CC BY
32
ИММУНОЛОГИЯ
ИММУНОЛОГИЯ
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2021
Почтарь Е.В.1, Луговская С.А.1, Наумова Е.В.1, Дмитриева Е.А.2, Костин А.И.3, Долгов В.В.1
ОСОБЕННОСТИ Т- И НК-КЛЕТОЧНОГО ЗВЕНА ИММУНИТЕТА ПРИ ХРОНИЧЕСКОМ ЛИМФОЛЕЙКОЗЕ
1 ФГБОУ ДПО Российская медицинская академия непрерывного профессионального образования Минздрава РФ, 125993, г. Москва, Россия;
2 ГБУЗ «Городская клиническая больница им. С.П. Боткина» Департамента здравоохранения г. Москвы, 125284, Москва, Россия:
3 ГБУЗ «НИИ скорой помощи им. Н.В. Склифосовского Департамента здравоохранения г. Москвы, 129090. Москва, Россия
Гематологические и иммунофенотипические исследования проведены у 30 пациентов с первично выявленным хроническим лимфолейкозом (ХЛЛ), 122 больных - на фоне терапии ибрутинибом и 20 доноров. Субпопуляционный состав Т-лимфоцитов (Th, Tcyt, Treg, T-NK, наивные Т-хелперы, Т-хелперы памяти, TCRyô клетки, активированные Т-лимфоциты) и НК-клеток оценивали на проточном цитометре (FACSCanto II (BD)) с использованием следующей панели монокло-нальных антител: CD45, CD19, CD3, CD4, CD5, CD8, TCRyô, CD127, CD16, CD56, CD57, CD45RA, CD45R0, HLA-DR, CD25. Анализ изучаемых клеточных популяций показал увеличение абсолютного числа Т-лимфоцитов, НК-клеток и их субпопуляций, Т-хелперов (преимущественно за счет Т-клеток памяти), цитотоксических Т-лимфоцитов, регуляторных Т-клеток, TCRyô-Т-лимфоцитов, активированных Т-лимфоцитов, повышение цитотоксического потенциала НК-клеток у пациентов с первично выявленным ХЛЛ по сравнению с показателями доноров. У пациентов на терапии ибрутинибом регистрировалась положительная динамика восстановления субпопуляционного состава Т-лимфоцитов и НК-клеток. При ХЛЛ отмечаются как количественные, так и функциональные изменения субпопуляционного состава Т-лимфоцитов и НК клеток, что свидетельствует о дисрегуляции иммунного ответа, высоком риске развития инфекций. Мониторинг иммунологических показателей при терапии ибрутинибом позволит оценить действие препарата на адаптивный иммунный ответ при ХЛЛ.
Ключевые слова: хронический лимфолейкоз; субпопуляции лимфоцитов; инфекции; ибрутиниб. Для цитирования: Почтарь Е.В., Луговская С.А., Наумова Е.В., Дмитриева Е.А., Костин А.И., Долгов В.В. Особенности Т- и НК- клеточного звена иммунитета при хроническом лимфолейкозе. Клиническая лабораторная диагностика. 2021; 66 (6): 345-352. DOI: http://dx.doi.org/10.51620/0869-2084-2021-66-6-345-352 PochtarE.V.1, LugovskayaS.A.1, NaumovaE.V.1, DmitrievaE.A.2, KostinA.I.3, Dolgov V.V.1 SPECIFIC FEATURES OF T- AND NK-CELLULAR IMMUNITY IN CHRONIC LYMPHOCYTIC LEUKEMIA 1Russian Medical Academy of professional continuous education, 125284, Moscow, Russian Federation; 2SP Botkin Municipal Clinical Hospital, 125284, Moscow, Russian Federation; 3Research Institute of emergency by Sklifosovsky, 129090, Moscow, Russian Federation
Profound immunological dysfunction is the key factor determining the development of infectious complications in chronic lymphocytic leukemia (CLL). The aim of this work is to assess the features of the .subpopulation composition of T-lymphocytes (T-helpers (Th), cytotoxic T-lymphocytes (Tcyt), T regulatory cells (Treg), T-NK cells, naive Th, Th-memory, activated T-lymphocytes, TCRyô cells) and NK cells in peripheral blood of patients with newly diagnosed chronic lymphocytic leukemia (CLL) and receiving ibrutinib therapy.
Hematological and immunophenotypic studies have been performed in 30 patients with previously untreated CLL, 122 patients on ibrutinib therapy and 20 healthy donors. The subpopulation composition of T-lymphocytes (Th, Tcyt, Treg, T-NK, naive T-helpers, memory T-helpers, TCRyô cells, activated T-lymphocytes) and NK cells has been assessed on flow cytometer (FACSCanto II (BD)) using the following panel of monoclonal antibodies: CD45, CD19, CD3, CD4, CD5, CD8, TCRyô, CD127, CD16, CD56, CD57 CD45RA, CD45R0, HLA-DR, CD25. Compared to controls all CLL samples were found to have higher the absolute number of T-lymphocytes, NK cells and their subpopulations, T-helpers (especially of memory T-cells), cytotoxic T-cells, regulatory T-cells, TCRyô T-cells, activated T-lymphocytes, increased cytotoxic potential of NK cells in previously untreated CLL patients. Patients who received ibrutinib therapy have registered a positive trend towards recovery of the subpopulation composition of T-lymphocytes and NK-cells. CLL patients have been found to have quantitative and functional changes in the subpopulations of T-lymphocytes and NK cells, indicating dysregulation of the immune response, and a high risk of developing infections. Monitoring of immunological parameters for ibrutinib therapy make possible to estimate impact of ibrutinib on the adaptive anti-CLL immune response.
Key words: chronic lymphocytic leukemia; lymphocyte subpopulations; infections, ibrutinib.
Для корреспонденции: Почтарь Евгений Владимирович, аспирант каф. клин. лаб. диагностики; e-mail: [email protected]
IMMUNOLOGY
For citation: Pochtar E.V., Lugovskaya S.A., Naumova E.V., Dmitrieva E.A., Kostin A.I., Dolgov V.V. Specific features of T- and NK-cellular immunity in chronic lymphocytic leukemia. Klinicheskaya Laboratornaya Diagnostika (Russian Clinical Laboratory Diagnostics). 2021; 66 (6): 345-352 (in Russ.). DOI: http://dx.doi.org/10.51620/0869-2084-2021-66-6-345-352
For correspondence: Pochtar Evgeniy Vladimirovich, MD, postgraduate student department of clinical laboratory diagnostics; e-mail: [email protected]
Information about authors:
Pochtar E.V., https://orcid.org/0000-0002-3743-3040;
Lugovskaya S.A., https://orcid.org/0000-0002-6405-3422;
Naumova E.V., https://orcid.org/0000-0002-6048-5746;
Dmitrieva E.A., https://orcid.org/0000-0002-3866-4510;
Kostin A.I., https://orcid.org/0000-0001-7542-851X;
Dolgov V.V., https://orcid.org/0000-0003-1537-7444.
Conflict of interests. The authors declare absence of conflict of interests.
Acknowledgment. The study had no sponsor .support.
Received 29.03.2021 Accepted 25.04.2021
Введение. Иммунологическая дисфункция является ключевым фактором, определяющим развитие инфекционных осложнений при хроническом лимфолейкозе (ХЛЛ), являющихся основной причиной в структуре смертности этих пациентов. По данным датского регистра, который включал 10 455 пациентов с ХЛЛ в течение почти 50-летнего периода наблюдения, инфекции являлись основной причиной смерти у 10-20% больных [1]. По данным других исследований она колеблется от 30 до 50% [2 - 4]. Восприимчивость к инфекционным заболеваниям при ХЛЛ выявляется на ранних стадиях заболевания, еще до развития значительной инфильтрации органов и тканей клетками ХЛЛ, гипогаммаглобу-линемии и проведения химиотерапии. Частота тяжелых инфекций у пациентов рефрактерных к иммунохимио-терапии высокая и достигает около 80% [5]. Характер инфекционных осложнений может быть разный - бактериальный, вирусный, грибковый и смешанный [2, 6].
При ХЛЛ клеточно-опосредованный иммунитет всегда нарушен, а частота и тяжесть инфекций коррелируют с прогрессирующей иммунологической дисфункцией. Ключевым фактором, определяющим эту дисфункцию, является влияние клеток ХЛЛ на стромальное микроокружение, которое с одной стороны поддерживает пролиферацию опухолевых клеток, с другой - изменяет функции нормальных В- и Т-лимфоцитов, макрофагов и других клеток стромы [7]. Очевидно, этим же обусловлены многочисленные дефекты, как со стороны специфической (Т- и В-лимфоциты), так и неспецифической иммунной системы (НК-клетки, дисфункция нейтрофи-лов и моноцитов, активность системы комплемента).
Введение моноклональных антител в терапию ХЛЛ, в частности ритуксимаба, дополнительно увеличивает иммуносупрессию, повышая риск возникновения инфекций, которые чаще возникали у пациентов с перси-стирующей нейтропенией [8 - 10]. В последние годы одним из ведущих препаратов в лечении ХЛЛ является ибрутиниб - ингибитор тирозинкиназы Брутона (ВТК). ВТК является центральным звеном передачи сигнала через В-клеточный рецептор (BCR) и активирует множество других сигнальных путей, включая NFkB (транскрипционный фактор каппа би). Ибрутиниб связывается необратимо с ВТК за счет формирования ковалентной связи с цистеином 481 около активного сайта ВТК. При ХЛЛ ибрутиниб подавляет жизнеспособность клеток в клеточных культурах, независимо от присутствия стромальных клеток и цитокинов. Он также снижает
содержание хемокинов CCL3 и CCL4 в плазме крови, повышение которых, как предполагают, есть результат активной передачи сигналов через BCR в клетках ХЛЛ, находящихся в микроокружении лимфатических узлов. Ингибирование BTK ибрутинибом блокирует поступление клеток ХЛЛ в пролиферативные центры лимфатических узлов и способствует их выходу в циркуляцию, что объясняет временный лимфоцитоз в крови после назначения ибрутиниба [11,12]. В последующих исследованиях было установлено, что ибрутиниб ингибирует пролиферацию и индуцирует каспазозависимый апоптоз опухолевых клеток ХЛЛ ex vivo [13]. Терапия ибрути-нибом вызывает вопросы, касающиеся его воздействия на уже имеющийся иммунодефицит - происходит ли дальнейшая иммуносупрессия или наоборот, ибрути-ниб частично восстанавливает иммунный дефект при ХЛЛ. В соответствии с этим, изучение субпопуляцион-ного состава клеток специфической и неспецифической иммунной защиты у нелеченых пациентов ХЛЛ и в динамике лечения ибрутинибом является актуальным для выявления дефектов иммунной системы и установления влияния таргетной терапии на изменения показателей иммунной системы.
Материал и методы. Материалом исследования служила цельная венозная кровь, стабилизированная антикоагулянтом К2-ЭДТА. Взятие крови осуществлялось после подписания пациентами добровольного информированного согласия. Все образцы исследовались в течение двух часов после взятия крови.
В исследование включены 152 пациента с ХЛЛ, наблюдавшихся с января 2018 г. по декабрь 2020 г. в дневном стационаре «Московского городского гематологического центра» ДЗ г. Москвы. Диагноз ХЛЛ установлен в соответствии с рекомендациями ВОЗ (2016 г.) [14].
Среди 152 обследованных пациентов с ХЛЛ неле-ченные больные с первично установленным диагнозом составили 30 человек (I группа). Во II группу включены 122 пациента, получавших ибрутиниб, с длительностью заболевания от 1 до 20,5 лет. Число предшествующих линий терапии (разные флюдарабин-содержащие схемы, лейкеран и др.) во II группе пациентов составляло от 0 до 12 (медиана - 2,5), длительность приема ибрутиниба - от 8 до 58 недель (медиана - 28,9 нед). Контрольную группу составили 20 доноров.
Всем пациентам проводилось исследование общего анализа крови на гематологическом анализаторе ВС6800 (фирма Mindray). Среди пациентов I-й группы
(не получавших терапию) число лейкоцитов колебалось в диапазоне от 8,5*109/л до 153,0*109/л (медиана
- 21,1*109/л), абсолютное число лимфоцитов составило от 5,6*109/л до 145,3*109/л (медиана - 16,4*109/л). Для пациентов II-й группы (на терапии ибрутинибом) колебания числа лейкоцитов составили от 2,3*109/л до 87,2*109/л (медиана- 8,1*109/л), абсолютного числа лимфоцитов - от 0,8*109/л до 81,2*109/л (медиана
- 3,9*109/л). У доноров значения лейкоцитов были от 4,6*109/л до 9,1*109/л (медиана 6,7*109/л), абсолютного числа лимфоцитов - от 1,1*109/л до 2,6*109/л (медиана 1,9*109/л). Иммунофенотипирование лимфоцитов периферической крови выполнялось с использованием 8-цветной панели моноклональных антител на проточном цитометре FACSCanto II (BD Biosciences, США). Панель моноклональных антител включала: CD19 PE, CD3 FITC, CD4 PerCP-Cy5-5, CD8 PerCP-Cy5-5, TCRyô FITC, CD127 APC, CD16 PE-Cy7, CD56 PE, CD57 Pacific Blue, CD45RA PE-Cy7, CD45R0 APC, HLA-DR PE, CD25 PE-Cy7, CD45 APC производства BD Biosciences и Beckman Coulter. В ходе данного исследования определяли субпопуляции Т-лимфоцитов: Т-хелперы (Th), цитотоксические Т-лимфоциты (Tcyt), Т-регуляторные клетки (Treg), Т-НК-клетки (T-NK), Т-хелперы наивные и памяти, активированные Т-лимфоциты и НК-клетки по экспрессии антигенов (табл. 1).
Пересчет абсолютного числа субпопуляций лимфоцитов осуществлялся двух- платформенным методом, исходя из абсолютного количества лимфоцитов в гемограмме и относительного числа субпопуляций лимфоцитов, определяемого методом многоцветной проточной цитометрии.
Обработка статистических данных выполнялась с использованием программы GraphPad Prism (GraphPad Software, Inc., США). Для каждого массива данных проводилась оценка нормальности распределения с использованием критериев Колмогорова-Смирнова и Шапиро-Уилка. При нормальном распределении данных использовались параметрические методы (среднего значения, стандартного отклонения и 95% доверительного интервала). В группах непрерывных данных с парными выборками при числе сравниваемых групп 3 и более - статистический критерий ANOVA повторных измерений. Распределение данных по субпопуляциям Т-лимфоцитов и НК-клеток не соответствовало нормальному закону распределения. В этом случае результаты исследования представлялись в виде медианы, 10% и 90% процентиль и для анализа значимости различий использовались непараметрические методы. В группах непрерывных данных с парными выборками при числе сравниваемых групп 3 и более применялся статистический анализ с использованием теста Краскела-Уоллиса. Критический уровень достоверности нулевой гипотезы принимался равным 0,05.
Результаты. Оценка субпопуляционного состава лимфоцитов периферической крови показала, что в дебюте ХЛЛ (I группа пациентов), несмотря на заметное снижение относительного числа Т-лимфоцитов и НК-клеток, отмечается достоверное значительное увеличение по сравнению с донорами абсолютного количества как Т-лимфоцитов (p<0,0001), так и НК-клеток (p=0,0007), а также субпопуляций НК-клеток (p=0,0142 и p=0,0345, соответственно) (табл. 2, 3). Абсолютное число Т-НК-клеток существенно не менялось и оставалось в пределах нормальных значений.
ИММУНОЛОГИЯ
У пациентов II группы, получавших терапию ибру-тинибом, происходит снижение по сравнению с пациентами I группы абсолютного числа Т-лимфоцитов (p=0,0006), НК-клеток (p<0,0001), цитолитических НК-клеток (p<0,0001), цитокинпродуцирующих НК-клеток (p<0,0001) и увеличение абсолютного количества субпопуляции Т-НК-клеток (p=0,0007) (см.табл.2,3). При этом значения вышеперечисленных субпопуляций достоверно не отличаются от показателей доноров (рис.1).
Увеличение абсолютного количества Т-лимфоцитов у пациентов I группы происходило как за счет повышения числа цитотоксических Т-лимфоцитов (р<0,0001), так и за счет Т-хелперов (р=0,0044). Более выраженное увеличение цитотоксических Т-лимфоцитов по сравнению с Т-хелперами приводило к снижению иммуно-регуляторного индекса (ИРИ). Субпопуляционный состав Т-хелперов отличался повышением числа Т-клеток памяти (р=0,023), в то время как абсолютные значения наивных Т-хелперов достоверно не отличались от таковых у доноров. У пациентов II группы по сравнению с пациентами I группы наблюдалось снижение общего числа Т-хелперов (р<0,0001), значения которых приближались к нормальным (различия с донорами недостоверны), при этом показатели наивных Т-хелперов достоверно снижались ниже нормы (р=0,0003). Количество цитотоксических Т-лимфоцитов у пациентов II группы недостоверно снижались по сравнению с пациентами I группы, оставаясь выше показателей доноров (р=0,0003), приводя к инверсии ИРИ (р<0,0001) (рис.2).
Проведенные нами исследования указывают на достоверное увеличение числа Т-регуляторных клеток (р<0,0001), субпопуляции TCRyô-Т-лимфоцитов (р=0,0128) в I группе пациентов по сравнению с донорами, в то время как во II группе больных наблюдалось достоверное снижение по отношению к пациентам I группы числа Т-регуляторных клеток (р<0,0001) и TCRyô-Т-лимфоцитов (р=0,0215). Различия по данным
Таблица 1
Иммунофенотипическая характеристика исследуемых субпопуляций лимфоцитов
Субпопуляции лимфоцитов CD-маркеры
Т-лимфоциты CD3+
Т-НК-клетки CD3+CD16,56+
Т-хелперы/индукторы CD3+CD4+
Цитотоксические Т-лимфоциты CD3+CD8+
Иммунорегуляторный индекс CD3+CD4+/CD3+CD8+
Наивные Т-хелперы CD3+CD4+CD45RA+
Т-хелперы памяти CD3+CD4+CD45R0+
Регуляторные Т-лимфоциты CD4+CD25+CD127dim"to"neg
Активированные Т-лимфоциты (поздняя активация) CD3+HLA-DR+
Активированные Т-лимфоциты (ранняя активация) CD3+CD25+
ТСИуЗ Т-клетки CD3+TCRyô+
Цитотоксический потенциал (ЦТП) CD8+клеток CD3-CD8+CD57+
НК-клетки: CD3-CD16,56+
НК-клетки цитолитические НК-клетки цитокинпродуцирующие CD3-CD16+CD56-CD3-CD56+CD16-
Цитотоксический потенциал (ЦТП) CD16+клеток CD3-CD16+CD57+
IMMUNOLOGY
показателям по сравнению с донорами являются статистически недостоверными. Кроме того, в I группе пациентов нами выявлено достоверное повышение абсолютного числа активированных Т-лимфоцитов с маркером ранней активации (CD3+CD25+, р<0,0001), и поздней активации (CD3+HLA-DR+, р<0,0001), а также увеличение цитотоксического потенциала НК-клеток (р=0,0167). Во II группе пациентов отмечалось достоверное снижение по сравнению с I группой Т-лимфоцитов с маркерами ранней и поздней активации (р<0,0001), но при этом значения этих популяций оставались достоверно выше
показателей у доноров (р=0,0007 - для CD3+CD25+-клеток и р=0,0079 - CD3+HLA-DR+-клеток). Изменение ЦТП НК-клеток в данной группе пациентов статистически значимо не отличалось от нормы (рис. 3).
Обсуждение. ХЛЛ - В-клеточная опухоль, характеризующаяся выраженной иммунной дисрегуляцией в клеточном и гуморальном звене иммунитета, включая дисфункцию Т-лимфоцитов. Степень подавления иммунитета у нелеченых пациентов ХЛЛ повышается со временем после установления диагноза и связана с про-грессированием заболевания.
Таблица 2
Сравнение субпопуляционного состава Т-лимфоцитов и НК-клеток в исследуемых группах пациентов ХЛЛ и доноров
Абсолютное число клеток (*109/л)
Субпопуляции лимфоцитов ХЛЛ (I группа) ХЛЛ (II группа) Доноры P
(n=30) (n=122) (n=20)
Me (р,0 - PJ Me (p.0 - P90) Me (p.0 - P90)
3,59 1,85 1,48 I/II - 0,0006
Т-лимфоциты (CD3+) (1,35-5,23) (0,74-4,05) (1,02-1,88) I/Д < 0,0001 II/Д - NS
0,13 0,44 0,195 I/II = 0,0007
Т-НК-клетки (CD3+CD16,56+) (0,03-1,02) (0,10-1,62) (0,02-0,47) I/Д - NS II/Д = 0,0018
0,65 0,23 0,28 I/II < 0,0001
НК-клетки (CD3-CD16,56+) (0,29-1,79) (0,07-0,82) (0,09-0,47) I/Д = 0,0007 II/Д - NS
НК-клетки цитолитические (CD3-CD16+CD56-) 0,48 0,17 0,25 I/II < 0,0001
(0,16-1,72) (0,04-0,69) (0,05-0,38) I/Д - 0,0142 II/Д - NS
НК-клетки цитокинпродуцирующие (CD3-CD56+CD16-) 0,37 0,20 0,22 I/II < 0,0001
(0,18-1,06) (0,04-0,57) (0,07-0,43) I/Д - 0,0345 II/Д - NS
1,54 0,77 0,83 I/II < 0,0001
Т-хелперы/индукторы (CD3+CD4+) (0,75-4,13) (0,34-1,98) (0,61-1,19) I/Д - 0,0044 II/Д - NS
0,53 0,13 0,31 I/II <0,0001
Т-хелперы наивные (CD3+CD4+CD45RA+) (0,18-1,96) (0,04-0,45) (0,21-0,58) I/Д - NS II/Д - 0,0003
0,89 0,57 0,49 I/II - 0,0235
Т-хелперы памяти (CD3+CD4+CD45R0+) (0,41-2,11) (0,27-1,31) (0,41-0,74) I/Д - 0,0230 II/Д - NS
цитотоксические Т-лимфоциты (CD3+CD8+) 1,43 (0,38-2,54) 1,05 (0,35-2,92) 0,53 (0,33-0,84) I/II - NS I/Д < 0,0001 II/Д - 0,0003
1,36 0,79 1,65 I/II - 0,0003
ИРИ (CD3+CD4+/CD3+CD8+) (0,60-3,11) (0,41-1,62) (0,89-2,88) I/Д - NS II/Д < 0,0001
0,33 0,01 0,01 I/II < 0,0001
Т- регуляторные (CD4+CD25+CD127tlim-to-neg) (0,05-1,08) (0,0-0,08) (0,0-0,05) I/Д < 0,0001 II/Д - NS
Активированные Т-лимфоциты (CD3+CD25+) 0,56 (0,16-1,3) 0,12 (0,04-0,34) 0,04 (0,02-0,13) I/II < 0,0001 I/Д < 0,0001 II/Д - 0,0007
Активированные Т-лимфоциты (CD3+HLA-DR+) 0,56 (0,21-1,71) 0,21 (0,07-0,48) 0,11 (0,05-0,21) I/II < 0,0001 I/Д < 0,0001 II/Д - 0,0079
0,16 0,07 0,07 I/II - 0,0215
CD3+TCRyS+ (0,04-1,09) (0,001-0,38) (0,02-0,16) I/Д - 0,0128 II/Д - NS
29,7 6,82 0,27 I/II < 0,0001
В-лимфоциты (CD19+) (3,59-75,72) (0,1-19,02) (0,098-0,52) I/Д < 0,0001 II/Д - 0,0055
Примечание. Данные представлены в виде: Ме-медиана, Р - 10% процентиль, Р90- 90% процентиль, п - объем выборки ; р - уровень значимости отличий; «1/11» - между показателями пациентов 1-й и 11-й групп, 1/Д - между показателями пациентов 1-й группы и донорами; 11/Д - между показателями пациентов 11-й группы и донорами ; N - отличия статистически незначимы.
При ХЛЛ отмечается увеличение абсолютного числа Т-лимфоцитов, среди которых регистрируются изменения как в субпопуляционном составе, так и функциональной активности. Роль Т-лимфоцитов в патогенезе ХЛЛ остается до конца не изученной. С одной стороны, Т-клетки способны продуцировать сигналы, способствующие пролиферации и выживаемости опухолевых В-лимфоцитов, с другой стороны они имеют признаки активации и «истощения», включая сверхэкспрессию
ИММУНОЛОГИЯ
ингибирующих молекул, подобных PD-1, CTLA-4 [15].
Согласно нашим данным, у первичных пациентов с ХЛЛ в периферической крови отмечается увеличение Т-лимфоцитов, Т-хелперов, цитотоксических Т-лимфоцитов и натуральных киллеров, что может быть вызвано разными факторами, в том числе и реакцией на аутоантитела, продуцируемых патологическим клоном ХЛЛ [16 - 19]. При ХЛЛ как Т-хелперы, так и цитотоксические Т-лимфоциты отличаются повыше-
Таблица 3
Оценка цитотоксического потенциала цитотоксических Т-лимфоцитов и НК-клеток
Субпопуляции лимфоцитов Абсолютное число клеток (*109/л) P
ХЛЛ (I группа) (n=30) Mean (SD) ХЛЛ (II группа) (n=122) Mean (SD) Доноры (n=20) Mean (SD)
Цитотоксический потенциал CD8+клеток 0,057 0,059 0,038 I/II - NS
(CD3-CD8+CD57+) (0,056) (0,092) (0,07) I/Д - NS
II/Д - NS
Цитотоксический потенциал CD16+клеток 0,153 0,094 0,023 I/II - NS
(CD3-CD16+CD57+) (0,169) (0,130) (0,018) I/Д - 0,0167
II/Д - NS
Примечание. Данные представлены в виде: Меап-среднее значение, SD- стандартное отклонение, п- объем выборки. р - уровень значимости отличий: 1/11 - между показателями пациентов 1-й и 11-й групп; 1/Д - между показателями пациентов 1-й группы и донорами; 11/Д - между показателями пациентов 11-й группы и донорами; Ж - отличия статистически незначимы.
Рис. 1. Соотношение Т-лимфоцитов, Т-НК-клеток, НК-клеток и их субпопуляций в исследуемых группах. Данные представлены в виде медианы и размаха от 24-го до 75-го процентиля.
Рис. 2. Соотношение Т-хелперов, Т-хелперов наивных, Т-хелперов памяти, цитотоксических Т-лимфоцитов и ИРИ (иммуно-регуляторный индекс) в исследуемых группах. Данные представлены в виде медианы и размаха от 24-го до 75-го процентиля.
IMMUNOLOGY
Т- регуляторные активированные Т-лц СШ+ТСКуд+ ЦТП ЦТП
(СЭ25+) (НЬ.4-01*+) С08+ клеток СШб+клеток
Рис. 3. Соотношение Т-регуляторных клеток, активированных Т-лимфоцитов (CD25+ и HLA-DR+), TCRy5-клеток и ЦТП CD8+ и CD16+ лимфоцитов. Данные представлены для 1-4 графиков в виде медианы и размаха от 24-го до 75-го процентиля, для 5 и 6 в виде среднего значения и стандартного отклонения.
нием эффекторной дифференцировки со снижением числа наивных Т-клеток и экспансией эффекторных субпопуляций Т-клеток памяти вне зависимости от активации Т-клеток антигенами. Показано, что при ХЛЛ происходит увеличение всех субпопуляций Т-хелперов - ТЪ1, !Ъ2, ТШ, Т^. Увеличение ТЪ2 коррелирует с прогрессированием ХЛЛ, что предположительно свидетельствует о их значении в поддержании пролиферации опухолевых клеток [18,21]. Изменение фенотипической дифференцировки Т-лимфоцитов обусловлено прямым влиянием на них опухолевых клеток, так же, как и изменения в экспрессии генов, которые индуцируются при культивировании нормальных Т-лимфоцитов с клетками ХЛЛ [18 - 22].
Результаты нашего исследования показали, что суб-популяционный состав Т-хелперов изменялся у первичных больных ХЛЛ за счет повышения как наивных Т-хелперов, так и Т-хелперов памяти по сравнению с контрольной группой. В этой же группе пациентов отмечалось увеличение абсолютного числа Т-регуляторных клеток, которые играют важную роль в снижении противоопухолевого иммунитета, а также субпопуляции ТСЯу5-Т-лимфоцитов [22 - 28]. Сходные изменения были получены другими авторами, изучавшими регулятор-ные Т-клетки в крови и лимфатических узлах больных ХЛЛ, которые отметили их увеличение, что коррелировало с опухолевой нагрузкой [22 - 28].
Количество активированных Т-лимфоцитов, имеющих маркеры ранней и поздней активации, а также цитотоксических Т-лимфоцитов увеличивалось у нелеченых пациентов ХЛЛ, что приводило к снижению иммунорегуляторного индекса. Цитотоксический потенциал этих клеток был также повышен. Несмотря на повышение числа СБ3+СБ8+ клеток при ХЛЛ, многочисленными исследованиями показано, что эти клетки не способны формировать иммунологический синапс с таргетными клетками, характеризуются снижением пролиферативной и секреторной активности. Показано, что СБ3+СБ8+ клетки при ХЛЛ имеют повышенную экспрессию ряда ингибирующих молекул на своей мембране, таких как РБ-1, СБ160, СБ244 и других молекул, которые вовлечены в нарушение формирования иммунологического синапса. Дисфункция Т-лимфоцитов, вызванная влиянием опухолевых клеток ХЛЛ, приводит к
подавлению Т-клеточного иммунного ответа и неадекватному контролю за опухолью [15].
Оценка НК-клеточного звена неспецифического иммунитета при ХЛЛ показала, что у всех исследованных пациентов отмечалось повышение абсолютного числа НК- клеток. Эта популяция лимфоцитов выполняет важные функции в противоопухолевой и противовирусной защите. Данные по изучению НК-клеток при ХЛЛ немногочисленны. Известно, что их повышение коррелировало с хорошим прогнозом течения ХЛЛ, в то же время есть данные, согласно которым клетки ХЛЛ способны избегать цитотоксического эффекта НК-клеток. Клетки ХЛЛ могут также нарушать баланс между активирующими и ингибирующими сигнальными молекулами, продуцируемыми НК-клетками, что приводит к ускользанию и снижению противоопухолевого ответа. Однако, по сравнению с нарушенной функциональной активностью Т-лимфоцитов, цитотоксическая функция НК-клеток, как считают ряд авторов, не изменена [18]. При изучении субпопуляций НК-клеток нами было показано повышение как НК клеток с цитолитической, так и цитокинпродуцирующей активностью, что свидетельствует о повышенной функциональной активности НК-клеток при ХЛЛ. Полученные нами результаты могут свидетельствовать об активации иммунной системы в ответ на опухолевую экспансию клеток при ХЛЛ. Несмотря на это, эффективность активации иммунного ответа может быть нарушена в результате снижения экспрессии костимулирующих антигенов на опухолевых клетках (СБ28, СБ80/СБ86). Имеются данные, что при ХЛЛ нарушение функции Т-клеток является следствием не только нарушения формирования иммунного синапса, но и приобретения клетками «истощенного» фенотипа [15].
Ибрутиниб - ингибитор ВТК, применяется преимущественно у пациентов с рефрактерным ХЛЛ, делецией 17р, а также со значительным числом предшествующих линий терапии. Известно, что ибрутиниб способен также подавлять, индуцируемую ИЛ-2 тирозинки-назу в Т-лимфоцитах, которая имеет большое значение в развитии и функционировании Т-клеток [29]. В ряде работ показано позитивное влияние ибрутиниба на Т-клеточные компартменты, в том числе снижение ре-гуляторных Т-клеток и «псевдо-истощенных» эффек-
торных Т-лимфоцитов, восстановление пролифератив-ной Т-клеточной активности, снижение ингибирующих молекул, таких как PD-1, CTLA-4, повышение активности популяции Th1. В результате терапии ибрутинибом восстанавливалось формирование иммунологического синапса, цитотоксичность Т-лимфоцитов по отношению к клеткам ХЛЛ in vitro [18]. Согласно данным I. G. Solman и соавт. [30] улучшение эффекторных функций Т-лимфоцитов при лечении ибрутинибом может приводить к снижению частоты инфекций при ХЛЛ и/или поддержке адаптивного иммунного ответа. Полученные нами данные показали, что терапия ибрутинибом приводила не только к снижению числа В-лимфоцитов, но одновременно наблюдались значительные изменения в субпопуляционном составе Т- и НК-клеток. Отмечалось достоверное снижение общего числа Т-лимфоцитов, абсолютного числа Т-хелперов, в особенности наивных Т-хелперов, которые снижались ниже нормальных значений. Абсолютное число цитотоксических Т-лимфоцитов имело тенденцию к снижению, тем не менее, оставаясь выше, чем в контрольной группе. На фоне приема ибрутиниба наблюдалось снижение активации Т-лимфоцитов, резкое увеличение числа Т-НК клеток и значительное снижение ИРИ. Такие же изменения регистрировались и в популяции НК-клеток, абсолютное число которых, также, как и их субпопуляций, приближалось к показателям доноров. Анализ изменений со стороны регуляторных Т- клеток показал положительную динамику в сторону снижения их абсолютного числа, что свидетельствует о повышении противоопухолевого ответа при терапии ибрутинибом.
Заключение. Таким образом, эффективное лечение ибрутинибом устраняет имеющийся при ХЛЛ иммунологический дисбаланс, что подтверждается нормализацией показателей клеточного и неспецифического иммунитета, а, следовательно, снижает число инфекционных осложнений.
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Финансирование. Исследование не имело спонсорской поддержки.
ЛИТЕРАТУРА (пп. 1-6, 10, 11, 13,14, 18-28, 30 см. REFERENCES)
7. Семенова Н.Ю., Бессемельцев С.С., Ругаль В.И. Роль дефектов кроветворной и лимфоидной ниш в генезе хронического лимфо-лейкоза. Клиническая онкогематология. 2016; 9(2):176-90. DOI: 10.21320/2500-2139-2016-9-2-176-190.
8. Зотина Е.Н., Малых О.В., Загоскина Т.П. Инфекционные осложнения у больных хроническим лимфолейкозом на фоне лечения алемтузумабом. Фундаментальные исследования. 2011; 9: 404 -7.
9. Козак Д.М. Неоптерин: иммунологический маркер инфекционных осложнений у больных с хроническим лимфолейкозом. Медицина, ветеринария и фармацевтика. 2018; 4: 109-12.
12. Никитин Е.А. Передача сигнала через В-клеточный рецептор: механизмы и ингибиторы. Клиническая онкогематология. 2014; 7(3): 251-63.
15. Бадмажапова Д.С, Гальцева И.В., Звонков Е.Е. Роль иммунологического синапса в биологии хронического лимфолейкоза. Клиническая онкогематология. 2018;11(4):313-8.
16. Исаева Н.В., Зайцева Г.А., Докшина И.А. Характеристики им-мунокомпетентных клеток у больных хроническим лимфолей-козом на этапе диагностики. Медицинская иммунология. 2015; 17(6): 573-8.
17. Казанский Д.Б. Т-лимфоциты в развитии хронического лимфо-лейкоза. Клиническая онкогематология. 2012; 5(2): 85-95.
ИММУНОЛОГИЯ
29. Дмитриева Е.А., Никитин Е.А., Маркова Е.Е., Дмитриева Н.Ю., Пушкин В.В. Частота и факторы, предрасполагающие к инфекциям, у больных хроническим лимфолейкозом, получающих ибрутиниб. Клиническая онкогематология. 2019; 12(4): 438-48.
REFERENCES
1. da Cunha-Bang, C.Simonsen j., Geisler C et al. Improved survival for patients diagnosed with chronic lymphocytic leukemia in the era of chemo-immunotherapy: a Danish population-based study of 10455 patients. Blood Cancer J. 2016; 6(11): e499.
2. Nosari A. Infectious Complications in Chronic Lymphocytic Leukemia. Mediterranean J. of Hematology and Infection Diseases. 2012; 4(1): www.mjhid.org ISSN 2035-3006.
3. Lee J.S., Dixon D., Kantarjian H., Keating M.J., Talpaz P. Prognosis of chronic lymphocytic leukemia: a multivariate regression analysis of 325 untreated patients. Blood. 1987;69: 929-36. PMid:3814821.
4. Molica S. Infections in chronic lymphocytic leukemia : risks factors and impact on survival and treatment. Leuk. Lymphoma. 1994; 13: 203-14. http://dx.doi.org/10.3109/10428199409056283 PMid:8049645.
5. Perkins J.G., Flynn J.M., Howard R.S., Byrd J.C. Frequency and type of serious infections n fludarabine-refractery B-cell chronic lymphocytic leukemia and small lymphocytic lymphoma: implications for clinical trials in this patient population. Cancer. 2002; 94 (7): 2033-9.
6. Sudhoff T, Arning M and Schneider W. Prophylactic strategies to meet infectious complications in fludarabine-treated CLL. Leukemia. 1997; 11: suppl. 2, P38-41 - PMid:9179282
7. Semenova N.Yu., Bessmel'tsev S.S., Rugal' V.I. Role of Defects of Hematopoietic and Lymphoid Niches in Genesis of Chronic Lymphocytic Leukemia. Klinicheskaya onkogematologiya. 2016;9(2):176-90. DOI: 10.21320/2500-2139-2016-9-2-176-190. (in Russian)
8. Zotina E.N., Malykh O.V., Zagoskina T.P. The patients' infectious complications with chronic lymphocytic leukemia during the treatment with alemtuzumab. Fundamental'nye issledovaniya. 2011; 9: 404-7. (in Russian)
9. Kozak D.M. Neopterin: an immunological marker of infections complications in patient with chronic lymphocytic leukemia. Meditsina. VetietinariyaI farmatsevtika. 2018; 4: 109-12. DOI: 10.30889/25234692.2018-04-03-052. (in Russian)
10. Andersen M.A., Moser C.E., Lundgren J., Niemann C.U. Epidemiology of bloodstream infections in patients with chronic lympho-cytic leukemia: a longitudinal nation-wide cohort study. Leukemia. 2018. Published online:13 December 2018. https://doi.org/10.1038/ s41375-018-0316-5.
11. Ponader S., Chen Sh.-Sh., Buggy J.J., Balakrishnan K., Gandhi V., Wierda W.G. еt al. The Bruton tyrosine kinase inhibitor PCI-32765 thwarts chronic lymphocytic leukemia cell survival and tissue homing in vitro and in vivo. Blood. 2012;119(5):1182-9.
12. Nikitin E.A.. B-Cell Receptor Signaling Pathway: Mechanisms and Inhibitors. . Klinicheskaya onkogematologiya. 2014; 7(3): 251-63. (in Russian)
13. Nisar A. Amin, Sriram Balasubramanian, Kamlai Saiya-Cork, Ker-by Shedden, Nan Hu, Sami N. Malek. Cell-intrinsic determinants of ibrutinib-induced apoptosis in Chronic Lymphocytic Leukemia. Clin. Cancer Res. 2017; 23(4):1049-59. doi:10.1158/1078-0432. CCR-15-2921.
14. WHO Classification of Tumours of Haematopoietic and Lymphoid Tissues. International Agency for Research on Cancer.Lyon; 2008.
15. Badmazhapova D.S., Gal'tseva I.V., Zvonkov E.E. Immunological Synapse in the Biology of Chronic Lymphocytic Leukemia. Klinicheskaya onkogematologiya. 2018;11(4):313-8. (in Russian)
16. Isaeva N.V., Zaitseva G.A., Dokshina I.A.. Ftatures of immunocompetent cells in the patients with chronic lymphocytic leukemia at primary diagnosis. Meditsinskaya Immunologiya. 2015;17(6): 573-8. (in Russian)
17. Kazansky D.B. T-lymphocytes in development of chronic lymphocytic leukemia. Klinicheskaya onkogematologiya. 2012; 5(2): 85-95. (in Russian)
18. Hofland T, Eldering E., Arnon P. Tonino K. and S. Engaging Cytotoxic T and NK Cells for Immunotherapy in Chronic Lymphocytic
IMMUNOLOGY
Leukemia. International Journal of Molecular Science. 2019; 20: 4315. doi:10.3390/ijms20174315; www.mdpi.com/joumal/ijms.
19. Pourgheysari B., Bruton R., Parry H., Billingham L., Fegan C., Murray J., Moss P. The number of cytomegalovirus-specific CD4+ T cells is markedly expanded in patients with B-cell chronic lymphocytic leukemia and determines the total CD4+ T-cell repertoire. Blood. 2010; 116: 2968-74.
20. te Raa G.D., Pascutti M.F., Garcia-Vallejo J.J., Reinen E., Remmerswaal E.B.M., ten Berge I.J.M. et al. CMV-specific CD8+ T-cell function is not impaired in chronic lymphocytic leukemia. Blood. 2014; 123:717-24.
21. Palma M., Gentilcore G., Heimersson K., Mozaari F., Nasman-Glaser B., Young E. et al. T- cells in chronic lymphocytic leukemia display dysregulated expression of immune checkpoints and activation markers. Haematologica. 2017; 102: 562-72.
22. Gorgun G., Holderried T.A., Zahrieh D., Neuberg D., Gribben J.G. Chronic lymphocytic leukemia cells induce changes in gene expression of CD4 and CD8 T cells. J. Clin. Investig. 2005; 115: 1797-805.
23. Catakovic K., Gassner F.J.,Ratswohl C., Zaborsky N., Rebhandl S., Schubert M. et al. TIGIT expressing CD4+T cells represent a tumor-supportive T cell subset in chronic lymphocytic leukemia. Oncoimmunology. 2017; 7:e1371399.
24. Qiu L., Zhou Y., Yu Q., Zheng S.,Wang Z., Huang Q. Elevated levels of follicular T- helper cells and their association with therapeutic effects in patientswith chronic lymphocytic leukaemia. Immunol. Lett. 2018; 197: 15-28.
25. D'Arena G., Laurenti L., Minervini M.M., Deaglio S., Bonello L., De Martino L. et al. Regulatory T-cell number is increased in chronic
lymphocytic leukemia patients and correlates with progressive disease. Leuk. Res. 2011; 35: 363-8.
26. De Matteis S., Molinari C., Abbati G., Rossi T., Napolitano R., Ghetti M. et al. Immunosuppressive Treg cells acquire the phenotype of e_ector-T cells in chronic lymphocytic leukemia patients. J. Transl. Med. 2018; 6: 172.
27. Piper K.P., Karanth M., Mc Larnon A., Kalk E., Khan N., Murray J. et al. Chronic lymphocytic leukaemia cells drive the global CD4+ T cell repertoire towards a regulatory phenotype and leads to the accumulation of CD4+ forkhead box P3+ T cells.. Clin. Exp. Immunol. 2011; 166: 154-63.
28. Beyer M., Kochanek M., Darabi K., Popov A., Jensen M., Endl E. et al. Reduced frequencies and suppressive function of CD4CCD25hi regulatory T cells in patients with chronic lymphocytic leukemia after therapy with fludarabine. Blood. 2005; 106:2018-25; PMID:15914560. https://doi.org/10.1182/blood-2005-02-0642.
29. Dmitrieva E.A., Nikitin E.A., Markova E.E., Dmitrieva N.Yu., Ptushkin V.V. Infections in Chronic Lymphocytic Leukemia Patients Treated with Ibrutinib: Incidence and Predisposing Factors. Klinicheskaya onkogematologiya. 2019;12(4):438-48. (in Russian)
30. Solman I., Taylor M., You H., O'Brien S., Mulligan S., Byrd J. et al. Ibrutinib Treatment Improves T-Cell Proliferative Ability and Effector Function in Relapsed/Refractory Chronic Lymphocytic Leukemia (CLL) Patients. Blood. 2018; 132:3114. doi: https://doi. org/10.1182/blood-2018-99-110848).
Поступила 29.03.21 Принята к печати 25.04.21
