CC BY
46Почвы исследуемых районов города Находка отличались меньшим уровнем содержания металлов. В городе Находка наиболее загрязненными районами являются почвы центральной площади, дачных участков и промышленного предприятия ОАО «Строитель-43».
Литература
1. Голов В.И. Содержание микроэлементов и тяжелых металлов в пахотных почвах Дальнего Востока / В.И. Голов // Вестник Российской академии сельскохозяйственных наук. - 2010. - №4. - С. 17.
2. ГОСТ 17.4.4.02-84 «Охрана природы. Почвы. Методы отбора и подготовки проб для химического, бактериологического, гельминтологического анализа».- 1984.
3. Курбатова А.С., Башкин В.Н. Экологические функции городских почв // М.: Изд-во ООО «Манджента». - 2004. - С. 102.
4. Романов В.И., Романова Р.Л. Выбросы вредных веществ и их опасности для живых организмов. // М.: Физматкнига, - 2009. - C. 166.
5. ISO 11466:1995 «Качество почвы. Экстракция микроэлементов, растворимых в царской водке». - 1995.
СОЗДАНИЕ И ПОДДЕРЖАНИЕ КОЛЛЕКЦИИ ЯБЛОНИ В СТЕРИЛЬНОЙ
КУЛЬТУРЕ
Чурикова Ольга Альбертовна
к. биол. наук, ст. н. сотр. лаб. биологии развития растений, 119991, г. Москва, Ленинские горы,1, стр.12 e-mail: ochurikova@yandex.ru Мурашев Владимир Владимирович к. биол. наук, вед. н. сотр. лаб. биологии развития растений, 119991, г. Москва, Ленинские горы,1, стр.12 e-mail: vvmur@hotbox.ru
Аннотация. В статье приведены результаты исследований по разработке биотехнологических основ создания и поддержания коллекции дикорастущих яблонь в стерильной культуре. Подобраны условия для микроклонального размножения, отмечено проявление индивидуальной реакции различных генотипов яблони на культивирование в условиях in vitro.
Ключевые слова: микроклональное размножение, Malus, биоразнообразие, генетические коллекции
В настоящее время сокращение численности видов, существенная деградация и фрагментация природных местообитаний способствует резкому обеднению биологического разнообразия.
Это в полной мере относится и к яблоне, которая долгое время, как часть лесной флоры, занимала огромные территории СССР. Однако, уже в 70-е гг. отмечалось катастрофическое сокращение площадей под дикими плодовыми. В настоящее время о многих видах яблони можно говорить как об уязвимых и, даже, исчезающих. Такие виды как M. sylvestris Mill., M. sieversii (Ledeb.) M. Roem., M. mandshurica (Maxim.) Kom., M. baccata (L.) Borkh. внесены в региональные Красные книги в разряд редких и сокращающихся видов. Так, дикоплодный вид предгорных яблонь сейчас занесен в Красную книгу Казахстана. В Красной книге СССР (1984) M. niedzwetzkyana Dieck. отмечена в статусе очень редкого вида, находящегося под угрозой исчезновения. В наши дни продолжается обеднение и сокращение ареала дикорастущих яблонь.
Традиционными способами сохранения генетического разнообразия являются создание заповедников, заказников, национальных парков и других природоохранных 12
территорий, формирование коллекций исчезающих видов в ботанических садах, создание семенных банков. Различными способами сохранения уникального природного генофонда могут быть выращивание дикорастущих видов яблонь из семян в природе, в условиях культуры, в коллекциях ботанических садов и других интродукционных центрах, а также внедрение их в практику озеленения [2].
Создание коллекций оздоровленного генетически однородного растительного материала in vitro можно рассматривать как одну из форм охраны природной флоры и как современный эффективный метод сохранения биоразнообразия ex situ, что составляет часть общей стратегии охраны растительных ресурсов [1].
Решать проблемы разрушения природных местообитаний, восстановления численности видов, а также сохранения ценных и уникальных генотипов растений необходимо с использованием новых подходов и технологий. Одним из таких современных подходов является использование биотехнологий, развивающихся высокими темпами и имеющими значительный потенциал.
Создание живых коллекций не только in vivo, но и в стерильных условиях, in vitro, представляется нам одним из наиболее перспективных направлений исследований. Основой для создания таких коллекций является разработка биотехнологических приемов размножения и культивирования растений, в частности, технологии микроклонального размножения, открывающей новые возможности сохранения генофонда растений. Весьма актуальным и необходимым является проведение фундаментальных научных исследований и всестороннее изучение биологических особенностей растений в природных условиях и в коллекциях ботанических садов, а также биологии их возобновления и размножения.
Коллекция яблони в Ботаническом саду Московского университета, заложенная в 1951-1952 гг. на Воробьевых горах, насчитывает в настоящее время более 200 сортов, постоянно обновляется и пополняется наиболее перспективными для Нечерноземья сортами, проводятся селекционные работы. Так, в коллекции представлены 44 сорта, выведенные сотрудниками биологического факультета и ботанического сада [3].
В 1974 г. был создан сад дикорастущих видов и форм яблони из 5 основных географических центров видового разнообразия рода Malus: Европы, Средней Азии, Восточной Азии, Сибири, Дальнего Востока и Северной Америки. В результате 30-летнего изучения дикорастущих интродуцированных в условиях Ботанического сада видов яблони отобраны высокодекоративные формы, наиболее адаптированные к климату Московской области, а также к болезням и вредителям.
Традиционный способ вегетативного размножения сложен и трудоемок. Бывает трудно получить стандартный посадочный материал, так как существует риск накопления и передачи инфекции. Поэтому сегодня в питомниках остро стоит проблема разработки и внедрения наиболее экономичных технологий получения корнесобственных саженцев древесных пород. Однако, несмотря на универсальность технологии микроклонального размножения и множество работ, посвященных этому вопросу, необходимо учитывать биологические особенности каждого конкретного вида, а зачастую, и сорта растений для успешного подбора оптимальных приемов размножения и специфических приемов культивирования.
В лаборатории биологии развития растений МГУ многие годы проводятся исследования по изучению морфофизиологических процессов in vivo и in vitro у древесных и травянистых растений - представителей различных таксономических групп [7], в том числе подсемейства яблоневые (Maloideae или Pomoideae) [4; 5, 6 и др.].
Объектом наших исследований послужили следующие виды дикорастущих яблонь из коллекции Ботанического сада МГУ: M. sylvestris Mill., M. transitoria (Batal.) Schneid., M. spectabilis (Ait.) Borkh., M. pumila var. pendula Mill., M. sargentii Rehd. и M. chamardabanica V. Vartapetjan et L. Solovjeva и др. В качестве первичных эксплантов
13
использовали апикальные и пазушные вегетативные промывали в проточной воде и поверхностно стерилизовали 1,5-3% раствором лизоформина, затем трижды отмывали в стерильной дистиллированной воде. Для индукции культуры подготовленные экспланты помещали на питательные среды по прописи Мурасиге и Скуга (MS) [8] и Кворина-Лепуавра (QLM) [9] с добавлением 0,5-1 мг/л бензиламинопурина (БАП). При помещении изолированных почек на среды практически на следующий же день наблюдалось выделение эксплантами токсичных веществ, прежде всего, фенольного метаболизма, что приводило к подавлению роста первых. В связи с этим возникала необходимость переноса эксплантов на свежую питательную среду. Для ингибирования синтеза фенольных соединений применяли антиоксидант - лимонную кислоту в концентрации 20 мг/л. На такой питательной среде наблюдалось формирование микропобегов, которые в дальнейшем использовали для размножения на среде, содержащей 2 мг/л БАП. С целью индукции ризогенеза сформировавшиеся побеги, в среднем, 2 см высотой помещали на разбавленную вдвое среду QLM с добавлением 2мг/л индолилмасляной кислоты (ИМК).
Полученные и укорененные in vitro растения-регенеранты высаживали в предварительно простерилизованную в сушильном шкафу смесь торфа, песка и дерновой земли в соотношении 1:1:1. Высаженные растения постепенно адаптировали к условиям in vivo под пленочным укрытием при температуре +24-27°С, влажности 90100% и 16-часовом фотопериоде. Спустя 2,5-3 недели растения начинали закаливать, ненадолго приоткрывая пленку и снижая, тем самым, влажность. Для успешного роста и развития растения подкармливали разбавленным в 2-3 раза раствором универсального комплексного удобрения (например, Флоргумат). Адаптированные таким образом и подрощенные растения были готовы к высадке на участок в условия открытого грунта.
Изучение оптимальных условий введения в культуру in vitro видов дикорастущих яблонь из коллекции Ботанического сада МГУ показало, что обе использованные питательные среды (MS и QLM) пригодны для индукции стерильной культуры. Негативное влияние соединений фенольного метаболизма, приводящих к ингибированию роста первичных эксплантов, удалось преодолеть посредством добавления в питательную среду 20 мг/л лимонной кислоты. Сформировавшиеся микропобеги и конгломераты почек и побегов использовали для дальнейшего размножения. С целью достижения наибольшего коэффициента размножения мы использовали прием снятия апикального доминирования за счет удаления верхушки побега, что приводило к увеличению числа формировавшихся de novo микропобегов. Наряду с этим, для индукции пролиферации пазушных меристем в среду добавляли вещества цитокининовой группы, а именно, БАП в концентрации 2 мг/л. Пассировали материал каждые 3-4 недели. При помещении на свежую питательную среду наблюдали активизацию роста эксплантов, развитие пазушных почек и формирование множественных микропобегов (Рис. 1).
Одним из наиболее важных этапов микроклонального размножения является укоренение полученных in vitro побегов. Для индукции ризогенеза использовалась менее богатая по минеральному составу питательная среда QLM, разбавленная вдвое, с пониженным содержанием сахарозы (20 мг/л) и добавлением 1 мг/л ИМК. При этом не происходило каллусообразования, а наблюдалось формирование разветвленной корневой системы. Была отмечена целесообразность переноса полученных побегов непосредственно перед этапом укоренения на среду с уменьшенным содержанием БАП (0,5 мг/л). При этом формировались побеги высотой 2,5-3 см с хорошо развитыми листьями, впоследствии легко укореняющиеся. Нами были получены и успешно адаптированы корнесобственные растения-регенеранты M. x spectabilis, M. transitoria, и M pumila. В настоящее время продолжаются исследования по оптимизации технологии
микроклонального размножения остальных видов яблонь, которые, в частности, не столь легко поддаются индукции корнеобразования.
Рис. 1. Микропобеги M. spectabilis - А и конгломераты микропобегов M. sylvestris -
Б на среде для размножения.
Таким образом, полученные нами результаты исследований являются основой для разработки биотехнологических подходов создания коллекций декоративных яблонь в стерильной культуре.
Работа выполнена при частичной поддержке гранта РНФ №14-50-00029 "Научные основы создания банка депозитария живых систем" (направление "Растения").
Список литературы
1. Андреев Л.Н., Горбунов Ю.Н. Сохранение редких и исчезающих растений ex situ: достижения и проблемы // Изучение и охрана разнообразия фауны, флоры и основных экосистем Евразии. Материалы международной конференции.- М. 2000. _С. 19-23.
2. Ванина Л.С, Вартапетян В.В. Дикорастущие яблони. М.: Т-во научн. изд. КМК, 2010. 84 с.
3. Гусева И.Н., Кочешкова Т.В. Сорта яблони коллекции ботанического сада биологического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова (каталог). М.: Т-во научн. изд. КМК, 2010. 156 с.
4. Исаева И.С. Морфофизиология плодовых растений. Курс лекций. М.: изд-во Моск. ун-та, 1974. 135 с.
5. Набила Мохамед Рамадан Хусейн. Сортовые особенности редукции потенциальной продуктивности яблони на IX-XII этапах органогенеза. Автор. канд. дисс. М.: Биофак МГУ, 1978. 23 с.
6. Челядинова А.И. Закономерности органогенеза кустарников. Учебное пособие. М.: Моск. ун-т, 1976. 40 с.
7. Чурикова О.А., Мурашев В.В. Микроклональное размножение декоративных культур. Сирень обыкновенная (Syringa vulgaris L.): учебно-методическое пособие. - М.: изд-во Моск. ун-та, 2010. - 32 с.
8. Murashige T., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures / Physiol. Plant, 1962. 15:473-497.
9. Quoirin M., Lepoivre P. Etude de milieu adapte aux cultures in vitro / C R Acad Sci Paris, 1977. 281: 1309.
