CC BY
232
8
ВЕСНІК МДПУ імя І. П. ШАМЯКІНА
УДК 581.4:634.1
И. И. Концевая, Л. В. Шевцова
МИКРОКЛОНАЛЬНОЕ РАЗМНОЖЕНИЕ РЕДКИХ ВИДОВ БЕРЁЗЫ, ПРОИЗРАСТАЮЩИХ В БЕЛАРУСИ
Статья посвящена проблеме поддержания и сохранения редких видов берёзы с использованием метода культуры тканей. Представлены результаты изучения влияния гормонального состава среды на морфогенез in vitro у эксплантов берёзы карликовой и чернокорой. В качестве первичных эксплантов на этапе введения в стерильную культуру использовали однопочечные узловые сегменты взрослых растений, на этапе собственно микроразмножения - узловые сегменты, междоузлия, листья одномесячных микрорастений.
Введение
В настоящее время берёза составляет 22% древостоя лесов Беларуси. Большая часть березняков состоит из берёзы повислой, берёзы пушистой, местами произрастает берёза карельская, очень редко встречаются берёза чернокорая, берёза приземистая и карликовая.
Диплоидная берёза карликовая (Betula nana L., 2n = 2х = 28) относится к редким растениям, включена в Красную книгу Республики Беларусь [1]. Взрослые растения представляют собой невысокий кустарник. Данный вид характеризуется высоким уровнем получения триплоидного гибридного потомства в случае совместного произрастания с тетраплоидной березой пушистой (2n = 4х = 56) [2]. Для берёзы чернокорой (B. obscura Kotula ex Fiek) характерна высокая декоративность древесины, что делает её экономически важной культурой. В связи с малочисленностью, вероятным реликтовым происхождением и в силу её биологических особенностей (наблюдаемая анеуплоидия, пониженная жизнеспособность особей и популяции в целом) в республике очень остро стоит вопрос о сохранении чернокорой берёзы [3].
При решении проблемы поддержания и сохранения редких видов растений широко используется метод культуры тканей. Культура клеток и тканей различных видов рода Betula L. вызывает у исследователей большой интерес, поскольку позволяет размножать уникальные деревья, гибридные генотипы, отбирать ценные мутантные формы, сохранять в коллекциях редкие виды. Наиболее активно развиваются исследования в направлении микроклонирования берёзы повислой и карельской, имеются немногочисленные сведения и о культуре тканей других видов берёз [4].
В то же время в литературе отсутствуют данные о культуре тканей B. nana L и B. obscura Kotula ex Fiek. В связи с вышесказанным перед нами стояла задача разработать способ микроклонального размножения этих двух видов берёзы и изучить их морфогенетические особенности в культуре in vitro.
Материалы и методы исследования. Объектом исследования явились берёза карликовая и берёза чернокорая. В качестве первичных эксплантов на этапе введения в стерильную культуру использовали однопочечные узловые сегменты взрослых растений. На этапе собственно микроразмножения использовали узловые сегменты, междоузлия, листья одномесячных микрорастений, полученных на среде без гормонов.
Основу питательной среды составляла смесь неорганических солей WPM [5]. Витамины, микроэлементы добавляли по прописи Мурасиге и Скуга [6]. Из фитогормонов испытывали цитокинины (6-бензил-аминопурин (БАП), (изопрен-2-ил)аденин (2ip), зеатин, тидиазурон (TDZ), кинетин) и ауксины (2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота (2,4-Д), индолилмасляную кислоту (ИМК). Для предупреждения развития микрофлоры в питательные среды добавляли антибиотики: цефотаксим, карбенициллин, гентамицин. В качестве контроля использовали модифицированную среду WPM без органических добавок. рН среды перед стерилизацией доводили до 5,6-5,8. Среды автоклавировали при 1,1 атм в течение 20 мин. Материал культивировали при температуре 25 + 1° С, фотопериоде 16 часов и освещенности 2-3 тыс. лк. Число повторностей в каждом варианте - 30. Был выполнен статистический анализ на основе программ Microsoft Excel. Для определения достоверных различий между вариантами опыта и контролем вычисляли критерий t-Стьюдента.
БІЯЛАГІЧНЫЯ НАВУКІ
9
Результаты исследования и их обсуждение
В своей работе мы изучали различные этапы микроклонального размножения берёзы чернокорой и берёзы карликовой. Весь процесс микроразмножения можно условно разделить на три этапа. Первый этап - эксплантирование исходной ткани растений. На данном этапе получают жизнеспособную, активно пролиферирующую культуру, свободную от инфекции. На втором этапе выполняется собственно микроразмножение, т. е. увеличение числа органогенных структур на экспланте, индуцирование у них побегов, укоренение размноженных побегов в питательной среде. Данный этап характеризуется использованием большого числа типов экспланов, видов гормонов и других биологически активных веществ (БАВ) при их различном сочетании, а также применении разных условий культивирования. Третий этап - пересадка микрорастений из стерильных условий в почву.
А. Культура тканей B. nana L. Исходный материал был получен из одной вегетативной почки материнского растения березы карликовой. Известно, что полевой материал отличается высоким уровнем инфицирования микрофлорой, что затрудняет получение стерильного материала. Для снижения степени контаминированности ранней весной была выкопана часть кустарника, который в лаборатории высадили в сосуд с почвой. При позеленении почек или на начальной стадии их распускания нарезали черенки, которые стерилизовали, черенковали на однопочечные сегменты побегов и высаживали на питательную среду WPM, дополненную 6-БАП в концентрации 2,0-5,0 мг/л. Следует отметить, что выращивание маточного растения в лабораторных условиях позволило практически без проблем получить стерильную культуру, и все высаженные почки развились в побеги. Если в последующих пассажах проявлялась бактериальная инфекция в виде мутно-белого ареола в питательной среде у основания эксплантов, мы незамедлительно использовали следующие приёмы: стерилизацию антисептиками, периодическое культивирование микрорастений на среде, дополненной антибиотиками.
Для изучения процесса морфогенеза в культуре in vitro в качестве эксплантов использовали однопочечные сегменты побегов, верхушки побегов, междоузлия, которые вычленяли в стерильных условиях у одномесячных микроклональных растений, культивированных на безгормональной среде. Экспланты помещали на питательную среду, дополненную гормонами (таблица 1). Для определения регенерационной способности и получения регенерантов экспланты вместе с полученными структурами спустя 30 дней переносили на свежую безгормональную среду, на которой культивирование продолжали еще 20 дней при оптимальных условиях.
Таблица 1 - Морфогенез in vitro у эксплантов берёзы карликовой в зависимости от гормонального состава среды
Гормоны, мг/л Узловые сегменты, % Междоузлия, %
с каллусом с корнями с адвентивными почками с каллусом с корнями с адвентивными почками
1 2 3 4 5 6 7
б/г (контроль) - 50,0 - - - -
ИМК 0,2 50,0 80,0 - - 26,0 -
БАП 2,0 100,0 - - 20,0 - 15,0
БАП 2, 0 + ИМК 0,2 100,0 - - - - -
БАП 5,0 100,0 - - - - -
БАП 5,0 + ИМК 0,2 100,0 - 25,0 100,0 - -
2ір 5,0 100,0 - - - - -
2ір15,0 100,0 - - 100,0 - 5,0
Кинетин 5,0 - - - - - -
2,4-Д 2,0 100,0 - - 100,0 - -
Кинетин 5,0 + 2,4-Д 2,0 100,0 - - 100,0 50,0 -
БАП 5,0 + 2,4-Д 2,0 100,0 - - 100,0 15,0 -
БАП 0,5 + 2,4-Д 2,0 100,0 - - 100,0 10,0 -
10
ВЕСНІК МДПУ імя І. П. ШАМЯКІНА
Продолжение таблицы 1
1 2 3 4 5 6 7
2ір 5,0 + ИМК 0,2 100,0 - - 100,0 10,0 -
Кинетин 5,0 + ИМК 0,2 100,0 - - 100,0 - -
TDZ 0,005 100,0 - - - - 5,0
TDZ 0,05 100,0 - 50,0 20,0 5,0 -
TDZ 0,5 100,0 - 60,0 100,0 - 20,0
TDZ 1,0 100,0 - 30,0 100,0 - 5,0
Зеатин 5,0 100,0 - - - - 5,0
В первом и во втором пассажах наблюдали развитие узловых сегментов, рост образовавшихся побегов. Средняя высота побегов варьировала по вариантам опыта от 0,8 до 3,5 см. На среде, дополненной 0,2 мг/л ИМК, высота побегов существенно превышала значение в контроле (соответственно, 3,5 и 2,5 см). В остальных вариантах высота побегов была на уровне значения в контрольном варианте либо ниже его. На средах с БАП (в том числе в сочетании с ИМК) у 7-26% микропобегов отмечали образование из нижних пазушных почек боковых побегов. Данные по каллусогенной и органогенной способности узловых сегментов представлены в таблице 1.
Корнеобразование наблюдали в контрольном варианте и при добавлении в среду ИМК. Каллусообразование на концах узловых сегментов побегов отмечали у 100% эксплантов почти во всех опытных вариантах, кроме варианта, содержащего 5,0 мг/л кинетина. Каллус по размерам был небольшой, диаметром 2-4 мм, буро-зеленого цвета, реже - кремово-бурого, плотный, блестящий. Формирование адвентивных почек в первом пассаже отмечали на средах со следующими гормонами: БАП 5 мг/л + ИМК 0,2 мг/л, TDZ 0,05; 0,5; 1,0 мг/л. Число почек на экспланте варьировало от 1 до 4.
Таким образом, установлено, что дополнительное культивирование междоузлий с новообразованиями, полученными в первом пассаже, в течение 20 дней на среде без гормонов практически не влияет на морфогенетическую активность эксплантов. Каллусообразование выявлено у всех эксплантов, культивированных на средах, дополненных 2,4-Д, либо ИМК + 2ір, либо БАП 5,0 мг/л, либо кинетином, либо TDZ 0,05-1,0 мг/л. Индуцирование корней наблюдали у 5-50% эксплантов в ряде опытных вариантов (таблица 1). Следует отметить позитивное действие TDZ на процесс побегообразования. Несмотря на то что число междоузлий с адвентивными побегами не превышало 5-20% от общего числа, а число адвентивных побегов не превышало 1-2 на эксплант, сами побеги были хорошо развиты и к 50-му дню культивирования достигали в высоту 0,8-1,2 см.
В результате проведённых исследований предложен эффективный способ получения стерильной культуры B. nana L. Изучено влияние широкого спектра гормонов на процессы морфогенеза берёзы карликовой в культуре тканей. У данного вида берёзы выявлена низкая пролиферирующая и органогенная способность при использовании в качестве эксплантов однопочечных сегментов побегов и междоузлий.
Б. Культура тканей B. obscura Kotiila ex Fiek. Побеги берёзы чернокорой заготавливали в феврале с деревьев, возраст которых был не менее 30 лет. Для индуцирования набухания почек побеги помещали в воду и выдерживали в течение 2-3 недель при 25° С, освещённости 20003000 лк. Затем побеги разрезали на черенки и стерилизовали 0,1%-процентным раствором диацида в течение 20-30 минут. После окончания стерилизации материал трехкратно промывали автоклавированной дистиллированной водой. В условиях ламинар-бокса вычлененные пазушные почки с кусочками стебля помещали на модифицированную среду для древесных растений WPM, содержащую 6-БАП в концентрации 0,5-2 мг/л. Материал культивировали при освещённости 2000-3000 лк, фотопериоде 16 часов, температуре 25 ± 1° С. Каждые две недели экспланты с образовавшимся на них каллусом переносили на свежие среды аналогичного состава, удаляя при этом некротизированные участки. Через два месяца после посадки на эксплантах формировался каллус с многочисленными адвентивными почками и побегами. Доращивание побегов проводили на среде с низким содержанием цитокининов, с последующим их переносом на безгормональную среду.
БІЯЛАГІЧНЫЯ НАВУКІ
11
Микроразмножение выполняли с использованием в качестве эксплантов листьев и междоузлий. Установлено, что у обоих изученных типов эксплантов регенерация побегов происходит на питательной среде даже при отсутствии регуляторов роста (таблица 2). Индукция побегообразования происходит у 50% листьев и 100% междоузлий. На экспланте насчитывали по 1-10 адвентивных почек. Однако, чтобы полученные регенеранты по морфологическим показателям были пригодны для пересадки в почву, требуется ещё два пассажа на безгормональной среде.
Таблица 2 - Влияние гормонального состава среды на органогенез у листьев и междоузлий берёзы чернокорой
Гормоны - мг/л Число эксплантов, % Среднее число почек на эксплант (x ± Sx)
с корнями с почками л м
л м л м
1 2 3 4 5 6 7
б/г (контроль) 63,4 0 51,2 95,0 2,8 + 0,72 6,8 + 1,72
ИМК 0,2 100 86,7 10,3 56,7 0,2 + 0,04*** 1,8 + 0,44**
БАП 2,0 96,7 50,0 93,6 93,8 10,5 + 2,16*** 6,5 + 2,16
БАП 2,0 + ИМК 0,2 100 3,3 86,2 93,3 9,3 + 2,00** 4,3 + 1,00
БАП 5,0 80,0 0 96,7 92,9 7,4 + 1,06* 6,4 + 1,06
БАП 5,0 + ИМК 0,2 88,9 10,0 92,6 100 8,5 + 1,16** 3,5 + 0,66*
2ip 5,0 29,0 0 77,4 93,3 12,3 + 3,02** 5,6 + 1,02
2ip 15,0 30,0 6,7 80,0 83,3 4,9 + 1,06 4,2 + 1,06
Кинетин 5,0 30,0 3,6 83,3 53,6 6,3 + 2,16* 2,4 + 0,76*
2,4-Д 2,0 10,0 0 0 83,3 - 3,4 + 0,96**
2ip 5,0 + 2,4-Д 2,0 28,6 0 4,8 36,7 0,3 + 0,01*** 0,4 + 0,12***
Кинетин 5,0 + 2,4-Д 2,0 37,9 0 3,5 4,8 0,1 + 0,01*** 0,1 + 0,01***
БАП 5,0 + 2,4-Д 2,0 27,6 0 3,5 10,0 0,3 + 0,1*** 0,4 + 0,1***
БАП 0,5 + 2,4-Д 2,0 0 0 50,0 56,7 0,3 + 0,01*** 1,9 + 0,4***
2ip 5,0 + ИМК 0,2 50,0 0 33,3 30,9 0,1 + 0,01*** 1,1 + 0,22***
Кинетин 5,0 + ИМК 0,2 33,3 0 10,0 19,4 0,3 + 0,1*** 0,8 + 0,16***
Экспланты: л - лист, м - междоузлие.
Уровень значимости при *р < 0,05; **р < 0,01; ***р < 0,001.
С целью увеличения коэффициента размножения было апробировано 15 опытных вариантов сред (таблица 2). Контролем служила среда без гормонов. На междоузлиях и листьях в результате пролиферации каллуса и при последующей регенерации были получены растения-регенеранты. На междоузлиях спустя 4 недели культивирования во всех опытных вариантах формировался каллус плотной консистенции, блестящий, жёлто-зелёного цвета. На большинстве использованных сред к концу первого пассажа на каллусе наблюдали индукцию адвентивных почек. Наиболее интенсивный процесс побегообразования на междоузлиях отмечали на среде, содержащей 2 мг/л БАП. Число адвентивных почек на экспланте было равно 5-10 штук. В то же время в присутствии 2ip или кинетина в среде происходило снижение побегообразующей способности каллуса в 1,5-2 раза. На других средах при разных соотношениях БАП и ИМК выявлено уменьшение как частоты побегообразования до 20-50%, так и числа почек на экспланте до 1-10 штук. На средах, содержащих только 2,4-Д или в сочетании его с цитокининами, появление адвентивных почек на каллусе происходило только во втором пассаже после культивирования каллуса на безгормональной среде. Побегообразующая способность каллуса в этих вариантах опыта составляла 90% и 10-50% соответственно, а число адвентивных почек на экспланте было равно 1-7. Аналогичную картину отмечали на листьях. Однако в этом случае имеют место следующие особенности: листья в значительной степени некротизируют, а каллус, сформировавшийся на листьях, культивированных на средах с 2,4-Д, не являлся органогенным.
12
ВЕСНІК МДПУ імя І. П. ШАМЯКІНА
На третьем этапе исследована пересадка микрорастений берёзы чернокорой в почву. Растения были успешно адаптированы в почве.
Таким образом, в результате исследований, проведённых на B. obscura, также была получена стерильная культура, подобраны оптимальные среды для листовых эксплантов и междоузлий и разработан способ регенерации.
Выводы
Проведённые исследования показали возможность сохранения редких видов рода Betula благодаря использованию метода культуры клеток и тканей. Выявлена низкая пролиферирующая и органогенная способность культуры тканей B. nana при использовании в качестве эксплантов междоузлий. Для этого вида наиболее эффективный способ микроразмножения in vitro -размножение пазушными почками из верхушек побегов и меристемных тканей узлов при их культивировании на среде без гормонов либо с добавлением ИМК. У B. obscura выявлена высокая органогенная способность листовых эксплантов в сравнении с междоузлиями при культивировании на средах, дополненных БАП в концентрации 2-5 мг/л или БАП в той же концентрации в сочетании с 0,2 мг/л ИМК, а также на средах с 5 мг/л 2ip.
В результате выполненной работы предложен эффективный способ получения стерильной культуры B. nana L, получена стерильная культура и разработан способ регенерации B. obscura. Для последней на этапе мультипликации подобраны оптимальные среды для каждого типа использованных эксплантов.
Перечень принятых обозначений и сокращений
6-БАП (БАП) - 6-бензил-аминопурин;
2ip - (изопрен-2-ил)аденин;
TDZ - тидиазурон;
2,4-Д - 2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота;
ИМК - индолилмасляная кислота;
БАВ - биологически активные вещества;
мг/л - миллиграмм на 1 литр;
л - лист;
м - междоузлие.
Литература
1. Красная книга Республики Беларусь. Редкие и находящиеся под угрозой исчезновения виды дикорастущих растений / редкол.: Л. И. Хоружин (предс.) [и др.]. - Минск : Белорусская Энциклопедия (БелЭн), 2006. - 456 с.
2. Kewsura, A.-J. High Frequency of triploid birch hybrid by Betula nana seed parents / A.-J. Kewsura, T. Throsteinn // Hereditas. - 1999. - V. 130, N 2. - P. 191-193.
3. Парфёнаў, В. I. Цёмнакорая бяроза (Betula obscura Kotula ex Fiek) у флоры Беларусі / В. I. Парфёнаў, В. Ф. Пабiрушка // Весці АН БССР. Сер. 6іял. навук. - 1991. - № 5. - С. 3-8.
4. Концевая, И. И. Морфогенез в культуре тканей берёзы / И. И. Концевая, А. А. Яцына // Проблемы лесоведения и лесоводства : сб. науч. тр. - Гомель, 2003. - Вып. 56. - С. 70-77.
5. Lloyd, G. Commercially Feasible micropropagation of mountain laured, Kalmia latifolia by use of shoot-tip culture / G. Lloyd, B. McCown // Proc. Intl. Plant Prop. Soc. - 1980. - N 30. - P. 421-427.
6. Murashige, T. A revised medium for rapid growth and bioassay with tobacco tissue cultures / T. Murashige, F. Skoog // Physiol. Plant. - 1962. - V. 15, N 13. - P. 473-497.
Summary
The article deals with the maintenance & preservation of rare species of birch using the method of tissure culture. The results of studying the influence of the hormonal composition of the medium on morphogenesis of explants in vitro by dwarf and black rind. One gemma nodal segment of maternal plants at the stage of self-breading - nodal segments, internodels, leaves of one-months microplants were used as primary explants at the stage of introduction into a sterile culture.
Поступила в редакцию 20.01.11.
