяЛ.С., Климко Н.Н., Афанасьев Б.В. Инвазивные микозы при трансплантации гемопоэти-ческих стволовых клеток // Тер. архив. - 2012. - №7. - P. 50-57.
3. Zmeili O., Soubani A. Pulmonary aspergillosis: a clinical update // Oxford Journals - 2007. - Vol. 100. - P. 317-334.
4. Herbrecht R., Bories P., Moulin J.C., Ledoux M.P. Risk stratification for invasive aspergillosis in immunocompromised patients // Ann. of the New York Academy of Sci. - 2012. - Vol. 1272. - P. 23-30
5. Васильева Н.В., Климко Н.Н., Цинзерлинг В.А. Диагностика и лечение инвазивных микозов: современные рекомендации // Вестник СПбМАПО. - 2010. - Т. 2, №4. - С. 5-18.
6. Chai L.Y., Vonk A.G., Kullberg B-J., Netea M.G. Immune response to Aspergillus fumigatus in compromised hosts: from bedside to bench // Future Microbiol. - 2011. - Vol. 6, №1. - P. 73-83.
7. Camrgo J.F., Husain S. Immune correlates and protection in human invasive aspergillosis // Eur. Respir. Rev. - 2014. - Vol. 20, №21. - P.156-172.
8. Roilides E., Sein T., Roden M., et al.. Elevated serum concentrations of interleukin-10 in non-neutropenic patients with invasive aspergillosis // J. Infect. Dis. - 2001. - Vol. 183. - P. 518-520.
9. Chai L.Y.A., Netea M.G., Teerenstra S., et al. Early proinflammatory cytokines and C-reactive protein trends as predictors of outcome in invasive aspergillosis // J. Infec. Dis. - 2010. - Vol. 202, №9. - P. 1454-1462.
10. De Pauw B., Walsh T.J., Donnelly J.P., et al. Revised definitions of invasive fungal disease from the European Organization for Research and Treatment of Cancer/Invasive Fungal Infections Cooperative Group and the National Institute of Allergy and Infectious Diseases Mycoses Study Group (EORTC/MSG) Consensus Group // Clin. Infec. Dis. - 2008. - Vol. 46, №12. - P. 1813-21.
11. Zitvogel L., Apetoh L., Ghiringhelli F., Kroemer G. Immunological aspects of cancer chemotherapy // Immunology. -2008. - Vol. 8. - P. 59-73.
12. van de Veerdonk F.L., Netea M.G. T-cell subsets and antifungal host defenses // Curr. Fung. Infec. Reports. - 2010. - Vol. 4, №4. - P. 238-243.
13. Bouzani M., OkM., McCormick A., et al. Human NK cells display important antifungal activity against Aspergillus fumigatus, which is directly mediated by IFN-y release // J. of Immun. - 2011.- Vol.1 87, №3. - P. 1369-1376.
14. Templeton S.P., Buskirk A.D., Law B., et al. Role of germination in Murine airway CD8+T-cell responses to Aspergillus conidia // PLoS ONE. - 2011. - Vol. 6, №4 (article e18777)
15. Hebart H., Bollinger C., Fisch P., et al. Analysis of T-cell responses to Aspergillus fumigatus antigens in healthy individuals and patients with hematologic malignancies // Blood. - 2002. - Vol. 100, №13. - P. 4521-4528.
16. Park S.J. and Mehrad B. Innate immunity to Aspergillus species // Clin. Microbiol. Rev. - 2009. - Vol. 22, №4. - P. 535-551.
Поступила в редакцию журнала 09.09.2014
Рецензент: Н.В. Шабашова
