35УДК 634.12:580.085
РАЗМНОЖЕНИЕ ВИДОВ ЯБЛОНИ С ЦЕЛЬЮ ПОДДЕРЖАНИЯ И СОХРАНЕНИЯ ЖИВЫХ КОЛЛЕКЦИЙ
Чурикова О.А., канд. биол. наук Ванина Л.С., науч. сотрудник Мурашев В.В., канд. биол. наук
Московский государственный университет имени М. В. Ломоносова, Москва, Россия, vvmur@hotbox.ru
Аннотация
Наряду с традиционными способами размножения приведены результаты микроклонирования перспективных видов яблони.
Ключевые слова: виды яблони, создание и поддержание коллекций in vivo и in vitro
PROPAGATION OF MALUS MILL. SPECIES FOR MAINTENANCE AND CONSERVATION OF LIVING COLLECTIONS
Churikova O.A., candidate of biology sciences Vanina L.S., scientist
Murashev V.V., candidate of biology sciences
Lomonosov Moscow State University, Moscow, Russia, vvmur@hotbox.ru Abstract
Along with the traditional apple breeding methods the results of micropropagation are given.
Key words: apple trees species, the maintenance and conservation of collections in vivo and in vitro
Яблоня - старинная и любимая культура в России с многолетней историей. Первые достоверные сведения о яблоневых садах на Руси относятся к XI в., времени Ярослава Мудрого. Крупные яблоневые сады были заложены в России в XIX - XX вв. Известны старые русские корнесобственные сорта (Чулановка, Белевое, Саратовское красное, Сладкое, Скороспелка красная, Зуйка, Ветляковское и др.), которые в течение многих лет размножались корневой порослью и сохраняли свои сортовые особенности (Рылов, Стеркин, 1987). Сейчас яблоню выращивают повсюду, где только позволяют зимние погодные условия. В нашей стране эта культура занимает до 70% общей площади садов.
Живая коллекция яблони (семейство Rosaceae, подсемейство Maloideae, род Malus Mill.) широко представлена на территории Ботанического сада биологического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова на Ленинских горах. Ботанический сад расположен на юго-западе Москвы. Участок имеет небольшой склон к северо-западу, окружен лесозащитной полосой шириной 10 м, что способствует формированию своеобразного микроклимата. Почва суглинистая, с тяжелой глинистой подпочвой, окультуренная при закладке сада.
Коллекция яблони насчитывает около 200 сортов (по б деревьев каждого сорта), в том числе:
- 45 сортов яблони селекции сотрудников лаборатории генетики и селекции кафедры высших растений Биологического факультета МГУ;
- 13 сортов яблони народной селекции;
- сорта отечественных и зарубежных селекционеров.
Особое место занимает коллекционный участок «Дикорастущие родичи культурной яблони», который был заложен и экспонируется с 1974 г. и до настоящего времени не менял своего местоположения. Цель создания этой уникальной коллекции - сохранение генетического потенциала рода Malus и выделение по итогам длительной интродукции перспективных образцов для разнообразных практических целей. Она является основой для проведения широкого спектра научных исследований, в частности, по изучению и сохранению биоразнообразия, селекционной работы, разработке рекомендаций по внедрению
высокодекоративных видов в практику озеленения (Ванина, Вартапетян, 2010) и др. Дикорастущие яблони устойчивы к морозам, засухе, болезням, выносят запыление, загазованность воздуха и засоление почвы. Они способны к регенерации после зимних повреждений, хорошо переносят обрезку и стрижку. Дикой яблоне свойственен высокий уровень независимости органогенеза от внешних условий (Джангалиев, 1977), что свидетельствует об ее перспективности для введения в культуру путем вегетативного размножения. Так, в настоящее время на территории МГУ взамен высаженных в 50-е гг. прошлого века плодовых яблонь, утративших свои габитуальные качества, проводится посадка дикорастущих видов и форм. Большое разнообразие морфологических признаков, определяющих декоративный эффект, делает дикорастущие яблони красивыми на протяжении практически всего вегетационного периода - от фазы бутонизации до плодоношения.
Известно, что особую ценность представляют дикорастущие родичи растений, относящихся к одному роду с культивируемыми, т.к. именно они могут использоваться для улучшения сортимента имеющихся и вновь создаваемых культурных сортов (Ванина, 1997). Формирование коллекции шло по пути возможно более широкого представительства географического и систематического разнообразия рода. Каждый видообразец представлен тремя экземплярами. Коллекция насчитывает 44 видообразца из 5 основных географических центров их видового разнообразия - Европы (3 вида и 1 гибридная форма), Средней Азии (2 вида и 1 гибридная форма), Сибири и Дальнего Востока (4 вида), Западного побережья Северной Америки (4 вида и 2 гибридные формы). Наиболее широко представлена группа видов Восточной Азии (9 видов и 16 гибридных форм). Всего 22 вида и 20 гибридных форм, входящих в 5 секций рода Malus: Gymnomeles Rehd., Eumalus Zabel., Sorbomalus Zabel., Chloromeles Rehd., Docyniopsis Schneid. (Лангенфельд, 1991) и растения, полученные из ботанических садов, из коллекций Майкопской и Павловской станций.
Исходным материалом для создания коллекции служили черенки, семена Всесоюзного института растениеводства имени Н.И. Вавилова, из экспедиционных поездок. В качестве подвоя при первичной закладке участка использовали сеянцы китайки «Есаул Ермака», а размножали - с помощью летней окулировки (глазком). В последующие годы при необходимости замены выпавших растений, для расширения и пополнения коллекции применяли методы весенней копулировки с использованием в качестве подвоя сеянцев Антоновки обыкновенной или анисов.
В наши дни все большую популярность приобретает зимняя прививка плодовых культур, как ведущий способ получения посадочного материала (Савин, 2015). Для традиционного способа вегетативного размножения - прививки яблони стеблевыми черенками или почкой со щитком, взятой с побега, требуется наличие прививочного материала в виде стеблевых побегов, которые не всегда есть. Неодинаковое состояние деревьев одного и того же сорта в посадках, очевидно, обусловлено качеством подвоев. При этом бывает трудно получить стандартный посадочный материал, так как существует риск накопления и передачи инфекции. Использование современных биотехнологических приемов, а именно, технологии микроклонального размножения, позволяет решить проблему получения высококачественных оздоровленных корнесобственных саженцев в сравнительно короткие сроки. Эта технология, несомненно, имеет значительные преимущества перед традиционными способами вегетативного размножения растений (Чурикова, Мурашев, 2010) и открывает новые возможности сохранения генофонда в условиях in vitro.
Все работы проводились по общепризнанным методикам (Программа и методика сортоизучения плодовых культур, 1999). Данные, использованные в работе, были получены в результате длительных (от 10 до 50 лет) полевых наблюдений и лабораторных исследований.
Изучались биологические, морфологические, биохимические показатели видов коллекции. Особый интерес представляли инорайонные виды группы Восточной Азии, нетрадиционные для нашей климатической зоны. Именно в этой группе видов отмечен огромный полиморфизм всех изучавшихся признаков, связанный с тем, что эта географическая группа включает виды и формы различной систематической принадлежности. Остальные географические группы были более однородны.
Объектом наших исследований послужили следующие виды дикорастущих яблонь из коллекции Ботанического сада МГУ: M. sylvestris Mill., M. transitoria (Batal.) Schneid., M. spectabilis (Ait.) Borkh., M. pumila var. pendula Mill., M. sargentii Rehd. и M. chamardabanica V. Vartapetjan et L. Solovjeva из коллекции БС МГУ. Для введения в стерильную культуру использовали зеленые черенки, срезанные в мае-июне, в наиболее оптимальные, по нашим наблюдениям, сроки. В качестве первичных эксплантов брали узлы побега с пазушными почками. Их замачивали в растворе фундазола, промывали в проточной воде, после чего подвергали поверхностной стерилизации. Подробно методика описана ранее (Чурикова, Мурашев, 2015). Для индукции морфогенеза использовали среду по прописи Мурасиге и Скуга (MS) (Murashige, Skoog, 1962) или Кворина и Лепуавра (QLM) (Quoirin, Lepoivre, 1977) с добавлением 0,5 мг/л бензиламинопурина (БАП). При помещении изолированных почек на среды практически на следующий же день наблюдалось выделение эксплантами токсичных веществ, прежде всего, фенольного метаболизма, что приводило к подавлению роста первых. В связи с этим возникала необходимость переноса эксплантов на свежую питательную среду или
использования антиоксидантов для ингибирования синтеза фенольных соединений. Сформировавшиеся микропобеги в дальнейшем использовали для размножения на среде, содержащей 2 мг/л БАП. С целью индукции ризогенеза побеги, в среднем, 2 см высотой помещали на разбавленную вдвое среду QLM с пониженным содержанием сахарозы (20 г/л) и добавлением 2 мг/л индолилмасляной кислоты (ИМК).
Полученные и укорененные in vitro растения-регенеранты высаживали в предварительно простерилизованную смесь торфа, песка и дерновой земли в соотношении 1:1:1. Высаженные растения постепенно адаптировали к условиям in vivo под пленочным укрытием при температуре +24-27°С, влажности 90-100% и 16-часовом фотопериоде. Спустя 2,5-3 недели растения начинали закаливать, ненадолго приоткрывая пленку и снижая, тем самым, влажность. Для успешного роста и развития растения подкармливали разбавленным в 2-3 раза раствором универсального комплексного удобрения (например, Флоргумат). Адаптированные таким образом и подрощенные растения были готовы к высадке на участок в условия открытого грунта. Изучение оптимальных условий введения в культуру in vitro 6 видов дикорастущих яблонь из коллекции Ботанического сада МГУ показало, что обе использованные питательные среды (MS и QLM) пригодны для индукции стерильной культуры. Негативное влияние соединений фенольного метаболизма, приводящих к ингибированию роста первичных эксплантов, удалось преодолеть посредством добавления в питательную среду 20 мг/л лимонной кислоты. Сформировавшиеся микропобеги и конгломераты почек и побегов использовали для дальнейшего размножения. С целью достижения наибольшего коэффициента размножения мы использовали прием снятия апикального доминирования за счет удаления верхушки побега, что приводило к увеличению числа формировавшихся de novo микропобегов. Наряду с этим, для индукции пролиферации пазушных меристем в среду добавляли вещества цитокининовой группы, а именно, БАП в концентрации 2 мг/л. Пассировали материал каждые 3-4 недели. При помещении на свежую питательную среду наблюдали активизацию роста эксплантов, развитие пазушных почек и формирование множественных микропобегов.
Одним из наиболее важных этапов микроклонального размножения является укоренение полученных in vitro побегов. Для индукции ризогенеза использовалась менее богатая по минеральному составу питательная среда QLM, разбавленная вдвое, с пониженным содержанием сахарозы (20 мг/л) и добавлением 1 мг/л ИМК. При этом не происходило каллусообразования, а наблюдалось формирование разветвленной корневой системы. Отмечены индивидуальные реакции различных генотипов в условиях in vitro, в частности, на этапе укоренения. Нами были получены и впоследствии успешно адаптированы корнесобственные растения-регенеранты M. x spectabilis и M. transitoria. В настоящее время продолжаются исследования по оптимизации технологии микроклонального размножения остальных четырех видов яблонь, которые, в частности, не столь легко поддаются индукции корнеобразования. Результаты исследований будут способствовать оптимизации эффективного размножения яблонь, поддержанию и сохранению коллекции in vivo и in vitro.
Настоящая работа была выполнена в рамках Госзадания Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова (тема № АААА-А16-116021660105-3).
Литература
1. Ванина Л.С. Перспектива использования видового потенциала рода Malus Mill. в условиях средней полосы России // Растительные ресурсы. 1997. Т.4. С. 80 - 85.
2. Ванина Л.С., Вартапетян В.В. Дикорастущие яблони.- М.: Т-во науч. изд. КМК, 2010.- 84 с.
3. Джангалиев А.Д. Дикая яблоня Казахстана. - Алма-Ата: Наука Каз. ССР, 1977. - 33 с.
4. Лангенфельд В.Т. Яблоня. Морфологическая эволюция. Филогения. География. Систематика. - Рига: Зинатне, 1999. - 234 с.
5. Программа и методика сортоизучения плодовых культур. Орел: ВНИИСПК, 1999. - С. 59-68.
6. Рылов Г.П., Стеркин И.В. Путешествие за сортом. М.: Агропромиздат, 1987. 221 с.
7. Савин Е.З. Зимняя прививка плодовых культур. Оренбург: ФГБОУ ВПО ЧГПУ, 2015. - 191 с.
8. Чурикова О.А., Мурашев В.В. Микроклональное размножение декоративных культур. Сирень обыкновенная (Syringa vulgaris L.): учебно-методическое пособие. - М.: изд-во Моск. ун-та, 2010. - 32 с.
9. Чурикова О.А., Мурашев В.В. Биотехнологические приемы сохранения коллекций яблони in vivo и in vitro // Вестник КазНУ, серия экологическая, 2015, № 1/2(43), с.600-606
10. Murashige T., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures / Physiol. Plant, 1962. - 15: 473-497.
11. Quoirin M., Lepoivre P. Etude de milieu adapte aux cultures in vitro // C R Acad. Sci Paris, 1977. - 281: 1309.
