CC BY
10
ЛИТЕРАТУРА
Короткое П. А., Ц я щ е н к о Ю. П., Янышева Н. Я. Гиг. и сан., 1967» № 9, с. 56.— К о п ы л о в а В. Д., Морозова Н. М., О л ь ш а н о в а К- М. и др-В кн.: Руководство по ионообменной распределительной и осадочной хроматографии. М., 1965, с. 125.— М а ц е к К-, Ханс И. М. (ред.) Хроматография на бумаге. М., 1965. с. 758.— В е г g m а п G. D., G г u е п w а 1 d Т., J. appl. Chem., 1957, v. 7, р. 15. — Kracht W., Wieland Т., Angew. Chem., 1957, Bd 69, р. 172.—M i с Ii e e I Т., Schminke W., Ibid., p. 334.—S potswoodT. M., J. Chromatogr., 1960, v. 3, p. 101.
Поступила 2/1X 1969 г.
УДК 615.28.099.07:57.085.23
ПРИМЕНЕНИЕ МЕТОДА ТКАНЕВЫХ КУЛЬТУР ПРИ ОПРЕДЕЛЕНИИ ТОКСИЧНОСТИ ПЕСТИЦИДОВ
О. Н. Елизарова, Д. П. Нуждина
Московский научно-исследовательский институт гигиены им. Ф. Ф. Эрисмана
Гигиеническая оценка пестицидов, широко внедряющихся в сельское хозяйство нашей страны, требует длительных токсикологических исследований. Естественно, встает вопрос о применении таких методов, которые позволили бы в наиболее короткие сроки дать ориентировочные сведения о токсичности того или иного пестицида. Для этой цели может быть использован метод тканевых культур. Он позволяет наблюдать в условиях, близких к естественным, биохимические и физиологические процессы, свойственные живым организмам и изменяющиеся под влиянием каких-либо вредных факторов.
Тканевые культуры широко применяются в различных отраслях биологии и медицины и весьма мало — в санитарно-токсикологическом эксперименте, хотя некоторые исследования показали ценность данного метода (Г. А. Гудзовский; Г. Н. Красовский и А. П. Ильницкий; П. Майкова; В. М. Перелыгин; Е. В. Штанников; Comoli и Perin; Kramer; Marks и Nagelschmidt и др.). Они свидетельствуют о высокой чувствительности тканевых культур к различным химическим соединениям, об определенной связи между интенсивностью и характером роста ткани и концентрацией вредных веществ.
Методические приемы работы с тканевыми культурами разработаны достаточно подробно. Но санитарно-токсикологический эксперимент отличается методическими особенностями, которые мы и стремились отработать.
Исследования проводились на однослойных перевиваемых культурах, являющихся удобной моделью для изучения биологических свойств клеток, а также процессов взаимодействия изучаемого яда и клетки. Мы пользовались 3 образцами перевиваемых тканей: 1) PMN — клетки почек эмбриона человека — копенгагенский и ленинградский штаммы, 2) СПЭВ — клетки почек эмбриона свиньи и 3) ПАО — клетки пахового узла обезьяны макака резус. Все эти тканевые культуры выращивали на среде 199 с добавлением нормальной бычьей сыворотки. В опытах применялись два методических приема выращивания клеток — на стенке пробирки и на предметных стеклах, опущенных в пробирки. О цитологическом эффекте судили по развитию дегенерации клеток.
При выращивании тканевых культур на стенках пробирок дегенеративные изменения учитывали визуально при малом увеличении. Величину их принято расценивать по 4-балльной системе, но мы ввели дополнительно балл 0,5, указывающий на самые первоначальные, пороговые изменения клеток. Каждая аппликация повторялась на 4 параллельных пробирках. При выращивании тканевых культур на предметных стеклах специфичес-
кое действие определялось непосредственным подсчетом под микроскопом после соответствующей окраски. Кроме того, выявлялась митотическая активность клеточных культур путем подсчета количества клеток, находящихся в различных стадиях деления.
При работе с тканевыми культурами имеет значение не только количество внесенного яда, но также и длительность экспозиции. Состояние монослоя культуры тканей проводилось через 4, 24, 48 и 52 часа после внесения ядовитого вещества в пробирки. В качестве объекта исследования были взяты пестициды группы карбаматов—цирам и цинеб. Точно взвешенные химикаты вносили в питательную среду и тщательно их размешивали до получения равномерной эмульсии, а затем путем разведения приготовляли нужные концентрации. В пробирках, где имелась тканевая культура с остров-ковым ростом, питательную среду заменяли средой с исследуемым ядохимикатом. Количества ядохимикатов были подобраны так, чтобы они примерно соответствовали количествам, примененным в тех опытах на животных, когда препараты вводились из расчета на 1 кг потребляемой животными пищи. В таких опытах цирам в количестве 100 мг на 1 кг пищи вызывал у подопытных крыс выраженные явления отравления; доза 10 мг/кг была пороговой, а 1 мг/кг — недействующей. Цинеб, рассчитанный также на 1 кг пищи, вызывал в количестве 2000 мг/кг токсическое действие, доза 200 мг/кг пищи была пороговой, а 20 мг/кг — недействующей.
Проведенные нами опыты показали наличие взаимосвязанного эффекта цитотоксического действия и концентрации вещества. Для тканевых культур были выявлены действующие, пороговые и недействующие концентрации исследованных ядов.
Использование культуры PMN, ПАОиСПЭВ к пестицидам относились неодинаково — более чувствительной оказалась тканевая культура PMN.
Как видно из табл. 1, чувствительность культуры PMN примерно на один порядок выше, чем двух других. Разница статистически достоверна. Дальнейшие исследования проводились на культуре PMN.
Таблица 1
Действие цннеба на тканевые культуры (в баллах)
Я * я* PMN спэв ПАО
экспозиция (в часах)
4 24 48 52 < 24 48 52 4 24 48 52
0,2 3,5 4,0 4,0 4,0 0,9 2,6 3,2 3,2 1,46 3,44 3,75 3,81
0,02 1,29 2,57 3,05 3,05 0,1 0,44 0,44 0,44 0,03 0,72 0,96 0,96
0,01 0 0,9 1,59 1,59 0 0 0 0 0 0 0 0
0,002 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
Для выявления цитотоксического действия цирама и цинеба в опытах, где клетки выращивали на предметных стенках, определяли число погибших клеток по отношению к живым (на каждом стекле подсчитывали по 200 клеток, затем вычисляли процент дегенерировавших).
Как видно из рис. 1, при введении цирама концентрация 0,001 мг/мл является действующей, 0,0001 мг/мл — пороговой, 0,00001 мг/мл — недействующей. При просмотре контрольных препаратов также находят небольшое количество погибших клеток, что является естественным процессом.
Следует отметить, что действие цирама развивается очень быстро — уже через 4 часа погибает значительное количество клеток. При большой концентрации их дегенерация увеличивается к 24 часам, при меньших концентрациях количество дегенерированных клеток постепенно уменьшается. Уменьшение с течением времени количества дегенерировавших клеток
объясняется тем, что часть из них на стекле не удерживается, они отпадают и потому, естественно, не могут быть учтены.
Характер действия цинеба (рис. 2) другой. Оно развивается медленно — через 4 часа почти все клетки выглядят нормальными. Только к 24 часам количество погибших клеток увеличивается, особенно резко оно увеличивается через 48 часов при действии большой концентрации. Известно, что
1
•I
30
20
Ю
4
* 30 V
V»
I
20
10
0 4 24 48
ЛроЗолжительыость экспозиции ((часа»)
Рнс. I. Гибель клеток в зависимости от концентрации цирама и продолжительности экспозиции. / — контроль; 2 — концентрация препарата 0,00001 мг/мл; 3 — концентрация препарата 0,0001 мг/мл; 4 — концентрация препарата 0,001 мг/мл.
/
/ / 3
0 4 24 4}
ЛроЗолжитс/гьнос/пь экспозиции ({часа)
Рис. 2. Гибель клеток в зависимости от концентрации цинеба и продолжительности экспозиции. 1 — контроль: 2 — концентрация препарата 0,002 мг/мл; 3 — концентрация препарата 0,01 мг/мл; 4 — концентрация препарата 0,02 мг/мл.
цинеб при некоторых условиях распадается на токсические соединения: сероводород, сероуглерод и др. Повышенная токсичность через 48 часов экспозиции при большой концентрации цинеба в какой-то мере может зависеть от появления токсических продуктов распада.
Как видно из табл. 2, тканевые культуры оказались более чувствительными к исследованным пестицидам, чем животные (крысы).
Митотическую активность клеток тканевых культур исследовали на тканевой культуре РЛШ. Для этого клетки выращивали на предметных стеклах, помещенных в пробирки. В определенные сроки (через 4, 24 и 48 часов) стекла вынимали, промывали в дистиллированной воде, закреп-
Таблица 2
Действие цирама и цинеба на тканевую культуру РЛ№ и животных
Тканевые культуры Животные (крысы)
Пестицид доза (в мг/мл)
действующая пороговая недействующая действующая пороговая недействующая
Цирам....... Цинеб ...... 0,001 0,02 0,0001 0,01 0,00001 0,002 0,1 2,0 0,01 0.2 0,01 0,02
ляли в 96° спирте в течение 20 мин., затем переносили в 70° спирт. Препараты окрашивали гематоксилином по Майеру с подкраской эозином; при помощи канадского бальзама клетки заключались под покровное стекло и изучали их митотические особенности под микроскопом при большом увеличении. На каждом стеклышке подсчитывали 2000—3000 клеток и на каждую тысячу определяли количество клеток с митозом, т. е. клетки в состоянии профазы, метафазы, анофазы, телофазы. Как видно из рис. 3 и 4, в контрольной тканевой культуре наибольший рост наблюдался через 4 часа, к 24 часам он становился меньше и резко снижался к 48 часам.
В случаях применения действующей и пороговой концентрации ци-рама (0,001 и 0,0001 мг/мл) рост клеток через 4 часа был примерно таким же, как в контроле, затем митотическая активность значительно увеличивалась к 24 часам и только к 48 часам она снижалась, приближаясь к контролю. В случае применения недействующей концентрации (0,00001 мг/мл) повторялся характерный рисунок контрольной культуры.
При действии цинеба через 4 часа наблюдалась некоторая задержка в росте. Но через 24 часа митотическая активность значительно превышала активность контрольной культуры и сохранялась даже через 48 часов. Наиболее ярко были выражены изменения при концентрации 0,02 и
I
ПроЗолжимельность зкслозиции (6 vacan)
Рис. 3. Митотическая активность клеток в зависимости от концентрации цирама и
продолжительности экспозиции. / — контроль; 2 — концентрация препарата 0,00001 мг/мл\ 3 — концентрация препарата 0.0001 мг/мл\ 4 — концентрация препарата 0,001 мг/мл.
Продолжительность зкепозиции ((часах)
Рис. 4. Митотическая активность клеток в зависимости от концентрации цинеба и продолжительности экспозиции. / — контроль; 2 — концентрация препарата 0,002 мг/мл: 3 — концентрация препарата 0,02 мг/мл; 4 — концентрация препарата 0,1 мг/мл.
0,01 мг/мл. При концентрации 0,002 мг/мл подъем митотической активности через 24 часа был выражен значительно слабо, а через 48 часов наблюдалось такое же торможение, как и в контроле.
По данным литературы (Ф. М. Коган и А. П. Дориновская), воздействие ядовитых факторов (асбестовой и змеевиковой пыли) вызывало усиление митотической активности. Е. В. Штанников, наоборот, наблюдал замедление роста ткани и ее митотической активности в результате действия вытяжек полимеров. Очевидно, тканевым культурам присущ разнонаправленный эффект митотической активности, зависящий от концентрации вещества и продолжительности экспозиции. При действии цирама и цинеба наблюдалось повышение митотической активности через 24 часа по сравнению с контролем.
Выводы
1. Пестициды цирам и цинеб оказывают выраженное цитотическое действие.
2. Степень специфической дегенерации коррелирует с величиной концентрации ядов и продолжительностью их воздействия. В опытах выявлены действующие, пороговые и недействующие концентрации цирама и цинеба.
3. Действие изученных пестицидов на тканевые культуры различно: цирам быстро вызывает цитопатогенный эффект, при действии цинеба этот эффект развивается медленно.
4. Тканевая культура РЛШ (клетки почек эмбриона человека) оказалась более чувствительной к ядам, чем тканевые культуры ПАО и СПЭВ.
5. Характер митотической активности клеток культур изменяется при введении цирама и цинеба.
6. Тканевые культуры оказались более чувствительными к действию изучения пестицидов, чем животные (крысы).
7. Метод тканевых культур может быть рекомендован для ускоренного определения ориентировочной токсичности пестицидов.
ЛИТЕРАТУРА
.Гудзонский Г. А. Гигиена труда в производстве сурьмы. Авторсф. дисс. докт. Фрунзе, 1966.— Коган Ф. М. Д о р и н о в с к а я А. П. Гиг. и сан., 1966, № 4, с. 33.— К р а с о в с к и и Г. Н., И л ь н и ц к и й А. П. Там же, 1967, № 5, с. 66.— Майкова О. П. В кн.: Вопросы гигиены и методики гигиенических исследований. Л., 1953, с. 65.— П е р е л ы г и и В. М. Гиг. и сан., 1964, № 5, с. 34.— Рязанова Р. А. Токсикологическая характеристика химикатов цирама и цинеба и гигиеническая оценка некоторых пищевых продуктов, обработанных йми. Автореф. дисс. канд. М., 1967.— Ш т а н н и-ков Е. В. Гиг. и сан., 1966, № 7, с. 59.— Со то Ii R., Per in R., Proc. Soc. exp. Biol. (N. Y.), 1963, v. 113, p. 289.— Kramer J., Z. Physik., 1952, Bd 133, S. 629.
Поступила 20/11 1970 r.
УДК 581.192.6:615.285.71:543.545
ХРОМАТОГРАФИ ЧЕСКИ Й МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ ОСТАТКОВ ХЛОРОФОСА В РАСТЕНИЯХ
Канд. хим. наук Е. С. Косматый, В. Н. Кавецкий Украинский научно-исследовательский институт защиты растений, Киев
Хроматополярографическое определение хлорофоса (ХФ) в растительных пробах очень громоздко и требует дорогого оборудования. Поэтому мы предприняли разработку экспресс-метода определения ХФ в растительных пробах методом хроматографии на бумаге.
РЫзсЬег и соавт. показали, что при стандартизованных условиях хроматографирования можно достаточно удовлетворительно определять следы неорганических веществ из водных сред по площади пятен, так как последние являются функцией концентрации. Е. С. Косматый и И. Б. Миронова определяли остатки хлорорганических пестицидов в почве и растениях по площади пятна.
В результате проведенных исследований мы предлагаем быстрый и достаточно простой метод определения ХФ в растениях. Навеску растительного материала (100 г) измельчают, помещают в колбу емкостью 500 мл, заливают хлороформом из расчета 1,5—2 мл на 1 г навески и встряхивают на шюттель-аппарате в течение часа. Жидкость декантируют через воронку с плотным фильтром в стакан, остаток образца промывают еще 4 раза небольшими порциями хлороформа. Полученный фильтр обезвоживают сернокислым натрием (безводным), а затем отфильтровывают в круглодонную колбу. Кристаллы сульфата натрия на фильтре промывают хлороформом 3—4 раза, который отгоняют на водяной бане почти досуха. Остаток хлороформа удаляют, пропуская теплый воздух (60°). Для дальнейшего извлечения ХФ сухой остаток в колбе обрабатывают 4 раза дистиллированной водой, каждый раз беря ее по 5—6 мл, воду сливают через воронку с фильтром в делительную воронку. Для извлечения посторонних веществ, мешающих определению остатков хлорофоса, водный экстракт взбалтывают с 15 мл гексана. Гексановый слой отбрасывают. Эту операцию повторяют примерно 3—4 раза. Для извлечения ХФ из водного раствора прибавляют в делительную воронку 35 мл хлороформа и взбалтывают 5 мин., дают разделиться слоям, слой хлороформа сливают в стакан. Операцию повторяют 4 раза. Хлороформ в стакане обезвоживают безводным сульфатом натрия таким же способом, как описано выше. Обезвоженный хлороформ фильтруют в колбу, отгоняют его на водяной бане до объема 0,5 мл, при помощи
