CC BY
12УДК 617.711 - 002 : 577.175.14 : 615.03 © Н.В. Иванова, Е.Ю. Короткова, 2015.
ПРИМЕНЕНИЕ ЛИПОФЛАВОНА ДЛЯ КОРРЕКЦИИ ЦИТОКИНОВОГО ДИСБАЛАНСА У БОЛЬНЫХ ХРОНИЧЕСКИМ НЕСПЕЦИФИЧЕСКИМ КОНЪЮНКТИВИТОМ
Н.В. Иванова, Е.Ю. Короткова*
Кафедра офтальмологии (зав. кафедрой - профессор Н.В. Иванова), Медицинская академия имени С.И. Георгиевского Федерального государственного автономного образовательного учреждения высшего образования «Крымский федеральный университет имени В.И. Вернадского»; 295006, г. Симферополь, бул. Ленина, 5/7. * Государственное учреждение здравоохранения Республики Крым «Крымская республиканская клиническая больница им. Н.А. Семашко»; 295017, г. Симферополь, ул. Киевская, 69. E-mail: CUClinic@mail.ru
APPLICATION OF LIPOFLAVON FOR CORRECTION OF THE CYTOKINE IMBALANCE IN PATIENTS WITH
CHRONIC NONSPECIFIC CONJUNCTIVITIS N.V. Ivanova, E.Yu. Korotkova
SUMMARY
Influence of flavonoid-lipoflavon (ophthalmic drops) in the experiment in vitro in patients with chronic conjunctivitis and imbalance of proinflammatory cytokines investigated. There is an activation of the system of local immunity, which is a pathogenetic substantiation of flavonoid-lipoflavon application in the complex treatment of patients with chronic conjunctivitis.
ЗАСТОСУВАННЯ Л1ПОФЛАВОНУ ДЛЯ КОРЕКЦП ЦИТОК1НОВОГО ДИСБАЛАНСУ У ХВОРИХ
ХРОН1ЧНИМ НЕСПЕЦИФ1ЧНИМ КОН'ЮНКТИВ1ТОМ Н.В. 1ванова, О.Ю. Короткова
РЕЗЮМЕ
Дослщжено вплив флавоно'щу-лтофлавону (очних крапель) в експеримент in vitro у па^ентв з хроычним кон'юнктивтом i дисбалансом прозапальних цитоиыв. Пщ впливом флавоно'щу-лтофлавону вщбуваеться актива^я системи мюцевого iмунiтету, що е патогенетичним обфунтуванням застосування флавоно'щу-лтофлавону в комплексному лкуваны хворих з хроычним кон'юнктивтом.
Ключевые слова: хронический конъюнктивит, цитокины, липофлавон.
Конъюнктивиты являются самой распространенной патологией среди воспалительных заболеваний глаз. Наиболее распространены конъюнктивиты бактериальной и вирусной природы, реже встречаются аллергические и дистрофические. По характеру течения заболевания конъюнктивиты подразделяют на острые и хронические [2].
Хронические конъюнктивиты (ХК) чаще встречаются у людей среднего и пожилого возраста, характеризуются длительным течением и частыми рецидивами. Терапия этих заболеваний всегда сложна и малоэффективна. В настоящее время продолжается поиск новых лекарственных средств, обладающих не только широким антимикробным действием, но и нормализующим факторы специфической защиты и иммунной резистентности организма [3].
«Дебютировавший» на уровне эпителия воспалительный процесс при конъюнктивите в дальнейшем может затрагивать все нижележащие слои, интерстициальную ткань и приводить к формированию основных морфологических, а также клинических проявлений конъюнктивита - гиперемии,
множественным фолликулам, инфильтрации, отеку (вплоть до хемоза), слизисто-гнойному отделяемому и др. [1, 7, 13].
Причины перехода регенерации в дисрегенера-цию могут быть разнообразными. Большое значение имеет обширное повреждение и особенно перманентное действие повреждающих факторов, так как они вызывают истощение защитных механизмов. Не менее важную роль играют сопутствующие состояния: недостаточность сосудистой или нервной трофики (тромбоз, венозный застой, лимфостаз, авитаминоз, сахарный диабет, угнетение кроветворения, воздействие ионизирующего излучения, заболевания печени и др. [8, 9, 10, 14].
Конъюнктивит - это мультифакторное заболевание, связанное с воспалительным процессом [11, 12, 15, 16]. Существенное влияние на пато- и морфогенез воспаления оказывают медиаторы воспаления, среди которых в последнее десятилетие особое внимание уделяется провоспалительным цитокинам (ГЬ-1р, ГЬ-4, Т№-а), изменяющим течение иммунных воспалительных реакций [6].
В нашей работе выделено два варианта течения ХК: с нормальным уровнем провоспалительных цитокинов (IL-ip, IL-4) в системном кровотоке и с повышенным уровнем цитокинов. Следует отметить, что у больных с повышенным уровнем цитокинов в системном кровотоке наблюдается более выраженный иммунный дисбаланс [5]. Для коррекции иммунного дисбаланса мы использовали препарат из группы флавоноидов - липофлавон. Липофлавон обладает противовоспалительным, репарационным, антиоксидантным действием. Это липосомальный препарат, изготовленный при помощи нанотехноло-гий. Использовался лиофилизированный порошок для приготовления глазных капель [4].
Целью исследования было изучить влияние флавоноида липофлавона на LPS-индуцированный синтез IL-ip, IL-4, TNF-a клетками эпителия конъюнктивы in vitro у больных хроническим неспецифическим конъюнктивитом.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Обследовано 78 человек (156 глаз). Из них 54 (108 глаз) больных с хроническим конъюнктивитом, которые были разделены на группы в зависимости от уровня провоспалительных цитокинов (IL-1P, IL-4 и TNF-a): 1-я группа - 25 больных ХК с физиологическим уровнем провоспалительных цитокинов в системном кровотоке, что составило 46,3%; 2-я группа - 29 больных ХК с повышенным уровнем
Как видно из таблицы 1, у больных 2-й группы в опытах 1 и 2 уровень ГЬ-1р в культуральной среде соответственно на 70,7% (р<0,001) и 21,4% (р<0,001) выше, чем у больных 1-й группы (в соответствующих опытах). Под влиянием LPS-стимула синтез клетками эпителия конъюнктивы цитокина
цитокинов в сыворотке крови (53,7%). Контролем служили 24 здоровых донора, показатели крови которых были приняты за норму.
Определение Ш-1Р, Ш-4 и Т№-а в сыворотке крови и культуральной среде культуры клеток эпителия конъюнктивы определяли иммунофер-ментным методом с использованием наборов (ООО «Цитокины» 1Ь-1р, протеиновый контур - ТМБ-а, ГЬ-4). Оценка результатов осуществлялась фотометрически.
Материалом исследования служили сыворотка крови доноров и соскобы конъюнктивы. С клетками эпителия конъюнктивы каждого донора проводилось несколько опытов: опыт 1 - культивация эпителия в термостате при 37°С в течение трех суток; опыт 2 -культивация в тех же условиях, но с преинкубацией клеток эпителия с липофлавоном (0,05 мл) перед введением в культуральную среду; опыт 3 - культивация в тех же условиях, но с липофлавоном (0,05 мл/мл культуральной среды) вводится непосредственно в культуральную среду.
Результаты исследований обработаны методами вариационной статистики по программе «Мedstat».
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Результаты исследования влияния липофлавона на LPS-индуцированный синтез ГЬ-1р клетками эпителия конъюнктивы у больных 1-й и 2-й групп представлены в таблице 1.
ГЬ-1р возрастает у больных 1-й и 2-й групп соответственно на 99,4% (р1<0,001) и 41,8% (р1<0,001), а в опыте с преинкубацией клеток с липофлавоном - статистически значимо снижается соответственно на 27,1% (р2<0,001) и 21,6% (р2<0,001). Таким образом, результаты наших экспериментов докумен-
Таблица 1
Влияние липофлавона на LPS-индуцированный синтез клетками эпителия конъюнктивы у больных 1-й и 2-й групп в % норме, принятой за 100%
Этапы эксперимента Стат. показ. 1-я группа 2-я группа
Опыт 1 (уровень IL-1p в культуральной среде без преинкубации с LPS) M±m n р 9,89±0,40 25 16,88±0,63 29 < 0,001
Опыт 2 (преинкубации клеток эпителия с LPS) M±m n р Р1 19,72±0,55 25 <0,001 23,94±0,78 29 <0,001 <0,001
Опыт 3 (преинкубации клеток эпителия с LPS ^ отмывание ^ преинкубации клеток эпителия с липофлавоном) M±m n р р1 р2 14,37±0,45 25 <0,001 <0,001 18,78±0,83 29 <0,001 <0,1 <0,001
Примечание: р - достоверность различий, высчитанная в сравнении с 1-й группой больных в соответствующем опыте, р1 - достоверность различий, высчитанная в сравнении с опытом 1 в той же группе больных, р2 - достоверность различий, высчитанная в сравнении с опытом 2 в той же группе больных.
тируют антицитокиновое (синтез клетками ГЬ-1Р) опытов по изучению влияния липофлавона на LPS-действие липофлавона на уровне тканей эпителия индуцированный синтез ГЬ-4 клетками эпителия конъюнктивы. конъюнктивы у больных 1-й и 2-й групп представ-
Результаты проведенных нами витральных лены в таблице 2.
Таблица 2
Влияние липофлавона на LPS-индуцированный синтез ^-4 клетками эпителия конъюнктивы
у больных 1-й и 2-й групп, пг/мл
Этапы опыта Стат. показ. 1-я группа 2-я группа
Опыт 1 (уровень IL-4 в культуральной среде без преинкубации с LPS) M±m n р 2,92±0,08 25 3,93±0,09 29 <0,001
Опыт 2 (преинкубации клеток эпителия с LPS) M±m n р Р1 3,84±0,11 25 <0,001 5,00±0,16 29 <0,001 <0,001
Опыт 3 (преинкубации клеток эпителия с LPS ^ отмывание ^ преинкубации клеток эпителия с липофлавоном) M±m n р р1 р2 3,08±0,11 25 <0,5 <0,001 3,99±0,09 29 <0,001 >0,5 <0,001
Примечание: р - достоверность различий, высчитанная в сравнении с 1-й группой больных в соответствующем опыте, р1 - достоверность различий, высчитанная в сравнении с опытом 1 в той же группе больных, р2 - достоверность различий, высчитанная в сравнении с опытом 2 в той же группе больных.
Анализ цифрового материала, представленного в таблице 2 свидетельствует о том что у больных 2-й группы исходный (в опыте 1) уровень ГЬ-4 в культуральной среде на 34,6% (р<0,001) выше, чем у больных 1-й группы. Под влиянием LPS-стимула у больных 1-й группы уровень синтезируемого клетками цитокина ^-4 возрастает на 31,5% (р1<0,001), у больных 2-й группы - на 27,2% (р1<0,001). При этом у больных 2-й группы клетки эпителия конъюнктивы в ответ на LPS-стимул (например, при инфекционно-зависимом обострении конъюнктивита) синтезируют достоверно более
высокий (на 30,2%, р<0,001) уровень ^-4.
В опыте с преинкубацией клеток с липофлавоном (опыт 3) исследованный показатель статистически значимо снижается (в сравнении с опытом 2) у больных как 1-й, так и 2-й групп. Указанные научные факты свидетельствуют о том, что антицитокиновое действие липофлавона, помимо 1Ь-1р, включает ингибицию LPS-зависимого синтеза клетками эпителия ГЬ-4.
Результаты опытов по изучению влияния ли-пофлавона на LPS-индуцированный синтез ТОТ-а клетками эпителия конъюнктивы у больных 1-й и 2-й групп представлены в таблице 3.
Таблица 3
Влияние липофлавона на LPS-индуцированный синтез TNF-a клетками эпителия конъюнктивы
у больных 1-й и 2-й групп, пг/мл
Этапы эксперимента Стат. показ. 1-я группа 2-я группа
Опыт 1 (уровень TNF-a в культуральной среде без преинкубации с LPS) M±m n р 23,06±0,76 25 31,67±0,81 29 < 0,001
Опыт 2 (преинкубации клеток эпителия с LPS) M±m n р Р1 28,26±0,93 25 <0,001 41,26±0,97 29 <0,001 <0,001
Опыт 3 (преинкубации клеток эпителия с LPS ^ отмывание ^ преинкубации клеток эпителия с липофлавоном) M±m n р Р1 р2 27,03±0,99 25 <0,01 <0,5 39,04±0,82 29 <0,001 <0,001 <0,1
Примечание: р - достоверность различий, высчитанная в сравнении с 1-й группой больных в соответствующем опыте, р1 - достоверность различий, высчитанная в сравнении с опытом 1 в той же группе больных, р2 - достоверность различий, высчитанная в сравнении с опытом 2 в той же группе больных.
Как видно из таблицы 3, у больных 2-й группы исходный (в опыте 1) уровень TNF-a в культуральной среде на 37,3% (р<0,001) выше, чем у больных 1-й группы. Под влиянием LPS-стимула у больных 1-й группы уровень синтезируемого клетками цитокина TNF-a возрастает на 22,5% (р1<0,001), у больных 2-й группы - на 30,3% (р1<0,001). Под влиянием преинкубации клеток с липофлавоном (опыт 3) статистически значимой динамики исследованного показателя не выявлено у больных как 1-й, так и 2-й групп.
Полученные результаты свидетельствуют о том, что антицитокиновое действие липофлавона включает подавление синтеза клетками эпителия IL-1ß, но не IL-4 и TNF-a.
Указанные факты расцениваются нами как патофизиологическое обоснование целесообразности использования липофлавона для ингибиции синтеза клетками эпителия IL-1ß у больных ХК, что может позволить повысить эффективность противовоспалительной терапии при ХК.
ВЫВОДЫ
1. Особенностью патогенеза хронического неспецифического конъюнктивита с повышенным уровнем IL-1ß в системном кровотоке является особая форма регенераторно-пластической недостаточности, характеризующаяся повышенным LPS-стимулированным синтезом цитокинов IL-1ß, IL-4 и TNF-a эпителиальными клетками.
2. Обнаружено липофлавон-опосредованное снижение LPS-стимулированного синтеза про-воспалительного цитокина IL-1ß, а также LPS-стимулированного синтеза лимфокина IL-4 клетками эпителия конъюнктивы больных хроническим конъюнктивитом.
3. Указанные факты можно расценивать как научное обоснование целесообразности использования липофлавона для коррекции цитокинового дисбаланса у больных хроническим конъюнктивитом, прежде всего, у лиц с повышенным уровнем IL-1ß в системном кровотоке.
ЛИТЕРАТУРА
1. Бржеский В. В. Роговично-конъюнктиваль-ный ксероз (диагностика, клиника, лечение) / В. В. Бржеский, Е. Е. Сомов. - СПб: «Сага», 2002. - 142 с.
2. Егоров А. Е. Лекролин и его роль в лечении аллергических заболеваний глаз / А. Е. Егоров // Клиническая офтальмология. - 2000. - № 2. - С. 57-58.
3. Иванова Н. В. Иммуноактивные свойства конъюнктивы при остром и хроническом конъюнктивитах / Н. В. Иванова // Офтальмологический
журнал. - 1998. - № 4. - С. 225-229.
4. Иванова Н. В. Клиническая эффективность применения липофлавона у больных с диабетической ретинопатией / Н. В. Иванова, Н. А. Ярошева // Офтальмологический журнал. - 2008. - № 6. - С. 43-49.
5. Иванова Н. В. Уровень провоспалительных цитокинов у больных с хроническими конъюнктивитами / Н. В. Иванова, Е. Ю. Короткова // Проблемы, достижения и перспективы развития медико-биологических наук и практического здравоохранения : сб. трудов Крымского государственного медицинского университета им. С. И. Георгиевского. - Симферополь, 2009.-Т. 145, Ч. I. - С. 129.
6. Ковальчук Л. В. Система цитокинов / Коваль-чук Л. В., Ганковская Л. В., Рубакова Э. И. - М.: Медицина, 1999. - 343 с.
7. Майчук Ю. Ф. Лекролин в лечении хронических аллергических конъюнктивитов / Ю. Ф. Майчук // Русский медицинский журнал. - 1999. - № 1. - С. 20-22.
8. Струков А. П. Воспаление / А. П. Струков, В. С. Пауков, О. Я. Кауфман // Общая патология человека. - М.: Медицина, 1990. - С. 3-73.
9. Шехтер А. Б. Репаративная регенерация и дис-регенерация (роль межклеточных взаимодействий) // Совр. пробл. регенерации. - Йошкар-Ола, 1994.
- С. 48-63.
10. Шехтер А. Б. Склеротические процессы / А. Б. Шехтер // Общая патология человека. - М.: Медицина, 1990. - Т. 2. - С. 124-150.
11. Accumulation of Th-2-like helper T cells in the conjunctiva of patients with vernal conjunctivitis / E. Maggi, P. Biswas, G. Del Prete [et al.] // J. Immunol. -1999. - Vol. 146. - P. 1169-1174.
12. Cytokine production and mRNA expression by conjunctival T cell lines in chronic allergic eye diseases / V. L. Calder, G. Jolly, M. Hingorani [et al.] // Clin. Exp. Aller. - 1999. - Vol. 29. - P. 1214-1222.
13. Friendlander M. N. Current ocular therapy / Ed. F. T. Frannfeder, F. H. Roy, J. W. B. Randall. - Saunders Comp., 2000. - 323 p.
14. Hurley J. V. Acute inflammation / J. V. Hurley.
- Baltimor: Williams and Wilkins Co, 1999. - 250 p.
15. Identification of local Th2 and Th0 lymphocytes in vernal conjunctivitis using flow cytometry / A Leonardi., D. G. Franchis, F. Zancanaro [et al.] // Invest. Ophthalmol Vis Sci. - 1999. - Vol. 40. - P. 3036-3040.
16. Razzaque M. S. Tissue and molecular events in human conjunctival scarring in ocular cicatricial pemphigoid / M. S. Razzaque, C. S. Foster, A. R. Ahmed // Histol. Histopathol. - 2001. - Vol. 16. - P. 1203-1212.
