CC BY
40
УДК 582.477: 581.143.5
РЕГЕНЕРАЦИЯ JUNIPERUS SIBIRICA В. IN VITRO
Е.Н. Аёшина, Н.А. Величко
ГОУ ВПО «Сибирский государственный технологический университет»
660049 Красноярск, пр. Мира, 82
На основании проведенных исследований и анализа литературных да нных были определены условия для введения в культуру in vitro Juniperus sibirica B. и разработаны основные этапы его микроклонального размн о-жения, обеспечивающие получение элитного посадочного материала.
Ключевые слова: культивирование, хвойные породы, среды, регуляторы роста, почки, микроклональное размножение, органогенез, ризогенез, адаптации
On the basis of the carried out researches and analysis of the literary data the conditions for introduction in culture in vitro Juniperus sibirica B. were determined and the basic stages it microclonal of duplication ensuring reception elited of a landing material are developed.
Key words: cultivated, coniferous breeds, medium , regulators of growth, kidney, microclonale propagation, organ o-genese, rhizogenese, adaptation
ВВЕДЕНИЕ
Последние годы особый интерес для введения в культуру стали представлять хвойные породы, отличающиеся низким естественным возобновлением, содержащие ценные биологически активные вещества. Хвойные породы долгое время остав а-лись редкими объектами исследования в культуре тканей, что было связано с трудностями их культ и-вирования.
Метод культуры клеток и тканей хвойных получил значительное развитие в последние три дес я-тилетия. Исследования хвойных пород сосредоточены вокруг видов, имеющих наиболее важ ное хозяйственное значение для данной страны или р е-гиона. Наиболее изученными в культуре in vitro являются такие виды, как ель обыкновенная (Picea abies), сосна обыкновенная (Pinus silvestris) (Ingram, 2000; Wang, 1991; Байбурина,1998).
Метод культуры тканей все чаще стал использоваться в селекции хвойных при размножении и выращивании посадочного материала различных видов, отличающихся медленным ростом или тру д-ностями при получении семенного материала. Те х-нология микроклонального размножения по сра в-нению с традиционными методами вегетативного размножения имеет ряд следующих преимуществ: высокий коэффициент размножения; расширение сезонности выполняемых работ; возможность п о-лучения в большом количестве вегетативного п о-томства трудноразмножающихся в обычных у сло-виях видов или видов, не способных к вегетативн ому размножению традиционными методами; уск о-рение перехода от ювенильной к репродуктивной фазе развития; возможность работать круглый год и планировать выпуск растений к определенному сроку (Thorpe,1988).
В мировой практике технология микроклонал ь-ного размножения разработана более чем для 25 видов хвойных (Negussie,1997).
Можжевельники, как и многие другие хвойные виды, характеризуются пониженной регенерационной способностью как в естественных условиях, так и в культуральной среде. В этой связи особый и н-терес представляют работы исследователей, н а-правленные на создание технологии микроклонал ь-ного размножения можжевельников.
Исследования по микроклональному размн о-жению можжевельника высокого (Juniperus excelsa) проводил Berha D. (Berha,1998). Им изучено влияние гормонов на адвентивное почкообразование. В качестве эксплантов использовали семядоли и з а-родыши. Экспланты были посажены на основные среды Eriksson (1965), Murashige and Skoog (1962), с содержанием 6-бензиламинопурина (6-БАП) 0,5-1,0 мг/л и а-нафтилуксусной кислоты (а-НУК) 0,02 мг/л. Наиболее лучшей для раннего инициирования активного морфогенетического развития адвенти в-ных почек при использовании в качестве экспла н-тов - семядолей оказалась питательная среда Eriksson с добавлением 0,5 мг/л 6-БАП и 0,02 мг/л аНУК. На данной среде было получено наибольшее количество (92) адвентивных побегов. Более выс окая концентрация 6-БАП, особенно с высоким уровнем а-НУК, подавляла образование адвенти в-ных почек на семядолях. Процент адвентивных почек, которые производили семядоли, прогрессивно уменьшался с повышением концентрации а-НУК при постоянной концентрации 6 -БАП. Напротив, присутствие в базисной среде Murashige and Skoog 0,002 мг/л а-НУК значительно подавляло об разова-ние адвентивных почек на семядолях. Наилучшие результаты по образованию адвентивных почек наблюдались на среде, содержащей только 6 -БАП в концентрации 1 мг/л. При использовании в качестве эксплантов эмбрионов можжевельника, для пол учения адвентивных почек, наилучшей оказалась среда Murashige and Skoog, дополненная 1,0 мг/л 6-БАП и 0,02 мг/л а-НУК (Berha,1998).
Одной из наиболее трудных задач при микро-
клональном размножении в культуре тканей является укоренение побегов и их успешная адаптация к условиям in v^. Для укоренения побегов Juniperus excelsa использовали ß-индолилмасляную кислоту (ß-ИМК) (1 мг/л) и а-НУК (0,5 мг/л) Укоренение производили в поддонах, заполненных компостом. Растения прекрасно адаптировались к условиям in v^о (Berha,1998).
Другие эфиопские исследователи проводили работы по укоренению можжевельника (Juniperus prosera) в песке, для этого использовали черенки от молодых и зрелых деревьев. Для укоренения также использовали четыре наиболее распространенные растительные гормоны индолил-3-уксусную кислоту (ИУК), ß-ИМК, а-НУК и 2,4 Д. Побеги погружали в растворы с различными концентрациями го р-монов на 24 часа, после чего помещали в емкости с песком и ставили в теплицу. Максимальный пр о-цент укоренения (24 %) был получен при обработке молодых черенков ИУК 10"7 М (0,0175 мг/л). Процент укореняющихся растений уменьшался при обработке черенков более низкой концентрацией ИУК (10-6 М), при этом они имели более разветвленную корневую систему. Обработка черенков аНУК (10-3 М) стимулировала образ ование более длинных корней (Leopold, 1975).
Авторами был сделан вывод, что наиболее ва ж-ным фактором в укоренении можжевельника (Juniperus procera) является возраст растений. Всего 24% всех черенков, полученных от молодых раст е-ний, были способны укорениться, черенки от зрелых растений укоренялись хуже (Leopold,1975). Это может быть следствием уменьшения уровня аукс и-на в зрелых растениях (White,1984), лигнифициро-вания тканей, которое ведет к замедлению морф о-логических процессов или предотвращению в ц е-лом (White,1984), присутствия большого количества камеди, приводящее к уменьшению количества паренхиматозных тканей (Zajczkowski, 1973), уменьшения подвижности введенных веществ в зрелых тканях (Hortmann, 1990), повышения с возрастом синтеза корневого ингибитора (Leakey,1992), физиологического старения (Mesen, 1997).
Кроме того, Mesen установил, что укоренение черенков связано с фотосинтетической деятельн остью. Leakey (Mesen, 1997) подчеркнул, что на укоренение черенков влияет окружающая среда, ареал произрастания, физические факторы и концентр а-ция гормонов.
Можжевельник сибирский является уникал ь-ным видом, представляющим интерес для озелен е-ния и получения ценных биологически активных веществ. Но традиционные способы восстановл е-ния можжевельника сибирского не являю тся достаточно эффективными и требуют совершенств о-вания. В связи с этим разработка эффективных методов массового размножения можжевельника сибирского является достаточно актуальной пр о-блемой.
В результате проведенных исследований нами был разработан метод клонального микроразмножения Juniperus sibirica В. в условиях in vitro.
МЕТОДИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ
Первым шагом в микроклональном размнож е-нии является разработка методов индуцированного органогенеза. Обязательным условием для микр о-клонального размножения является использование объектов, полностью сохраняющих генетическую стабильность. Этому условию удовлетворяют п а-зушные почки органов стеблевого происхождения. Поэтому в качестве исходного материала для пол учения изолированных культур были выбраны ве р-шины побегов размером 15-20 мм.
На начальном этапе исследования важно было подобрать оптимальные условия для стерилизации эксплантов Juniperus Sibirica В. В результате эксперимента было установлено, что наиболее эффе к-тивным стерилизующим раствором оказался 0,1% -й раствор диацида с добавлением твина -80 (1-2 капли на 1 л) при продолжительности экспозиции эк с-плантов можжевельника сибирского в течение 25 мин. Эффективность стерилизации при этих условиях составила 97,50 %. При проведении дальне й-ших экспериментов использовали эти условия стерилизации.
Одним из способов регуляции органогенеза в культуре органов и тканей являлось использование питательных сред с добавлением цитокининов и ауксинов (Гамбург, 1983; Гамбург, 1990).
Как показал анализ литературных данных, для введения в культуру можжевельника чаще всего используются питательные среды с минеральной основой по Murashige and Skoog 1962 ( MS), Schenk and Hildebrandt 1972 (SH), Eriksson 1965 (ER). В данной работе были использованы среды с минеральной основой по MS, SH, Uata, Knop и Sierlis (Бутенко, 1977).
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНА Я ЧА СТЬ
Стерильные однолетние побеги Juniperus sibiri-ca В. вводили на агаризованные питательные среды с минеральным составом по Murashige and Skoog, Schenk and Hildebrandt, Uata, Knop и Sierlis без добавления гормонов. Всего на этом этапе было отобрано и введено в культуру in vitro no 50 эксплан-тов на каждую среду (всего изначально было вв едено в культуру 300 эксплантов). Полученные результаты относительно выживаемости экспла нтов приведены в таблице 1.
Из полученных результатов следует, что наиб о-лее благоприятной для культивирования эксплантов оказалась питательная среда, содержащая минеральные соли по Murashige and Skoog (М S) с добавлением 30 г/л сахарозы и витаминов: пиридок-сина (В6), тиамина хлорида, ниацина в количестве по 1 мг/л (рис. 2, а).
Следующим важным моментом в процессе микроклонального размножения было подавление апикального доминирования у эксплантов Juniperus sibirica В. и стимуляция роста пазушных почек. Для достижения этой цели вводили в питательную среду гормоны ауксинового и цитокининового типа (рис. 1) .
Таблица 1 - Влияние минерального состава питательных сред на жизнеспособность и качественные
характеристики растений в условиях in vitro__________________________________________________________________
Название среды Количество жизнеспособных растений, % Качественная характеристика растений
Murashige and Skoog 93,30 состояние отличное, зеленые, наблюд ается рост
Schenk and Hildebrandt 86,60 состояние хорошее, зеленые, рост не наблюдае тся
Uayta 76,60 состояние хорошее, зеленые, рост не н аблюдается
Knop 36,60 состояние удовлетворительное, бледно-зеленые, рост не наблюдается
Sierlis 90,00 состояние отличное, зеленые, наблюд ается рост
012
nil
ш
ш
ш
Концентрация фитогормона, мг/л
□ Кинетин
] a-НУК
□ 2,4 Д
Рисунок 1 - Влияние концентрации и вида гормонов в среде на инициацию побегов 1итргтш5 sibirica В.
На всех средах с содержанием 6-БАП в концентрации от 0,1-1,0 мг/л происходила стимуляция роста пазушных почек. В зависимости от конце н-трации гормона 6-БАП в среде развитие пазушных почек происходило либо у основания экспланта, либо по всему экспланту. Наибольшее количество побегов было получено на среде с макро- и микро
элементами по МБ с добавлением 0,1 мг/л 6-БАП (рис. 2, б).
На следующем этапе полученные микропобеги в стерильном боксе отделяли скальпелем от экспланта и помещали на свежую питательную среду. Для выращивания побегов в среду МБ были добавлены регуляторы роста в различных конце н-трациях и сочетаниях. Наибольший прирост поб е-гов (1,8 см) в высоту наблюдался на питательной среде с содержанием а-НУК (0,1 мг/л) и 6-БАП (0,5 мг/л) (рис.2, в).
В работе по стимуляции ризогенеза у побегов J. зіЬігіеа В. варьировали концентрацией гормонов и составом питательных сред. Ризогенез наблюд али на побегах J. зіЬітіеа В., культивируемых сначала на среде Ца1а с добавлением ИУК (0,05 мг/л) в течение месяца, затем на среде МБ/2 в течение трех месяцев. Появление первых корней на эк с-плантах J. зіЬітіеа В. отмечали к концу 15-й недели (рис. 2, д). Образование корней происходило на безэпитальной части побега. Максимально до с-тигнутый процент укоренения побегов J. зіЬітіеа составил 17,50 % .
Рисунок 2 - Этапы микроклонального размножения Juniperus sibirica В.
о 8
7
6
3
2
0
6-БАП
Процесс адаптации пробирочных растений к почвенным условиям является сложной опер ацией. Поэтому при пересадке растений-регенерантов были созданы условия, идентичные с их развитием в условиях in vitro.
Экспланты осторожно вынимали из пробирок, корневую систему побегов отмывали от агара ди с-тиллированной водой и помещали в горшочки для рассады на 1/3 заполненые торфо-перлитной смесью
в соотношении 1: 2. Горшочки с растениями помещали в теплицу с температурным режимом -(22+1 0С) и относительной влажностью 60 %. Для лучшей адаптации растений горшочки с растени ями были накрыты полиэтиленовыми изоляторами, кот о-рые постепенно открывали до полной адаптации растений. Количество адаптированных растений к условиям ш уыо составило 91,60 %. Весной полученные саженцы были высажены в открытый грунт.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Таким образом, в результате проведенного эксперимента были определены условия для введения в культуру in vitro Juniperus sibirica B. и разработаны основные этапы его микроклонального размножения.
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК
Байбурина, Р.К. Микроклональное размножение взрослых гибридных деревьев Betula Pendula roth var. ca-relica merckl / Р.К. Байбурина // Раст. ресурсы. -1998. - Т. 34. -№ 2. - С. 9-22.
Бутенко, Р.Г. Рост и дифференциация в культуре клеток растений / Р. Г. Бутенко // Рост растений и природные регуляторы. - М. : Наука, 1977. - С. 697-710.
Гамбург, К.З. Ауксины в культурах тканей и клеток растений [Текст] / К.З. Гамбург, Н.И. Рекославская, С.Г. Швецов. - Новосибирск : Наука, 1990. - 243 с. Гамбург, К.З. Фитогормоны и клетки [Текст] / К.З.Гамбург. - М. : Наука, 1970. - 102 с.
Berha, D. Asexual propagation of Juniperus procera from Ethiopia: a contribution to the conservation of African pencil cedar / D. Berha, L. Negash // Forest Ecology and Management. - 1998. - Vol. 112. - P.179-190. Hortmann, H.T. Plant cell / H. T. Hortmann, D. E. Kester, F. T. Davies // Plant Propagation: Principles and Practices : 5th ed. Prentice-Hall, Englewood Cliffs. - New Jersey, 1990. -Р. 16-27.
Ingram, B. Effect of bioreactor configuration on the growth and maturation of Picea sitchensis somatic embryo cultures / B. Ingram, F. Mavituna // Plant. Cell. -2000. - Vol. 61. - P. 87-96.
Leakey, R. R. B. Stockplantderived variation in rooting
ability: the source of physiological youth / R.B. Leakey, J.Mc. P. Dick, A.C. Newton // Paper presented at the Symposium on Mass Production Technology for Genetically Improved Fast Growing Forest Tree Species, Bordeaux. - France, 1992. - P. 171-178.
Leopold, A.C. Plant Growth and Development / A. C. Leopold, P.E. Kriedemann. -2 ed. - McGraw-Hill, 1975. - 545 p.
Mesen, J.F. The effects of propagation environment and foliar area on the rooting physiology of Cordia all i-odora (Ruiz and Pavon) Oken cuttings / J.F. Mesen, A.C. Newton, R. R. B. Leakey // Trees. - 1997. - № 11.-P. 404-411.
Negussie, F. In vitro induction of multiple bads in tissue culture of Juniperus excelsa / F. Negussie // Forest Ecology and Management. - 1997. - Vol. 98. - P. 115-123.
Thorpe, T. A. Micropropagation in conifers: methods, o p-portunities and costs / T. A. Thorpe, S. Hasnain // Prec. 21. Meet Can Tree Improv. Assoc "Tree improvement - progressing together", Truro NS 1987, Can. For. Serv., Chalk River. - Chalk River, 1988. -P. 68-84.
Wang, K.X. Adventitious bus production from mature Picea abies: rejuvenation associated with female str o-bili formation / K.X. Wang, D.F. Karnosky, R.Timmis // Woody Plant Biotechnology. - 1991. - P. 83-90.
White, J. Factor influencing adventitious root production in cuttings of Griselinia littoralis and Griselinia lucida / J. White, P. H. Lovell // Ann. Bot. - 1984. - Vol. 53. - P. 443-446.
White, J. The anatomy of root initiation in cuttings of Griselinia littoralis and Griselinia lucida / J. White, P. H. Lovell // Ann. Bot. - 1984. - Vol. 54. - P. 7-20.
Zajczkowski, S. Auxin stimulation of cambial activity in Pinus silvestris. I. The differential cambial response / S. Zajczkowski // Physio. Plant. - 1973. - Vol. 29. -P. 281-287.
Поступила в редакцию 26 марта 2008 г. Принята к печати 27 августа 2008 г.
