CC BY
9УДК612.017:616.77-018.38-089.843:582.282.123.4
прогностическое значение
иммунологических
показателей у реципиентов трасплантатов аллогенных
гемопоэтических
стволовых клеток c инвазивным аспергиллезом
1Шадривова о.В. (асс. кафедры)*, 2фролова Е.В. (зав. лаб.), 2учеваткина А.Е. (с.н.с.), 2филиппова л.В. (н.с.), 3Волкова А.г. (пульмонолог), 3Попова м.о. (врач-гематолог), 3зубаровская л.с. (зав. отд.), Богомолова т.с. (зав. лаб.), 2Васильева н.В. (директор нии, зав. кафедрой), Афанасьев Б.В. (директор), 1Климко н.н. (зав. кафедрой)
Северо-Западный государственный медицинский университет им. И.И. Мечникова: 1 кафедра клинической микологии, аллергологии и иммунологи и 2 НИИ медицинской микологии им. П.Н. Кашкина; 3Институт детской гематологии и трансплантологии имени Р.М. Горбачёвой СПбГМУ им. И.П.Павлова, Санкт-Петербург, Россия
©Коллектив авторов, 2015
Инвазивный аспергиллез возникает преимущественно у гематологических больных на фоне выраженного иммунодефицита. Впервые мы представляем результаты исследования динамики иммунологических показателей у реципиентов трансплантатов аллогенных гемопоэтических стволовых клеток (алло-ТГСК) в зависимости от исхода инвазивного аспергиллеза. Установлены особенности иммунного реагирования у больных с неблагоприятным исходом: снижение абсолютного числа Т-лимфоцитов, естественных киллеров и угнетение продукции провоспалитель-ных цитокинов ИФН-у, ФНО-а, ИЛ-17 и ИЛ-6. Прогностически значимыми маркерами благоприятного исхода инвазивного аспергиллеза являются абсолютное количество Т-хелперов СП4+ > 0,170109/л и способность клеток крови к продукции ФНО-а > 204 пг/мл.
Ключевые слова: алло-ТГСК, иммунный ответ, инвазивный аспергиллез
Контактное лицо: Шадривова Ольга Витальевна, тел. (812) 303-51-46
prognostic meaning
of immunological indexes in recipients of allo-hematopoietic stem cell
transplantation with invasive aspergillosis
1 shadrivova o.v. (assistent of the chair), 2 Frolova E.v. (head of the laboratory), 2 Uchevatkina A.E. (senior scientific collaborator), 2 filippova L.v. (scientific collaborator), 3 volkova
A.G. (pulmonologist), 3 Popova M.o. (hematologist), 3Zubarovskaya L.s. (head of the department), 2 Bogomolova T.s. (head of the laboratory), 2 vasilyeva N.v. (director of the institute, head of the chair), 3Afanasyev
B.v. (director), 1 Klimko N.N. (head of the chair)
North-Western State Medical University named after I. I. Mechnikov: 1Chair of Clinical Mycology, Allergology and Immunologists and 2P.N. Kashkin Research Institute of Medical Mycology; 3R.M. Gorbacheva Institute of Hematology and Transplantology of State Medical University named after I. P. Pavlov, Saint-Petersburg, Russia
©Collective of authors, 2015
Invasive aspergillosis occurs mainly in hematological patients with previous immunodeficiency. For the first time we present the study results of immunological parameters dynamic, depending on the outcome of invasive aspergillosis in allo-HSCT recipients. The immune response features in patients with poor outcome were: reduction in the absolute number of T-lymphocytes, natural killer cells and inhibition of proinflammatory cytokines IFN-y, TNF-a, IL-17 and IL-6 production. The absolute number of T-helper CD4 + cells > 0,170109/l and the ability of cells blood to the TNF-a production > 204 pg/ml are diagnostically significant markers allowing a high probability to predict favorable outcome of invasive aspergillosis.
Key words: allo-HSCT, hematological malignancies, immune response, invasive aspergillosis
введение
Инвазивные микозы (ИМ), в том числе вызванные Aspergillus spp., остаются актуальной клинической проблемой. В настоящее время возрастает число иммунокомпрометированных пациентов с высоким риском развития оппортунистических инфекций. Это обусловлено не только совершенствованием методов диагностики и успехами в лечении инфекционных осложнений, но и широким применением при онкогематологических заболеваниях трансплантации аллогенных гемопоэтических стволовых клеток (алло-ТГСК), иммуносупрессивной и
■
цитостатической терапии. Инвазивный аспергиллез (ИА) - один из наиболее распространенных вариантов ИМ; ежегодно в мире различными формами аспергиллеза заболевает более 200 тысяч человек. Тем не менее, с учетом возможной гиподиагностики, эти цифры могут представлять собой лишь 50-65% от фактически происходящих случаев [1, 2].
Известно, что у онкогематологических больных ИА возникает на фоне иммунологических нарушений, которые обусловлены, с одной стороны, спецификой фонового заболевания, с другой - ятрогенной иммуносупрессией [3]. Общепризнанными факторами риска развития ИА являются трансплантация органов и тканей и последующая терапия с использованием циклоспорина, такролимуса и глюкокор-тикостероидных препаратов (ГКС) [4]. По данным созданного в Санкт-Петербурге регистра, среди больных ИА преобладают пациенты с гемобласто-зами, которые составляют 88%, из них более трети - реципиенты алло-ТГСК [5]. Риск возникновения ИА у реципиентов алло-ТГСК варьирует от 3% до 23% и зависит от типа донора и выраженности проявлений реакции «трансплантат против хозяина» (РТПХ) [6, 7]. ИА - тяжелое осложнение, несмотря на раннюю диагностику и адекватную антимикоти-ческую терапию, летальность остается чрезвычайно высокой и достигает при различных клинических вариантах 20-95% [1].
Установлено, что тяжесть клинических проявлений и прогноз ИА у гематологических больных зависят не только от локализации и распространенности инфекционного процесса, но и от степени выраженности предшествующего иммунодефицита, обусловленного цитостатической или иммуносупрессивной терапией [8, 9]. Однако на сегодняшний день описаны лишь единичные исследования, основанные преимущественно на экспериментальных данных, посвященные изучению особенностей иммунного реагирования при аспергиллезной инфекции [10, 11]. Не исследовано влияние иммунологических нарушений на течение и прогноз ИА у гематологических больных, нет надежных критериев прогнозирования течения заболевания и определения сроков окончания антифунгальной терапии при сохраняющейся имму-носупрессии.
Цель исследования - определить прогностическое значение иммунологических показателей при инвазивном аспергиллезе у реципиентов алло-ТГСК.
материалы и методы
Обследовано 35 реципиентов алло-ТГСК в возрасте от 18 до 59 лет (медиана - 26), мужчин - 18 (51%), женщин - 17 (49%), у которых в ходе исследования проследили динамику иммунологических показателей. С учетом исхода заболевания, пациенты были отнесены к двум группам: в группу I включили больных, у которых в течение 12-месячного периода наблюдения была достигнута ремиссия и отменена антимикотическая терапия (п=15); группу II состави-
ли больные с неблагоприятным исходом (n=20).
Основанием для включения пациентов в исследование была постановка диагноза «вероятного» или «доказанного» ИА на основании критериев EORTC/ MSG, 2008 [12]. При обследовании больных использовали клинические, лабораторные (серологические, микробиологические, патоморфологические) и инструментальные методы диагностики. Для выявления очагов поражения проводили компьютерную томографию (КТ) органов грудной клетки в режиме высокого разрешения, по показаниям - КТ придаточных пазух носа и брюшной полости, магнитную резонансную томографию головного мозга. Для получения материала для лабораторных исследований выполняли фибробронхоскопию с взятием бронхо-альвеолярного лаважа (БАЛ), по показаниям - плевральную и люмбальную пункции, пункцию придаточных пазух носа (ППН) и биопсию тканей.
Микологическое исследование включало микроскопию и посев патологического материала из очагов поражения. Из образцов биосубстратов готовили препараты, которые просматривали в люминесцентном микроскопе, отмечая наличие септированного мицелия, ветвящегося под углом 45°. Посев патологического материала осуществляли на специализированные среды и инкубировали при +37 °С и +28 °С в течение 10 дней. Идентификацию культур Aspergillus spp. проводили по морфологическим и физиологическим свойствам в соответствии с определителями грибов (De Hoog G.S. et al., 2000). Из операционного и биопсийного материала готовили гистологические препараты, окрашивая срезы гематоксилином-эозином, выполняли PAS-реакцию и окраску по методу Гомори-Грокотта для выявления элементов гриба. Галактоманнан (ГМ) определяли в сыворотке крови и БАЛ иммуноферментым методом с использованием специфической диагностической тест-системы PLATELIA® Aspergillus (BIO-RAD Laboratories, США). Наличие ГМ оценивали путем сравнения оптической плотности исследуемого материала и контрольного образца, содержащего 1 нг/мл ГМ. Диагностически значимым считали индекс выше «0,5» в сыворотке крови и выше «1,0» - в БАЛ [13].
Базовое иммунологическое исследование проводили гематологическим больным на ранней стадии заболевания (через 1-4 недели от постановки диагноза ИА, медиана - 14 дней), динамику показателей оценивали через 2-3 месяца и на момент ремиссии ИА (перед отменой антимикотической терапии).
Состояние иммунореактивности оценивали по показателям клеточного и гуморального звеньев иммунного ответа, а также факторов врожденной резистентности организма. Субпопуляционный состав лимфоцитов определяли иммуноцитохимическим методом с использованием моноклональных антител «DAKO». Киллерную активность нейтрофилов устанавливали с применением референтного штамма C. albicans. Продукцию ИФН-у, ИЛ-6, ИЛ-10, ИЛ-17, ФНО-а, Г-КСФ выявляли с помощью коммерче-
ских иммуноферментных тест-систем («Цитокин», «Вектор-Бест», Россия) в супернатантах клеток крови после 24-часовой индукции фитогемагглютини-ном. Уровни иммуноглобулинов в сыворотке крови оценивали нефелометрическим методом на анализаторе белков «Turbox plus».
Полученные в процессе исследования медико-биологические данные обрабатывали с помощью программной системы STATISTICA 6.0. Для оценки диагностической значимости иммунологических показателей в прогнозировании течения ИА использовали ROC-анализ (receiver-operator characteristic) с расчетом площади под кривой (Area Under Curve, AUC). В соответствии с классификацией площадь под ROC-кривой от 0,5 до 0,7 служит показателем невысокой точности теста; при значениях от 0,7 до 0,9 тест может быть применен в практике; при AUC выше 0,9 тест обладает высокой точностью.
Анализ выживаемости проводили по методу Ка-плана-Мейера, для оценки достоверности использовали логарифмический ранговый тест - «log-rank test».
результаты
При анализе фоновых состояний не выявили значительных отличий между группами. Основными фоновыми заболеваниями были острый миелоидный (ОМЛ) - 34 и 35% и острый лимфобластный лейкоз (ОЛЛ) - 34 и 30% соответственно (табл.1).
Таблица 1
фоновые состояния гематологических больных
инвазивным аспергиллезом(%)
Нозологическая форма Группа I Группа II
Острый миелоидный лейкоз 34 35
Острый лимфобластный лейкоз 34 30
Неходжкинская лимфома - 10
Лимфома Ходжкина 20 -
Хронический миелоидный лейкоз - 10
Хронический лимфоцитарный лейкоз 6 -
Миелодиспластический синдром 6 10
Апластическая анемия - 5
Другими фоновыми состояниями были лимфомы (20 и 10%), хронический лейкоз (6 и 10%), миелоди-спластический синдром (6 и 10%), в единичных случаях - апластическая анемия.
Пациентам проводили алло-ТГСК: неродственную - 53 и 45%, родственную - 20 и 30%, гаплоиден-тичную - 27 и 25% соответственно. У большинства пациентов ИА развился в раннем посттрансплантационном периоде (до 100-го дня), интервал варьировал от 4 до 300 суток, однако для пациентов с неблагоприятным исходом было характерно развитие заболевания в более ранние сроки (медиана - 34 vs 87).
Частота развития РТПХ не отличалась в исследуемых группах и составила 85 и 86%, глюкокортико-стероиды для профилактики или лечения РТПХ применяли у 65% больных (табл.2).
Таблица 2 факторы риска пациентов с инвазивным аспергиллезом
Факторы риска Группа I Группа II Р-уровень значимости различий
нейтропения <0,5-109/л 86% 100%
медиана (дни) 14 (11-15) 21 (16-30) 0,001
лимфоцитопения < 1,0109/л 80»% 100%
медиана (дни) 12 (10-14) 21 (15-29) 0,003
реакция «трансплантат против хозяина» 85% 86%
медиана (дни) 34 (20-216) 87 (25-270) 0,04
предшествующее применение глюкокортико-стероидов 65% 65%
У реципиентов алло-ТГСК ИА развивался на фоне выраженной иммуносупрессии, однако у пациентов с неблагоприятным исходом в 100% случаев выявляли агранулоцитоз и лимфоцитопению, отличающиеся большей продолжительностью (табл.2).
Сопутствующую или недавно перенесенную лабо-раторно подтвержденную бактериальную и/или вирусную инфекцию наблюдали у 73% и 80% пациентов соответственно. Наиболее частыми осложнениями были бактериальный сепсис и цитомегаловирусная инфекция.
На основании критериев (БОИТС/МБв 2008) «вероятный» ИА был диагностирован у 100 и 75%, «доказанный» ИА установлен при аутопсии у 25% больных с неблагоприятным исходом (табл. 3).
Таблица 3
серологическое и микологическое исследование
биосубстратов (%)
Исследование Группа I Группа II
Положительный тест на галактоманнан:
Сыворотка крови 27 30
БАЛ 33 55
СМЖ - 5
Обнаружение мицелия при микроскопии 27 30
Высев возбудителя 33 20
Гистологическое подтверждение / аутопсия - 25
Положительный результат теста на галактоман-нан был получен в сыворотке крови у 27 и 30% больных, БАЛ - у 33 и 55%. Примерно в трети случаев при прямой микроскопии биосубстратов отмечали наличие характерных нитей септированного мицелия, делящегося под острым углом (табл.3). При посеве Aspergillus spp. обнаружили у 33 и 22% пациентов; основными возбудителями были A. fumigatus - у 33 и 43% и A. flavus - у 50 и 14% соответственно; A. niger выделен у 35% больных II группы, в единичных случаях возбудителями были A. ustus и A. nidulans.
Среди клинических вариантов ИА преимущественно развивалось поражение легких - 100 и 95%, однако у 15% пациентов с неблагоприятным исходом диагностировали диссеминированный ИА с поражением центральной нервной системы.
Клинические проявления ИА у гематологических больных обеих групп были неспецифичными. Основные симптомы: рефрактерная к антибиотикам широ-
кого спектра действия лихорадка - у 77%, кашель - у 71% и одышка - у 26%, реже - бронхообструктивный синдром - у 17%. Всего 11% пациентов предъявляли жалобы на кровохарканье, в редких случаях клиническими проявлениями были боли в грудной клетке (5%). При проведении КТ органов грудной клетки в большинстве случаев также определяли неспецифические признаки: инфильтративные или очаговые процессы в одном или обоих легких (82%). Из характерных признаков грибкового поражения легких чаще всего выявляли симптом «матового стекла» -26%, реже отмечали симптом «серпа» - 11% и симптом «ореола» - 9%.
Все пациенты с момента постановки диагноза ИА получали антимикотическую терапию. Основным препаратом, применяемым в качестве стартовой терапии ИА, был вориконазол (80 и 90%), каспофунгин использовали у 20 и 10% пациентов, позаконазол - у 33% больных I группы. Комбинированную терапию (вориконазол + каспофунгин и пр.) назначали 20 и 13%, обычно при прогрессировании ИА на фоне РТПХ. Длительность применения антимикотиков составила 50-260 дней (медиана - 120,5) и зависела от локализации, распространенности инфекционного процесса, а также от особенностей течения фонового заболевания и выраженности РТПХ. Общая 12-недельная выживаемость больных составила 71%, 12-месячная - 43%.
Несмотря на схожие демографические характеристики, локализацию инфекционного процесса и антифунгальную терапию, у пациентов с неблагоприятным исходом чаще отмечали нейтропению и лим-фоцитопению в период, предшествующий возникновению ИА. Для уточнения механизмов нарушений иммунного реагирования мы сравнили иммунологические показатели в исследуемых группах через 1-4 недели от постановки диагноза ИА (табл.4).
Таблица 4
Иммунологические показатели у реципиентов алло-
ТГСК с благоприятным и неблагоприятным исходом
инвазивного аспергиллеза (Медиана - 25%-75%)
Показатели Группа I Группа II
Лимфоциты абс. х109/л) 1,58 (0,3-2,2) 0,25 (0,1-0,66) *
СЭ3+ абс. (х109/л) 1,2 (0,2-1,8) 0,19 (0,06-0,6) *
С04+ абс. (х109/л) 0,42 (0,11-0,73) 0,08 (0,03-0,27)*
СЭ8+ абс. (х109/л) 0,42 (0,11-0,73) 0,08 (0,03-0,27)*
СЭ20+ абс. (х109/л) 0,10 (0,01-0,2) 0,02(0,008- -0,11)*
СЭ16+ абс. (х109/л) 0,17 (0,07-0,28) 0,03 (0,01 -0,1)*
1аД (г/л) 0,31 (0,22-0,62) 0,54 (0,33 -0,76)
№(г/л) 0,57 (0,31-0,88) 0,56 (0,35 -0,96)
№(г/л) 5,4 (3,5-11,9) 5,5 (3,8- 9,6)
НСТ спонтанный (%) 32 (17,0-42,0) 64,6 (52,5- 77,0) *
НСТ активированный (%) 62,0 (46,0-79,0) 85,0 (77,5- 93,5) *
Коэфф. киллинга (%) 10,0 (7,0-12,0) 12,0 (10,0-14,0)
ИФН-у (пг/мл) 470,0 (151,0-1801,0) 44,5 (24,0-127,0)*
ФНО-а (пг/мл) 315,0 (92,0-469,0) 69,5 (4,5-195,5)*
ИЛ-17 (пг/мл) 17,0 (3,0-52,0) 3,0 (1,5-8,0)*
Г-КСФ (пг/мл) 69,0 (32,0-102,0) 27,0 (5,0-116,0)
ИЛ-6 (пг/мл) 224,0 (33,0-554,0) 87,5 (10,5-525,0)
ИЛ-10 (пг/мл) 63,0 (23,0-138,0) 13,5 (2,5-43,0) *
Примечание: представлены медианные значения с интерквар-тильным размахом (25% -75%); *- достоверность различий показателей в исследуемых группах зависимости от исхода ИА (р<0,05).
В результате исследования показано, что у реципиентов алло-ТГСК с неблагоприятным исходом развитие ИА сопровождалось более выраженными иммунологическими нарушениями. При анализе иммунофенотипического спектра лимфоцитов у больных с неблагоприятным течением инфекционного процесса, по сравнению с данными пациентов с благоприятным исходом, установлено достоверное снижение абсолютного числа лимфоцитов за счет всех исследуемых субпопуляций: Т-хелперов СВ4+ (р=0,01), цитотоксических Т-лимфоцитов СБ8+ (р=0,03), естественных киллеров СБ16+ (р=0,04), а также В-лимфоцитов СБ20+ (р=0,03). Несмотря на различия в количестве В-лимфоцитов, уровни иммуноглобулинов достоверно не отличались. Процентное содержание цитотоксических лимфоцитов (СБ8+) было повышено у большинства пациентов. Выявленное усиление дифференцировки Т-лимфоцитов в цитотоксическую субпопуляцию является одним из иммунологических признаков развития РТПХ, которая по клиническим данным установлена у 86% реципиентов алло-ТГСК, включенных в исследование.
Не выявили отличий между группами по показателям, характеризующим количественное содержание нейтрофилов и их киллерную способность. Однако у реципиентов алло-ТГСК с неблагоприятным исходом ИА кислород-зависимые механизмы бактерицидной активности фагоцитирующих клеток были активированы в большей степени, что подтверждено в нашем исследовании повышением показателей НСТ-теста как спонтанного, так и активированного (р=0,001 и р=0,002 соответственно). Возможно, кислород-независимые пути киллерной активности нейтрофилов, обусловленные ферментами, в большей степени, страдают при иммуносупрес-сии, с чем и связано снижение коэффициента кил-линга у гематологических больных ИА. Компоненты кислород-зависимого пути действуют неспецифично (супероксидный анион радикал, пероксид водорода, продукты азотного метаболизма) и, поскольку не являются белковыми структурами, менее подвержены действию иммуносупрессивных препаратов. Таким образом, при дефиците кислород-независимых механизмов, компенсаторно усиливается микробицид-ная активность фагоцитирующих клеток за счет кислород-зависимых механизмов, что и подтверждено в нашем исследовании повышением показателей НСТ-теста. Повышение данных показателей характерно также для хронического воспалительного процесса.
При исследовании цитокин-продуцирующей способности лейкоцитов установлено, что для реципиентов алло-ТГСК с неблагоприятным исходом ИА было характерно достоверное снижение выработки следующих провоспалительных цитокинов: ИФН-у, ФНО-а, ИЛ-17 и противовоспалительного цитокина ИЛ-10 (табл.1). Продукция Г-КСФ и ИЛ-6 также была снижена в данной группе, однако достоверных различий для данных цитокинов не отмечали.
Следовательно, исследованные группы больных различались как по количественным показателям лимфоцитов, так и по функциональной активности, что подтверждено данными корреляционного анализа. Выявили положительную корреляционную связь абсолютного числа Т-хелперов СБ4+, цитотоксиче-ских Т-лимфоцитов и естественных киллеров с их способностью к продукции ИФН-у (г=0,71, г=0,70 и г=0,68, г=0,58 при р < 0,05 соответственно) и абсолютного числа лимфоцитов с ФНО-а (г=0,66; р < 0,05).
При мониторинге иммунологических показателей на разных стадиях инфекционного процесса наблюдали отчетливую тенденцию к повышению абсолютного количества лимфоцитов и продукции цито-кинов у пациентов с благоприятным исходом. Тем не менее, достоверные различия установили только при сравнении базовых показателей больных с данными, полученными на момент ремиссии ИА перед отменой антифунгальной терапии. У реципиентов алло-ТГСК с благоприятным исходом аспергиллезной инфекции в динамике отмечали достоверное повышение абсолютного числа всех субпопуляций лимфоцитов, включая Т-хелперы СБ4+ (р=0,03), (Рис.1).
Рис. 1. Динамика абсолютного количества Т-хелперов СЭ4+ (х109/л) у пациентов с благоприятным исходом ИА
Установлено повышение способности лейкоцитов к продукции ФНО-а (р=0,04) (Рис. 2).
Рис. 2. Динамика ФНО-а (пг/мл) у пациентов с благоприятным исходом
Также наблюдали положительную динамику выработки Г-КСФ (69,0 (32,0-102,0) vs 176 (87-245) пг/ мл; р=0,02), ИЛ-6 (224,0 (33,0-554,0) vs 437 (403-660) пг/мл; р=0,04) и ИЛ-10 (63,0 (23,0-138,0) vs 171 (86-195) пг/мл; р=0,03). Не обнаружили достоверных различий между уровнями ИФН-у и ИЛ-17 при повторных исследованиях.
У больных с неблагоприятным исходом абсолютное количество исследуемых субпопуляций лимфоцитов и способность клеток крови к продукции цитокинов оставались на низком уровне в течение всего периода наблюдения. Полученными данными подтверждена важность мониторинга цитокиново-го статуса для выявления пациентов, имеющих риск прогрессии ИА.
При построении ИОС-кривых отмечали высокую информативность определения абсолютного значения Т-хелперов СБ4+ и способности клеток крови к продукции ФНО-а для прогнозирования ИА: при оценке прогностического значения данных показателей площадь под ИОС-кривой составила 0,744 (р = 0,002) и 0,730 (р = 0,006) соответственно (Рис. 3, 4).
НОС СЪп*/Л1К-Ь744
о о.з V щ м 0.5 л< АТ ш I
шмтйнгч пм [I - ¡жниц]
Рис. 3. КОС-анализ прогностического значения абсолютного числа Т-хелперов (СЭ4+)
ЯОС Смгге/А1К:»<>-Т?0
л -О- -1-1-1-1-1-1-1-1-1
п о.] V м V п.':. ^ о.* до ■
Рис. 4. КОС-анализ прогностического значения способности клеток крови к продукции ФНО-а Полученные результаты служат подтверждением высокой точности теста в соответствии с классификацией площади под ИОС-кривой. На основании
ИОС-кривых для показателей абсолютного значения Т-хелперов СБ4+ и уровня ФНО-а определили точки разделения, соответствующие максимальным значениям чувствительности и специфичности. Для абсолютного значения Т-хелперов СБ4+ точка разделения соответствовала абсолютному количеству -0,170-109/л при специфичности 66,7% и чувствительности 68,4%; для уровня продукции ФНО-а - 204 пг/ мл при специфичности 78,9% и чувствительности 66,7%. Анализом влияния этих показателей на выживаемость больных ИА методом Каплана-Мейера доказано, что абсолютное количество Т-хелперов СБ4+ > 0,170-109/л и уровень ФНО-а > 204 пг/мл являются положительными прогностическими факторами общей 12-недельной выживаемости реципиентов алло-ТГСК (р=0,002 и р=0,003 соответственно).
Следовательно, нашими результатами подтверждено, что у реципиентов алло-ТГСК определение абсолютного количества Т-хелперов СБ4+ и способности клеток крови к продукции ФНО-а на ранней стадии ИА можно эффективно использовать для оценки прогноза заболевания.
обсуждение
Особенность включенных в исследование больных ИА состояла в том, что при лечении фонового гематологического заболевания у них применяли алло-ТГСК и иммуносупрессивную терапию различной продолжительности. Однако в научной литературе отсутствуют данные о совокупном влиянии этих факторов на иммунологические параметры, течение и прогноз ИА.
Клинические и КТ-признаки ИА у обследованных пациентов были неспецифичными. Немногочисленность проявлений инфекционного синдрома у реципиентов алло-ТГСК, вероятно, обусловлена иммуно-супрессивной терапией, в том числе - ГКС, так как при этом значительно угнетается продукция провос-палительных цитокинов [15].
Основными возбудителями были А. fumigatus, А. niger и А. Аауш, что коррелирует с данными других многоцентровых исследований [7, 15].
Для лечения ИА наиболее часто применяли вориконазол (87%), комбинированную терапию использовали у 20% реципиентов алло-ТГСК. Эффективность применения вориконазола доказана в более ранних исследованиях [16]. Полученными нами результатами подтверждено, что использование данного препарата достоверно улучшает выживаемость больных ИА.
Впервые мы представляем результаты исследования динамики иммунологических параметров гематологических больных в зависимости от течения ИА. У большинства пациентов ИА развился в раннем посттрансплантационном периоде (до 100-го дня) - 67%. Известно, что возникновение микотической инфекции у реципиентов алло-ТГСК, как правило, связано с развитием острой РТПХ или нейтропени-ей, индуцированной интенсивной химиотерапией в
предтрансплантационном периоде. В нашем исследовании у большинства больных выявили длительную (более 10 дней) нейтропению и лимфоцитопе-нию в период, предшествующий возникновению ИА. Следовательно, инвазивный микоз развивался у этих пациентов на фоне значительных нарушений иммунного реагирования, что подтверждено также наличием частых инфекционных (бактериальных или вирусных) осложнений, сопутствующих ИА.
Тем не менее, количество клинических исследований, изучающих диагностическое значение иммунологических показателей в прогнозировании течения ИА у гематологических пациентов, немногочисленно. Показано, что повышенное содержание IL-10 в сыворотке крови коррелировало с плохим прогнозом у гематологических больных без нейтропении. Кроме того, было высказано предположение, что ИЛ-10 может выступать в качестве маркера для выявления пациентов с высоким риском развития ИА [10]. Другие исследователи установили, что высокие уровни в сыворотке крови таких провоспалительных цитокинов, как ИЛ-6 и ИЛ-8, могли быть ранними предикторами неблагоприятного исхода ИА, и, наоборот, высокое содержание ИЛ-10, сохраняющееся в течение недели терапии антифунгальными препаратами, коррелировало с благоприятным исходом [11].
В нашем исследовании при сравнении иммунологических показателей у гематологических больных в зависимости от исхода ИА не выявили отличий между группами по абсолютному числу, киллерной активности нейтрофилов и уровням иммуноглобулинов. Наиболее выраженные изменения обнаружили в лимфоидном звене иммунного ответа. У пациентов с благоприятным течением инфекционного процесса достоверно выше абсолютное число всех субпопуляций лимфоцитов и их способность к продукции ИФН-у, ФНО-а, ИЛ-17 и ИЛ-10, по сравнению с данными пациентов с неблагоприятным исходом. При изучении иммунологических показателей на разных этапах ИА подтвердили приоритетное значение в благоприятном течении ИА увеличение абсолютного количества всех субпопуляций лимфоцитов, включая Т-хелперы и повышение уровня продукции ФНО-а, а также Г-КСФ, ИЛ-10 и ИЛ-6.
Однако диагностически значимыми являются абсолютное число Т-хелперов CD4+ и способность клеток крови к продукции ФНО-а, для которых были определены пороговые значения. Анализом влияния этих параметров на выживаемость подтверждено их значение как положительных прогностических факторов общей 12-недельной выживаемости реципиентов алло-ТГСК с ИА.
Полученные данные согласуются с результатами экспериментальных исследований, в которых показано, что ФНО-а способствует поглощению конидий грибов легочными альвеолярными макрофагами зараженных мышей и усиливает разрушение гиф Aspergllus spp. нейтрофилами in vitro, а недостаточная продукция ФНО-а у мышей коррелировала с вы-
сокой летальностью [17].
В результате нашего исследования показано, что на выживаемость реципиентов алло-ТГСК с ИА влияют выраженность иммунологических дефектов и особенности индивидуального иммунного реагирования. Восстановление иммунологических показателей и, как следствие, эффективного иммунного ответа на грибковую инфекцию позволяют с высокой вероятностью прогнозировать благоприятный исход ИА.
выводы
1. Установлены особенности иммунного реагирования у больных с неблагоприятным исходом ИА: снижение абсолютного числа Т-лимфоцитов, есте-
ственных киллеров и угнетение продукции провос-палительных цитокинов ИФН-у, ФНО-а, ИЛ-17 и ИЛ-6.
2. Для эффективного лечения инвазивного аспергиллеза у реципиентов алло-ТГСК необходимо уменьшение иммуносупрессии и восстановление иммунологических показателей: субпопуляции Т-хелперов СБ4+ (р=0,03); повышение способности лейкоцитов к продукции цитокинов ИЛ-10 (р=0,03), ИЛ-6 (р=0,04), ФНО-а (р=0,04) и Г-КСФ (р=0,02).
3. Прогностически значимыми маркерами благоприятного исхода инвазивного аспергиллеза являются абсолютное количество Т-хелперов СБ4+ > 0,170-109/л и способность клеток крови к продукции ФНО-а > 204 пг/мл.
цитированная литература
1. Brown G.D., Denning D.W., Gow N.A. R., Levitz S.M. Hidden Killers: Human Fungal Infections // Sci. Translat. Med. - 2012. - Vol. 4, Issue 165. - P. 1-9.
2. Kleinkauf N., Verweij P., Maiken Arendrup C., et al. Risk assessment on the impact of environmental usage of triazoles on the development and spread of resistance to medical triazoles in Aspergillus species // Technical report of the European Centre for Disease Prevention and Control (ECDC). - 2013. - 17 p.
3. Girmenia С., Micozzi A., Piciocchi A., et al. Invasive fungal diseases during first induction chemotherapy affect complete remission achievement and long-term survival of patients with acute myeloid leukemia // Leukemia Research. - 2014. -Vol. 38. - P. 469-474.
4. Herbrecht R., Bories P., Moulin J. C., Ledoux M. P. Risk stratification for invasive aspergillosis in immunocompromised patients // Annals of the New York Academy of Sciences. - 2012. - Vol. 1272. - P. 23-30.
5. Климко Н.Н., Шадривова О.В., Хостелиди С.Н. и др. Инвазивный аспергиллез: результаты многоцентрового исследования // Онкогематология. - 2014. - № 2. - С. 13-19.
6. Попова М.О., ЗубаровскаяЛ.С., Климко Н.Н., Афанасьев Б.В. Инвазивные микозы при трансплантации гемопоэти-ческих стволовых клеток // Терапевтический архив. - 2012. - № 7. - С. 50-57.
7. Pagano L., Caira M., Candoni A., et al. Invasive aspergillosis in patients with acute myeloid leukemia: a SEIFEM-2008 registry study // Haematologica. - 2010. - Vol. 95, № 4. - P. 644-650.
8. Hebart H., Bollinger C., Fisch P., et al. Analysis of T-cell responses to Aspergillus fumigatus antigens in healthy individuals and patients with hematologic malignancies // Blood. - 2002. - Vol. 100, № 13. - P. 4521-4528.
9. Carvalho A., Cunha C., Bistoni F., Romani L. Immunotherapy of aspergillosis // Microbiol. and Infect. - 2012. - Vol. 18, № 2. - P. 120-125.
10. Roilides E., Sein T., Roden M., et al. Elevated serum concentrations of interleukin-10 in nonneutropenic patients with invasive aspergillosis // J. Infect. Dis. - 2001. - Vol.183 - P. 518-520.
11. Chai L.Y.A., Netea M.G., Teerenstra S., et al. Early proinflammatory cytokines and C-reactive protein trends as predictors of outcome in invasive aspergillosis // J. Infect. Dis. - 2010. - Vol. 202, № 9. - P. 1454-1462.
12. De Pauw B., Walsh T. J., Donnelly J. P., et al. Revised definitions of invasive fungal disease from the European Organization for Research and Treatment of Cancer / Invasive Fungal Infections Cooperative Group and the National Institute of Allergy and Infectious Diseases Mycoses Study Group (EORTC/MSG) Consensus Group // Clin. Infect. Dis. - 2008. - Vol. 46, № 12. - P. 1813-21.
13. Maertens J., Marchetti O., Herbrecht R., et al. European guidelines for antifungal ECIL 3-2009 Update management in leukemia and hematopoietic stem cell transplant recipients: summary of the // Bone Marrow Transplantation. - 2011. -Vol. 46. - P. 709-718.
14. Drgona L., Colita A., Klimko N., et al. Triggers for driving treatment of at-risk patients with invasive fungal disease // J. of Antimicrob. Chemoth. - 2013. - Vol. 68, № 3. - P. 17-24.
15. Nosari A.M., Caira M., PioltelliM.L., et al. Hema e-Chart Registry of invasive fungal infections in haematological patients: improved outcome in recent years in mould infections // Clin. Microbiol. and Infec. - 2013. - Vol. 19, Issue 8. - P. 757-762.
16. Herbrecht R., Denning D.W., Patterson T.F., et al. Voriconazole versus amphotericin B for primary therapy of invasive aspergillosis // The New England J. of Medicine. - 2002. - Vol. 347, № 6. - P. 408-415.
17. Segal H. Role of macrophages in host defense against aspergillosis and strategies for immune augmentation // The Oncologist. - 2007. - Vol. 12, № 2. - P. 7-13.
Поступила в редакцию журнала 27.02.2015
Рецензент: Р.М. Чернопятова
