CC BY
33Применение микроклонального размножения растений в условиях ЭкоКосмоДома
■ ■ Описана возможность применения микроклонального размножения растений Ш Щ в условиях замкнутой экосистемы ЭкоКосмоДома (ЭКД).
Представлен способ вегетативного размножения растительных культур in vitro, а также обозначены преимущества и недостатки такого подхода для замкнутых экосистем бесконечно долгого существования. Указаны необходимые составляющие для создания условий внедрения данной технологии в закрытом изолированном пространстве.
Ключевые слова: замкнутая экосистема, микроклональное размножение, растения in vitro, фитогормоны, ЭкоКосмоДом (ЭКД).
^ Ш
Введение
Микроклональное размножение растений - альтернативный способ массового производства саженцев за относительно непродолжительный период. Данный метод более предпочтителен по сравнению с обычным вегетативным размножением: черенками и отводками. Основное преимущество - получение за короткое время большого количества оздоровлённых (без патогенных организмов) растений, характеризующихся высокой однородностью. Успех микрокпонального размножения зависит от многих факторов: состава питательной среды, условий культивирования, генотипа маточного растения [1]. Разработка методик быстрого размножения in vitro любых видов растительных культур имеет значимый коммерческий потенциал при реализации данной технологии в промышленных масштабах.
Помимо использования в современном сельском хозяйстве такой способ производства растений может найти широкое применение в искусственных экосистемах, созданных для долгого существования человека. Настоящее исследование особо актуально для функционирования фитоценоза замкнутых экосистем, например ЭкоКосмо-Дома (ЭКД) [2, 3], где поддержание генетически стабильной популяции является неотъемлемой частью сохранения баланса в закрытой среде.
Классические основы микроклонального размножения растений
Микроклональное размножение растений можно условно разделить на несколько этапов:
1) отбор растений-доноров (маточных растений), а также их фитопатологическая диагностика - подбор наиболее генетически здоровых организмов;
2) стерилизация и введение эксплантов в культуру in vitro - перевод растения в пробирку;
3) микроразмножение - получение черенков с большим количеством междоузлий, без корней;
4) укоренение побегов - перенос микрочеренков на новую питательную среду для стимуляции ризогенеза;
5) адаптация полученных растений к полевым условиям.
Для каждого сорта растительной культуры необходим тщательный подбор питательной среды, которая должна содержать минеральные компоненты в различных количествах, сахарозу, агар-агар, а также естественные фитогормоны [4,5]. По функциональному действию различают пять основных групп фитогормонов: ауксины, цито-кинины, гиббереллины, абсцизины и этилен. Ауксины в культуре тканей вызывают рост клеток растяжением, в больших концентрациях - деление клеток, в сочетании с цитокининами - органогенез. В биотехнологии применяют как природные ауксины (индолилуксусная кислота - ИУК), так и синтетические (индолил-3-масляная кислота - ИМК, индолил-3-пропионовая кислота - ИПК, 2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота - 2,4-Д, нафтилуксусная кислота - НУК).
На рисунке 1 представлены стадии роста винограда культурного сорта «маркетт» при микрокпональном размножении. Эксперимент проводился в лаборатории отдела биотехнологий ЗАО «Струнные технологии».
а) б) в)
Рисунок 1 - Стадии роста винограда культурного сорта «маркетт» при микроклональном размножении: а - на стадии пробирки, готовый к адаптации (1-1,5 месяца со стадии черенка); б - на стадии адаптации (одна неделя с момента высадки из пробирки); в - саженец, готовый для посадки в открытый грунт (1-1,5 месяца с момента высадки из пробирки)
Экономическая выгода производства растений in vitro обусловлена несколькими факторами:
• минимальные площади выращивания посадочного материала;
• минимальные затраты трудовых ресурсов;
• минимальные затраты на исходные материалы (достаточно одного растения);
• максимальный выход посадочного материала с одного растения (1000-10 ООО саженцев).
Значимая особенность растений in vitro - это сохранение генетической стабильности и упрощение процесса хранения генетической информации.
Особенности переноса технологии в условия замкнутой экосистемы
Для ЭКД производство растений in vitro может стать неотъемлемой частью существования замкнутого пространства. ЭКД представляет собой систему из двух капсуль-ных цилиндров с взаимообратным вращением вокруг общей оси [3]. Диаметр внешнего цилиндра составляет 500 м, внутреннего - 300 м при длине 500 м. Общая длина сооружения -1 км. Имеющиеся планировки по заселению жилой зоны предусматривают размещение не менее 5000 человек, а при высокоплотной застройке - около 10 000 человек. Данные параметры были учтены при расчёте потребности ЭКД в растениях семи групп: плодовые деревья, овощные культуры, экзотические плодовые растения, водные, продовольственные, технические, лекарственные растения (таблица 1). Помимо обеспечения и поддержания
в фитоценозе такого количества растительных культур технология in vitro позволит сохранить их видовое разнообразие, генетическую стабильность по видовым и сортовым признакам, ускорить способы получения посадочного материала.
Кроме того, ЭКД нуждается в территориях для маточных растений. Площади маточников для культур, размножаемых естественным способом и in vitro, практически одинаковы, однако приживаемость побегов различается. Потери при размножении отводками и черенками составляют до 40-50 %, а при использовании in vitro - 1 %. Ориентировочные участки, необходимые для реализации технологии микроклонального размножения в ЭКД, - 75 мг, около 50 мг потребуется на маточники, 25 мг - на лабораторию (15 мг - на помывочную с автоклавом и для приготовления питательных сред; 10 мг - на небольшую световую комнату для доращивания культур, а также на ламинарный бокс).
Для организации технологии микроклонального размножения в условиях замкнутой экосистемы важно предусмотреть следующее лабораторное оборудование:
• ламинарный бокс;
• автоклав для стерилизации пробирок и колб;
• лабораторные весовые приборы;
• лабораторная посуда;
• реактивы (соли) для приготовления питательных сред;
• световые стеллажи.
В качестве питательной среды для размножения растений в основном применяются среды Мурасиге - Скуга, Андерсона и их незначительные модификации. Основой питательных сред, предназначенных для культивирования
Таблица 1 - Минимальная потребность в растениях для ЭКД
Группы растений Расчётная потребность ЭКД, шт.
1. Плодовые деревья 3000
2. Овощные культуры 100 000
3. Экзотические плодовые растения 10 000
4. Водные растения 500 000
5. Продовольственные растения 200 000
6. Технические растения 200 000
7. Лекарственные растения 200 000
Итого 1213 000
растительных эксплантов, является смесь минеральных солей: соединения азота в виде нитратов, нитритов, солей аммония; фосфора - в виде фосфатов; серы - в виде сульфатов; растворимых солей К+, Ыа+, Саг+, Мдг+. Железо используется в виде хелатов (Ре04 или Рег04 + ЭДТА (этилен-диаминтетрауксусная кислота) или её динатриевая соль (трилон Б)) - наиболее доступной форме для усвоения растительными тканями. Для стимуляции биохимических реакций в клетке применяют биологические катализаторы -витамины группы В (В,, В6, В|г), С (аскорбиновая кислота), РР (никотиновая кислота), мезоинозит.
Состав среды подбирается индивидуально для каждого вида растений, учитывая межсортовые различия.
В лаборатории отдела биотехнологий ЗАО «Струнные технологии» разрабатываются способы производства культурных, декоративных и лекарственных растений (рисунок 2). Для каждой растительной культуры подбираются методы стерилизации и питательные среды с соответствующим содержанием фитогормонов и витаминов.
в)
г)
Рисунок 2 - Растения, полученные методом микроклонального размножения в лаборатории отдела биотехнологий ЗАО «Струнные технологии»: а - шалфей лекарственный [Salvia officinalis); б - жимолость съедобная (Lonicera edulis); в - лаванда узколистная [Lavandula angustifolia); г - лобелия садовая [Lobelia erinus)
Необходимый персонал для лаборатории: два сотрудника со средним образованием (для производства посадочного материала и ухода за растениями); один сотрудник с высшим биологическим образованием (для контроля процесса, а также разработки постановки экспериментов). В отличие от рыночной реализации, в эксперименте отсутствует круглогодичная потребность в саженцах, поэтому занятость сотрудников может быть распределена и на другие работы. Среднее количество черенков, производимых одним сотрудником (с учётом времени на приготовление питательных сред, подготовку посадочного материала, стерилизацию инструментов, мойку посуды), - около 1500 штук в месяц. Доращивание таких черенков до высадки в грунт, включая период адаптации, составляет от месяца (для травянистых растений) до года (для древесных культур). Кустарниковым растениям необходимо около трёх месяцев. Например, после посадки микрочеренка винограда в стерильную питательную среду проходит около месяца, затем 1-1,5 месяца длится период адаптации к условиям почвенного субстрата в световых комнатах, после этого саженцы готовы к высадке в открытый грунт.
Преимущества и недостатки применения технологии микроклонального размножения растений в условиях замкнутой экосистемы
Ввиду того что в замкнутой среде предполагается постоянный дефицит новых растительных культур и необходима наработка их большого количества внутри экосистемы для поддержания должного генетического разнообразия, применение технологии размножения растений in vitrom-ляется оптимальным решением [6]. В лаборатории отдела биотехнологий полностью отработана технология микроклонального размножения винограда культурного четырёх сортов («маркетт», «солярис», «бриана», «кристалл») от черенка до саженца, пригодного для посадки в открытый грунт. Для сравнения процентов выхода жизнеспособных саженцев использована стандартная методика черенкования винограда - одревесневшими черенками. При таком способе приживаемость составила 49 % (49 из 100 черенков), тогда как при высадке растений in vitro - 90 %.
Помимо этого, риск получения генетически нестабильных растений снижается благодаря однородности популяции определённого вида и сорта. Однако по прошествии нескольких лет будет сложно поддерживать семенной фонд (в особенности декоративных и плодовых растений)
в связи с вырождением культур и появлением многочисленных генетических аберраций генома растений. В таблице 2 представлены преимущества и недостатки технологии микроклонального размножения в ЭКД.
Один из недостатков технологии in vitro - необходимость постоянного применения фитогормонов [7]. В лабораторных условиях используются химически чистые соединения, закупаемые у поставщиков, что дешевле и проще. Однако в условиях замкнутой экосистемы могут возникнуть сложности с пополнением нужных компонентов, поэтому следует предусмотреть альтернативные пути их получения.
Таким вариантом является применение штаммов ризосфер ных бактерий Rhizobium leguminosarum как продуцентов ИУК [8]. Помимо задействования данных бактерий в микроклональном размножении их можно использовать как биологическое удобрение для почвы [9]. Для получения гиббереллинов возможно применение штамма микро-мицета Fusarium moniliforme [10]. За 8-10 дней глубинного культивирования максимальная продукция гибберелли-на составляет 400-700 мг в 1 л культуральной жидкости [11]. Для осуществления данной технологии выбранные штаммы вносятся в банк микроорганизмов и хранятся в лаборатории ЭКД.
Выводы
и дальнейшие направления исследования
Замкнутая экосистема требует разработки множества механизмов и систем поддержания самообеспечения. В ЭКД планируется создание лабораторий, которые способны контролировать все биологические процессы, важные для существования экосистемы. Для сохранения популяций
растительных культур и минимизации потерь при их вырождении необходимы неклассические методы размножения. Наладка микроклонального способа в условиях замкнутой экосистемы обеспечит ЭКД всеми видами растений в нужном количестве и предоставит возможность их пополнения. Однако для данной цели следует организовать производство фитогормонов для приготовления различных питательных сред по предложенным методикам (с помощью микромицетов, ризобактерий).
Кроме того, микроклональное размножение будет использоваться для получения каллусных культур и биологически активных соединений из них, что также найдёт широкое применение в условиях замкнутой экосистемы.
Литература
1. Kumar, N. In vitro Plant Propagation: A Review/ N. Kumar, M.P. Reddy // Journal of Forest and Environmental Science. -2011. - Vol. 27, No. 2.-P. 61-72.
2. Юницкий, А.Э. Струнные транспортные системы: на Земле и в Космосе: науч. издание/А.Э. Юницкий. - Силакрогс: ПНБ принт, 2019. - 576 е.: ил.
3. Безракетная индустриализация ближнего космоса: проблемы, идеи, проекты: материалы III междунар. науч.-техн. конф., Марьина Горка, 12 сент. 2020 г./ООО «Астроинже-нерные технологии», ЗАО «Струнные технологии»; под общ. ред. А.Э. Юницкого. - Минск: СтройМедиаПроект, 2021. -516 с.
4. Microclonal Propagation of Plant Process Modeling and Optimization of Its Parameters Based on Neural Network/ OA Ivashchuk [et ail // Drug Invention Today. - 2018. -Vol. 10, No. 3. - P. 3170-3175.
Таблица 2 - Преимущества и недостатки технологии микроклонального размножения растений
Преимущества Недостатки
Поддержание генетического разнообразия
Наработка необходимого количества саженцев Отсутствие потребности в семенном фонде Высокий процент приживаемости Применение питательных сред, нуждающихся в постоянном пополнении; сопутствующее создание новых технологий для получения питательных сред в условиях ЭКД
Ускорение процесса перехода растений от ювенильной стадии развития к репродуктивной Трудоёмкость получения клонов древесных растений, особенно в первые 10-15 лет
Возможность разведения трудноразмножаемых традиционными способами растений
5. Сулейманова, С.Д. Микроклональное размножение плодовых культур [обзор]/С.Д. Сулейманова//Восточноевропейский научный журнал. -2016. - Г 77, №2,- С. 47-54.
6. Rout, G.R. In vitro Manipulation and Propagation of Medicinal Plants / G.R. Rout, S. Samantaray, P. Das // Biotechnology Advances. - 2000. - Vol. 18, No. 2.-P. 91-120.
I. George, EI Plant Propagation by Tissue Culture /EI George, MA Hall, G.-J. De Klerk. - 3rd ed. - Springer, 2008. - Vol. 1: The Background. - P. 514.
8. Кузнецова, EA Применение Rhizobium leguminosarum для получения препарата фитотормонов / ЕА. Кузнецова// Еоризонты биофармацевтики: сб. науч. тр. по материалам VI всерос. науч.-практ. конф., Курск, 30 окт. 2020 г. / Курский гос. мед. ун-т; ред.: В.П. Гзврилюк, Л.П. Лазурина. - Курск КГМУ2020. - С. 23-24.
9. Indole Acetic Acid and ACC Deaminase-Producing Rhizobium leguminosarum bv. trifoliiSNl0 Promote Rice Growth, and in the Process Undergo Colonization and Che mo -taxis / R.B. Bhattacharjee [et all // Biology and Fertility of Soils. - 2012. - Vol. 48, No. 2.-P. 173-182.
10. Gibberellic Acid Fermented Extract Obtained by Solid-State Fermentation Using Citric Pulp byFusarium moniliforme: Influence on Lavandula angustifolia Mill. Cultivated in vitro/ ALL. da Silva [et aL]//Pakistan Journal of Botany. - 2013. -Vol. 45, No. 6. - P. 2057-2064.
II. Штамм микромицета Fusarium moniliforme - продуцент фитотормонов гиббереллинов A4, A7: пат. RU 2084531 CI / Г.С. Муромцев, Л.М. Краснопольская. - Опубл. 20.07.1997.
