CC BY
32Принципы создания генетического банка живых организмов для длительного существования замкнутой экосистемы
Представлены принципы создания генетического банка живых организмов (микроорганизмы, растения, животные), особенности их существования в замкнутой экосистеме ЭкоКосмоДома (ЭКД). Рассмотрены теоретические аспекты, предложены возможные решения по поддержанию жизни популяции в условиях изолированного пространства.
Пятакова Т.И. Налетов И.В.
ЗАО «Струнные технологии», г. Минск, Беларусь
Ключевые слова: генофонд, замкнутая экосистема, криоконсервация, лиофилизация, популяция, ЭкоКосмоДом (ЭКД).
УДК 575.174.5
Л ^ Л
£:
I к
14 * ^^^ ^
I: *
I
*
ЩЩ * •
Я г* (
\ , К
1СГ
А*: •
• .Мм
кЛп
Лг
'Г
г
V
Введение
Для бесконечно долгого существования замкнутых экосистем (например, ЭкоКосмоДом (ЭКД) [1,2]) важна продовольственная безопасность людей, т. е. обеспечение достаточным количеством продуктов питания, создание безотходных технологий и сохранение плодородия почв, что может быть достигнуто при ведении племенного хозяйства, семеноводства и при поддержании банка штаммов микроорганизмов.
Любая популяция (микроорганизмы, растения, животные) стремится к появлению гомозиготных линий, которые способны накапливать рецессивные аллели, провоцирующие возникновение заболеваний. Кроме того, в популяциях может происходить кроссинговер, приводящий к изменению генотипа живых организмов, а также к мутациям.
Цель данного исследования - изучение проблематики существования живых организмов (микроорганизмы, растения, животные) на уровне генетической информации и предоставление решений по эффективному поддержанию здоровых популяций в условиях замкнутой экосистемы.
Микроорганизмы
Минеральные удобрения, используемые в современном сельском хозяйстве, имеют свойства накапливаться в грунте путём связанности с другими компонентами и переходить в недоступную для растений форму. При исследовании земель в различных регионах Беларуси отмечается дефицит органических удобрений; содержание гумуса в почве варьируется от 0,9 до 2 % [3]. Вместе с тем сельскохозяйственные предприятия ежегодно перед основными процессами культивирования растений (в период осенней и весенней обработок) вносят минеральные (туковые) удобрения, вызывая засоление почвы и вымывание отдельных элементов в грунтовые воды под действием дождей и талых вод. Подобные технологии не могут и не должны быть внедрены в замкнутой экосистеме ЭКД. Использование альтернативных приёмов, повышающих урожайность сельскохозяйственных культур, является основной концепцией существования ЭКД. Один из таких методов - применение бактериальных препаратов.
Известно, что данные вещества благоприятно влияют на 60-70 % сельскохозяйственных культур. Микроорганизмы улучшают азотное и фосфорное питание растения, способствуют развитию его иммунной системы, а также увеличивают урожай на 20-30 % и более. Кроме того, они частично компенсируют недостаток минеральных удобрений
в почве за счёт поступления азота и фосфора в выращиваемые культуры. Продукты жизнедеятельности микроорганизмов повышают поглотительную и синтетическую активность корневой системы.
Однако активность интродуцированных микроорганизмов связана с их приживаемостью в слоях почвы. От правильного подбора штамма, агрономических смесей и ассоциаций зависит концентрация микроорганизмов. Для того чтобы гарантировать эффективность бактериальных препаратов, необходимо преодолеть причины приживаемости микроорганизмов в зоне корней.
Исходя из вышесказанного, следует создать банк микроорганизмов с целью применения в ЭКД. Для этого требуется найти наилучший способ их хранения.
Коллекция микроорганизмов поддерживается при помощи консервации. Полная сохранность популяций и генетической стабильности представляется проблематичной, особенно если учитывать разнообразие микроорганизмов и их жизнеспособность в определённых условиях, которая связана с родом и видом микроорганизмов.
Различают два основных подхода в методах хранения микроорганизмов:
• непродолжительное хранение: периодический пересев на агаризованные среды, содержание культур под минеральным маслом, в водно-солевых растворах и др. Это одни из самых простых способов, которые позволяют сохранять микроорганизмы от нескольких недель до одного года, однако имеют ряд недостатков: диссоциация микроорганизмов, загрязнение, негарантированный срок сохранения жизнеспособности и др. Кроме того, неверный выбор питательной среды может привести к потере микроорганизмов. Большинство подобных методов не годятся для сохранения микроорганизмов;
• длительное хранение. Данный подход способен без потери свойств обеспечивать торможение жизненных процессов, протекающих в клетке. Такой результат достигается двумя путями: глубоким замораживанием микроорганизмов, или криоконсервацией (от -70 °С до -196 °С); высушиванием из замороженного состояния (лиофилизация) или жидкого.
Для поддержания коллекции микроорганизмов целесообразно использовать методы длительного хранения: лиофилизацию и криоконсервацию.
Лиофилизация микроорганизмов
Под лиофилизацией (лиофильная, сублимационая сушка] понимают технологию высушивания, которая позволяет льду испаряться, минуя жидкую фазу.
Процедура лиофилизации происходит в несколько этапов: заморозка, первичная сушка, досушивание (вторичная сушка) (рисунок!).
(не более 1-2 мин], остаточная влажность (не более 1-3 %}, исходная вязкость препарата после его растворения (зависит от среды растворения), рН-среда вещества (рН 7-7,4) [4].
Подготовка образца
Заморозка
Первичное высушивание
Досушивание
Конечный продукт
Рисунок 1 - Этапы лиофилизации
От заморозки зависит, каким в итоге будет качество препарата. Если процесс протекает недолго, то в веществе образуется меньше кристаллов льда. Следовательно, при высушивании влага испаряется значительно быстрее (рисунок 2).
Заморозка требуется для сохранения всех свойств, а также для поддержания жизнеспособности микроорганизмов. Замораживание проводится при температуре от-40 °С до -60 °С.
Оценить качество лиофильной сушки можно по таким параметрам, как скорость растворения препарата
Криоконсервация микроорганизмов
Почти все изученные группы бактерий могут сохраняться на протяжении длительного времени в замороженном состоянии при низких (криогенных) температурах (менее -153 °С) [5-8].
При криоконсервации наиболее распространено использование жидкого азота, так как он доступен, безопасен и является оптимальным хладагентом для большинства коллекций культур.
Культуры бактерий в некоторых коллекциях эффективно хранятся при температурах, которые обеспечивают современные морозильники (сосуды Дьюара), обычно до -86 °С. При таких условиях скорость отмирания может быть в 1000 раз меньше, чем при -10 °С [5].
Перед криоконсервацией клетки микроорганизмов выращивают на соответствующей питательной среде -агаризованной или жидкой.
В случае медленного охлаждения клеток (со скоростью 1 °С/мин) удаётся добиться наилучших результатов по выживанию и восстановлению бактерий [9,10]. Хранение проб осуществляется в жидком азоте при температуре -196 °С или над парами азота при температуре -150 °С. Опаивание происходит в процессе быстрого нагревания замороженных микроорганизмов, что приводит к их быстрому восстановлению [11].
80 60 40 20 0 -20 -40
Кристаллы льда
_ Температура воздействия
Рисунок 2 - Процесс лиофилизации
Пористая структура образуется входе испарения кристаллов льда
Сушка в вакууме
Животные
Племенное животноводство - одно из важнейших направлений сельскохозяйственного производства. Племенным скотом принято считать сельскохозяйственных животных, используемых для разведения и зарегистрированных в государственном реестре.
Хозяйства заинтересованы в выращивании племенных особей. Для решения данного вопроса существует несколько вариантов. Одним из них является покупка племенного молодняка или применение метода трансплантации эмбрионов. Медленнее, но надёжнее - искусственное осеменение собственного поголовья и получение через ряд поколений чистопородных животных.
С целью совершенствования генетических свойств животных требуются механизмы взаимосвязанных и взаимодополняющих действий. Главная задача - оценка племенных качеств животных. Далее - подбор особей в группы и составление родительских пар для получения последующих поколений. Перечисленные мероприятия необходимы для увеличения продуктивности пород животных, используемых в сельском хозяйстве. Ещё один важный аспект - выработка устойчивости к заболеваниям и приспособленность пород к имеющимся кормам.
При анализе смежных поколений можно отметить изменения частот генов в численности животных. Данные изменения -суть генетической эволюции. Естественный и искусственный отбор, миграции, дрейф генов представляют собой основные факторы эволюции.
Инверсия, транслокация, делеция, дупликация считаются одной из причин генетической вариативности в популяциях. Спонтанные изменения генетической информации приводят к накоплению мутаций в фенотипе.
Рекомбинация генной структуры фенотипических признаков у поколений вызывает изменения в половых клетках родителей.
Действующим механизмом естественного отбора в популяциях является дрейф генов, который приводит к мутации генетической структуры численности, в частности в малых популяциях [12].
В гомозиготном или гетерозиготном состоянии любое животное в генотипе имеет аллельные гены. Рецессивные аллели, как правило, расположены в гетерозиготе. При скрещивании близкородственных особей (инбридинг] увеличивается риск слияния одинаковых гамет, несущих в себе видоизменённые гены в гетерозиготном состоянии, и перехода их в гомозиготное состояние. Такая вероятность соответствует степени родства спариваемых животных [13].
Результат инбридинга - изменения генных частот. Кроме того, возможно выщепление рецессивных гомозигот, что ведёт к инбредной депрессии, которая выражается в снижении жизнеспособности и плодовитости животных, рождении аномальных особей [14].
Наибольшее количество рецессивных аллелей отвергается естественным отбором или исключается в процессе селекции. В первую очередь это доминантные признаки, проявляющиеся фенотипически в гетерозиготном состоянии, и численные изменения наборов хромосом. Рецессивно действующие гены в гетерозиготном состоянии и в процессе перестройки структуры хромосом, очевидно, не влияют на жизнеспособность их обладателей [15].
Геномная изменчивость ведёт к образованию в популяциях полиморфизма - разнообразия частот аллелей, гомозигот по доминантным признакам, гетерозигот или гомозигот по рецессивным генам (рисунок 3].
л Р, ^Г М /\ аа Р\ <1 АА /\ аа ч* / \ рп ( Аа \
Р„ / Аа \ Нормальная популяция Р„ АА V аа Замкнутая популяция
Рисунок 3 - Стремление популяций к гетерозиготному состоянию: А- доминантный признак; а- рецессивный признак; Р- родители [Ри Р„и т. д.)
Английский натуралист Ч. Дарвин разработал учение об отборе и установил, что образование новых форм живых организмов, изменение и совершенствование имеющихся идут благодаря действию естественного и искусственного отбора [16].
Главное положение его теории - все виды не являются неизменными сотворенными формами, а представляют собой итог длительного процесса борьбы животных за существование. По наследству от родителей потомству передаются, укрепляются и накапливаются особенности добывания пищи, способы борьбы с соперниками и врагами. Соответственно, каждое новое поколение более организованное, имеет больше шансов пережить слабых и продолжить род. Данный процесс совершенствования видов называется «естественный отбор». Эволюция диких
животных происходит благодаря выживанию и размножению более приспособленных особей [16].
Отбор генетического материала - гаплоидных клеток (сперматозоиды и ооциты) - и его криоконсервация помогут избежать в первом и последующих поколениях близкородственного скрещивания и поддержать желательные качества.
У первого поколения животных, обитающих в ЭКД, сразу будут взяты тотипотентные стволовые клетки и переданы в генетический банк ЭКД (рисунок 4]. Генбанк начнёт действовать со второго поколения; у его представителей также будет производиться отбор генетического материала для криоконсервации и использования в искусственном оплодотворении сотого поколения животных ЭКД.
Сбор генетической информации в генбанк
Сперматозоиды Ооциты
Сбор генетической информации в генбанк
Шр
¿-¿-¿у'
Ооциты
Сперматозоиды
Сперматозоиды Ооциты
Сбор генетической информации в генбанк
Сперматозоиды Ооциты
Ооциты
+ ш
Ч-гх1
Сперматозоиды
+ Ш +
Сперматозоиды
Рисунок 4 - Роль генбанка наследственной информации в замкнутой экосистеме: Р- родители Ръ Ръ и т. д.)
Для получения наиболее разнообразных генотипов внутри популяции животных ЭКД отобранный материал планируется задействовать только после сотого поколения. До этого времени предполагается использование хранящегося в генбанке ЭКД заранее заготовленного генетического материала, взятого из различных популяций животных на планете Земля.
Каждое последующее поколение ЭКД, начиная со второго, должно применять генетический банк как источник создания здорового и прогрессивного потомства, а также вносить свои тотипотентные стволовые клетки для пополнения генетического разнообразия банка.
Растения
Растения в замкнутой экосистеме требуют поддержания константных признаков в популяциях. Значительная часть культивируемых на Земле представителей флоры являются перекрёстноопыляемыми, что приводит к расщеплению потомков по фенотипическим признакам (второй закона Менделя).
Расщепление признаков вызывает у растений дисбаланс полезных для человека свойств, что в конечном итоге становится причиной деградации доместикации растений. Условия ЭКД не позволяют брать и пополнять генофонд полезных растительных культур, вследствие чего необходимо вести их генетический банк.
У растений, в отличие от бактерий и животных, существуют каллусные ткани, которые считаются аналогом стволовых клеток. Каллусные клетки обладают тотипотент-ностью (хранение генетической информации о целом организме в одной клетке), благодаря чему представители флоры способны возобновить целый организм со всеми его функциями.
Каллусогенез значительно облегчает процесс сохранения генофонда растений и ускоряет традиционные способы поддержания фенотипических признаков. Технология, которая поможет получить каллусные ткани, - культура тканей и клеток in vitro (микрокпональное размножение). Данный метод также избавляет растения от патогенных организмов - вирусных, грибковых и бактериальных [17].
Клетки, образованные при помощи микрокпонально-го размножения, генетически идентичны донорам клеток (маточникам), что помогает передать черенкам уникальность исходного экземпляра. Для производства каллусных культур нужно использовать ткани меристемы или камбия растений (рисунок 5).
Меристема
Камбий
Рисунок 5 - Образовательные ткани растений
В начале процесса микроклонального размножения следует отобрать данные клетки, а затем перенести их на питательную среду, которая содержит минеральные компоненты и фитогормоны, необходимые для роста каллуса (рисунок 6].
Описанный механизм помогает не утратить признаки полезных свойств у растений, однако возникает проблема с длительным сохранением самих клеток. Подобные задачи решает их криоконсервация. Находясь в состоянии глубокой заморозки, клетки растений долго не теряют своей уникальности.
Кроме того, для заморозки клеток применяются различные криопротекторы, которые способствуют уменьшению травмирующего действия физико-химических факторов при криоконсервации.
Авторами настоящего исследования предлагается следующая методика охлаждения:
1) снижение температуры с 20 °С до -35 °С в начале процесса. При этом скорость должна составлять 0,5 °С/мин и клетки должны пребывать в такой температуре не менее 15 мин;
2) погружение в жидкий азот (мгновенное охлаждение до -196 °С) [18].
Питательная среда ■ + гормоны
а)
Каллус Vitis vinifera
б)
в)
Рисунок 6 - Каллус винограда культурного (Vitis vinifera}: а - схематическое изображение; б, в - полученный в лабораторных условиях
После процесса размораживания восстановление клеточной активности проходит у растений значительно лучше, чем у животных. Каллусные ткани способны к делению после длительного крионического хранения. Размо-розка клеток осуществляется при комнатной температуре. Как только клетки оттают, для возобновления клеточной активности их на 15 мин погружают в раствор 10 % сахарозы или 20 % глюкозы.
Основные способы деления клеток, приводящие к образованию каллуса:
• использование фитогормонов (посредством оптимальной концентрации ауксинов и цитокинов в питательной среде);
• изменение температурного режима (путём шоковой заморозки или кратковременной обработки высокой температурой);
• применение агробактерий (за счёт участков плазмид, отвечающих за стимуляцию выработки ауксинов и цитокинов).
Каллус можно сепарировать и делить на большое количество частей, при этом отделённые от каллуса клетки способны к образованию нового каллуса с последующим новым делением либо выходом в эксплант растений.
Выводы
Возникновение гомозиготных линий и накопление рецессивных аллелей приводит к различным заболеваниям потомства. Значит, для поддержания стабильной жизни в ЭКД и обеспечения продовольственной безопасности
людей необходимо ведение племенного хозяйства, которое подразумевает применение генетического банка и отбор генетического материала для криоконсервации, и семеноводства по предлагаемой методике (с помощью микро-кпонального размножения или каллусогенеза). Кроме того, важно создание банка штаммов микроорганизмов, который будет сформирован в условиях замкнутой системы ЭКД с помощью криоконсервации и лиофилизации.
Литература
1. Unitsky, A. System Foundations of Non-Rocket Near Space Industrialization: Problems, Ideas, Projects /A. Unitsky -Minsk: Gradient, 2021 - 568 p.: il.
2. Безракетная индустриализация ближнего космоса: проблемы, идеи, проекты: материалы III междунар. науч.-техн. конф., Марьина Горка, 12 сент. 2020 г. / ООО «Астроин-женерные технологии», ЗАО «Струнные технологии»; под общ. ред. A3. Юницкого. - Минск: СтройМедиаПроект, 2021. -516 с.
3. Лапа, В. В. Продуктивность зернотравяного севооборота и изменение агрохимических показателей дерново-подзолистой легкосуглинистой почвы/ В.В. Лапа, М.М. Ломонос // Почвоведение и агрохимия. - 2010. - № 1 (44). -С. 73-79.
4. Khandagale, P.M. Lyophilization Technique: A Review/ P.M. Khandagale, B.A. Bhairav, R.B. Saudagar//Asian Journal of Research in Pharmaceutical Sciences. - 2016. -Vol. 6, No. 4. - P. 269-276.
i
■I
5. Hubalek, Z. Protectants Used in the Cryopreservation of Microorganisms / Z. Hubalek // Cryobiology. -2003. -Vol. 46, No. 3. - P 205-229.
6. Червякова, H.C Использование лиофильных аппаратов камерного типа в коллекциях патогенных микроорганизмов /Н.С. Червякова, Т.В. Валова,А.В. Осин //Проблемы особо опасных инфекций. -2014. -№3,- С. 65-68.
I. Donev, Т. Methods for Conservation of Industrial Microorganisms/ I Donev. - Sofia: NBIMCC, 2001. - 93 p.
8. Stepanskyi, D.O. Investigation the Long-Term Storage of Aerococcus/D.O. Stepanskyi, I.RKoshova, G.M. Kremen-chutskyi // Восточно-европейский научный журнал. -2016. - T. 6, № 1. - С. 70-73.
9. Герна, R Хранение микроорганизмов/Р. Герна //Методы общей бактериологии: в 3 т.: пер. с англ. / под ред. Ф. Герхардта [и др.]. - М- Мир, 1983. - Т. 1. - С. 512-534.
10. Hammes, W.P. The Genera Lactobacillus and Carnobac-terium / W.P. Hammes, С. Hertel//Prokaryotes. -2006. -Vol. 4. - P. 320-403.
II. Похиленко, В.Д. Методы длительного хранения коллекционных культур микроорганизмов и тенденции развития / В.Д. Похиленко, А.М. Баранов, К.В. Детушев // Известия высших учебных заведений. Поволжский регион. Медицинские науки. - 2009. - №4 [12]. - С. 99-121.
12. Инге-Вечтомов, С. Г. Генетика с основами селекции / С. Г. Инге-Вечтомов. - М.: Высш. шк, 1989. - 592 е.: ил.
13. Нколайчук, B.I. Генетика з основами селекцИ/B.I. Нколай-чук, Б.Б. Надь. - Ужгород: Медщ 2003. - 196 с.
14. Генетика: пер. с англ. / Б. Гуттман [и др.]. - М.: ФАИР-ПРЕСС, 2004. - 448 е.: ил.
15. Медицинская генетика / Н.П. Бочков [и др.]. - М.: Мастерство, 2001. - 190 с.
16. Бочков, Н.П. Клиническая генетика / Н.П. Бочков. -3-е изд., испр. и доп. - М.: ГЭОТАР-Медиа, 2004. - 480 с.
17. Налетов, ИВ. Определение порога вредоносности гамма-лучей на сухие зародыши твёрдой пшеницы (Triticum durum DesfJ / ИВ. Налетов, ДС. Симоненко // Инновации и пути повышения эффективности растениеводства: сб. ст. по материалам междунар. науч. конф., посвящ. 180-летию образования БГСХА и 95-летию агроном, фак, Горки, 28 мая 2020 г. / БГСХА; редкол.: H.A. Дуктова (гл. ред.] [и др.] - Горки: БГСХА, 2020. -С. 47-50.
18. Широков, А.И. Основы биотехнологии растений/А.И. Широков, Л.А. Крюков. - Н. Новгород: ННГУ2012. - 49 с.
