CC BY
13ИИИНиЯИНИИМВМИНВИИИ
УДК : 616.36+ 616.24+ 616.155.3: 615.3
Влияние пентоксифиллина на плазмин-индуцированную функциональную активность культуры клеток мононуклеарных лейкоцитов у больных с сочетанной гепатопульмональной патологией
М. А. Захарова
Крымский государственный медицинский университет им. С.И. Георгиевского, Симферополь.
Ключевые слова: пентоксифиллин, плазмин, лейкоциты, цитокины, цирроз печени, хроническое обструктивное заболевание лёгких
В рамках современного учения о воспалении важнейшее участие мононуклеарных лейкоцитов в инициации, течении и разрешении воспалительных процессов любого генеза, характера и локализации (включая печень и бронхолегочную систему) представляется бесспорным [1]. В рамках же "цитокино-вой" патогенетической концепции хронического воспаления мононуклеары относятся к основным "цитокинпродуцирую-щим" клеткам [12]. Убедительно доказано модулирующее влияние мононуклеар-ных лейкоцитов на цитокиновый потенциал (включая фиброгенные цитокины) и на уровне тканей печени и легких [7]. При гистохимическом исследовании также установлено, что помимо фагоцитов, Т-лимфоциты при ХОЗЛ - наиболее часто встречающиеся, а при фиброзе печени - часто встречающиеся клетки т 1око тогЫ [4, 6].
Известно также, что такие факторы фи-бринолиза (образующиеся т 1око тогЫ), как активная форма фибринолитического фермента - плазмин, а также активаторы плазминогена относятся к активаторам (включая №-кВ-зависимым) синтеза широкого спектра цитокинов мононуклеар-ными лейкоцитами, клетками сосудистого эндотелия, а также активаторами системы MMPs [10]. Эффективная репара-тивная регенерация как печени, так и слизистой оболочки бронхов и легочной паренхимы, а также TGF-p1-зависимый апоптоз фибробласта (важнейший момент в развитии фиброзообразования) регулируются плазмином, плазминогеном и активаторами плазминогена [14, 15, 16].
Доказано существование системы плаз-мин-опосредованной активации фактора роста TGF-p1 и MMPs [9].
Поиск путей коррекции цитокинового гомеостаза при хронических воспалительных заболеваниях позволил выявить пентоксифиллин-зависимую модуляцию синтеза лимфоцитами инсулиноподобно-го фактора роста, фактора роста фи-бробластов-2, а также ингибирующее влияние препарата на синтез и биологические эффекты Т№-а, ^-8 и ^-6 [5, 8, 13].
С учетом вышесказанного продолжение научного поиска по проблемам пен-токсифиллин-зависимой функциональной активности лейкоцитов у больных с соче-танной гепатопульмональной патологией и оценка полученных фактов с сано- и патогенетических позиций представляется нам перспективным научным направлением, раскрывающим новые возможности дифференцированной терапии заболевания.
Основной целью исследования явилось научное обоснование целесообразности использования и оценка клинической эффективности применения пентоксифил-лина для коррекции цитокинового (факторы роста) гомеостаза в комплексном лечении цирроза печени, протекающего в сочетании с хроническим обструктивным заболеванием легких. в настоящей работе нами предпринята попытка подойти к проблеме расшифровки патогенетических особенностей сочетанного течения ХОЗЛ и ЦП с позиции оценки пентокси-филлин-зависимого плазмин-индуциро-ванного синтеза цитокинов культурой мо-
нонуклеарных клеток в эксперименте in vitro.
Материал и методы
Под наблюдением состояло 35 больных ЦП (преимущественно - алкогольного генеза), разделенных на две группы. В 1-ю группу вошли 16 больных, страдающих ЦП (контрольная группа), во 2-ю группу - 19 больных с сочетанным течением ЦП и ХОЗЛ I-II степени тяжести (опытная группа).
Нами использован модифицированный метод краткосрочных органных культур, обеспечивающий культивирование моно-нуклеарных лейкоцитов in vitro по Лурия Е.А. [2, 3]. Уровень цитокинов в культу-ральной среде культуры мононуклеарных лейкоцитов определяли иммунофермент-ным методом с использованием коммерческих наборов (ООО "Цитокины" (Россия) IL-1I, протеиновый контур - TNF-a, IL-4). Содержание в культуральной среде активной формы трансформирующего фактора роста p1 (TGF- р1) определяли методом иммуноферментного анализа с использованием тест-системы "TGFp1 Emax® ImmunoAssay System" (Promega, США). Оценка результатов осуществлялась фотометрически.
Результаты и обсуждение
Результаты исследования пентоксифил-лин-зависимого плазмин-индуцированно-го синтеза уровня цитокинов в культу-ральной среде культуры мононуклеарных клеток больных 1-й и 2-й групп представ-
Табл. 1
Влияние пентоксифиллина на плазмин-индуцированный синтез цитокинов культурой мононуклеарных клеток у больных 1-й и 2-й групп, пг/мл культуральной среды
Показатель Этап эксперимента Стат. показ. 1-я группа, n = 16 2-я группа, n = 19
TGF-ß1 Эксперимент 1 (уровень TGF-P1 в культуральной среде) M ± m Р Р1 39,87 ± 1,39 47,13 ± 1,55 < 0,001
Эксперимент 2 (преинкубация клеток с плазмином ^ культивация) M ± m р р1 53,80 ± 1,80 < 0,001 58,78 ± 2,56 < 0,001 < 0,2
Эксперимент 3 (преинкубация клеток с плазмином ^ отмывание клеток ^ инкубация клеток с пентоксифиллином ^ культивация) M ± m р р1 41,20 ± 1,75 > 0,5 48,03 ± 1,67 > 0,5 < 0,001
TNF-a Эксперимент 1 (уровень Т^-а в культуральной среде) M ± m р р1 15,25 ± 0,65 19,59 ± 0,95 < 0,001
Эксперимент 2 (преинкубация клеток с плазмином ^ культивация) M ± m р р1 23,08 ± 0,99 < 0,001 29,95 ± 1,48 < 0,001 < 0,001
Эксперимент 3 (преинкубация клеток с плазмином ^ отмывание клеток ^ инкубация клеток с пентоксифиллином ^ культивация) M ± m Р Р1 18,25 ± 0,88 < 0,01 22,52 ± 0,95 < 0,05 < 0,001
IL-1ß Эксперимент 1 (уровень в культуральной среде) M ± m Р Р1 22,08 ± 0,75 36,69 ± 1,71 < 0,001
Эксперимент 2 (преинкубация клеток с плазмином ^ культивация) M ± m Р Р1 33,26 ± 1,58 < 0,001 51,28 ± 1,96 < 0,001 < 0,001
Эксперимент 3 (преинкубация клеток с плазмином ^ отмывание клеток ^ инкубация клеток с пентоксифиллином ^ культивация) M ± m Р Р1 26,92 ± 1,22 < 0,001 44,84 ± 1,67 < 0,001 < 0,001
IL-4 Эксперимент 1 (уровень ^-4 в культуральной среде) M ± m Р Р1 3,41 ± 0,15 5,45 ± 0,31 < 0,001
Эксперимент 2 (преинкубация клеток с плазмином ^ культивация) M ± m Р Р1 6,05 ± 0,33 < 0,001 8,33 ± 0,38 < 0,001 < 0,001
Эксперимент 3 (преинкубация клеток с плазмином ^ отмывание клеток ^ инкубация клеток с пентоксифиллином ^ культивация) M ± m Р Р1 5,97 ± 0,40 < 0,001 7,65 ± 0,34 < 0,001 < 0,01
Примечание: р - достоверность различий, высчитанная в сравнении с экспериментом 1 в той же группе больных, р1 - достоверность различий, высчитанная в сравнении с 1-й группой больных в соответствующем эксперименте.
лены в табл. 1
Нами установлено, что особенностью патогенеза сочетанного течения ЦП и ХОЗЛ является повышенный синтез фактора роста мононуклеарными лейкоцитами: у больных 2-й группы уровень активной формы TGF-ß1 в культуральной среде на 18,2 % (р1 < 0,001) выше, чем у больных 1-й группы. В эксперименте 2 выявлена плазмин-индуцированная стимуляция синтеза клетками фактора роста: у больных 1-й группы уровень активной формы TGF-ß1 в супернатанте культуры клеток возрастает на 34,9 % (р < 0,001), у больных 2-й группы - на 24,7 % (р < 0,001). В эксперименте 3 под влиянием преинкубации клеток с пентоксифилли-ном имеет место отмена плазмин-инду-цированной стимуляции синтеза клетками эпителия бронхов TGF-ß1: исследованный показатель возвращается к исходному (в опыте 1) уровню у больных как 1-й, так и 2-й групп.
Уровень цитокина TNF-a в культураль-ной среде культуры мононуклеарных клеток у больных 2-й группы на 28,5 % (р1 < 0,001) выше, чем у больных 1-й группы, а под влиянием инкубации клеток с плаз-мином имеет место статистически значимая стимуляция синтеза TNF-a монону-клеарными клетками у больных как 1-й (на 51,3 %, р < 0,001), так и 2-й (на 52,9 %, р < 0,001) групп. Ранее синтез TNF-a мононуклеарными клетками (при дерматологической патологии) исследовали Kapp A. и соавт. (1997) [11].
Выявлено также, что в эксперименте 3
исследованный показатель Т^-а статистически значимо снижается (достоверность различий между экспериментом 2 и 3 в одной и той же группе больных < 0,001), но не достигает исходного (в эксперименте 1) уровня.
Нами также установлено, что у больных 2-й группы уровень ^-1р в суперна-танте культуры мононуклеарных клеток на 66,2 % (р1 < 0,001) выше, чем у больных ЦП без фоновой патологии бронхо-легочной системы (1-я группа) и продолжает оставаться достоверно повышенным (в сравнении с 1-й группой) в экспериментах 2 и 3. Под влиянием инкубации клеток с активной формой фибринолити-ческого фермента - плазмином исследованный показатель возрастает на 50,639,8 % (р < 0,001) у больных как 1-й, так и 2-й групп, а в опыте 3 под влиянием пентоксифиллина имеет место частичная отмена плазмин-индуцированного синтеза ^-1р: показатель у больных 1-й и 2-й групп снижается, но не возвращается к исходному (в эксперименте 1) уровню.
Исходный (в опыте 1) уровень лимфо-кина ^-4 в культуральной среде культуры мононуклеарных лейкоцитов у больных 2-й группы существенно выше (на 59,8 %, рх < 0,001) чем у больных 1-й группы, статистически значимо возрастает в экспериментальной модели с преин-кубацией клеток с плазмином (на 77,4 -52,8 %, р < 0,001) и не меняется под влиянием инкубации клеток с пентоксифилли-ном (эксперимент 3).
Таким образом, результаты наших экспериментов документируют антицитоки-
новое (плазмин-индуцированный синтез мононуклеарными лейкоцитами TGF-p1, Тда-а и ^-1р) действие пентоксифилли-на в витральном эксперименте.
Выводы
Таким образом, анализ представленных нами научных фактов позволяет сделать следующие выводы:
1. У больных ЦП, протекающем в сочетании с ХОЗЛ, в культуральной экспериментальной модели выявлен повышенный плазмин-индуцированный синтез мононуклеарными лейкоцитами фактора роста TGF-p1, провоспалительных цито-кинов (со свойствами факторов роста) Тда-а и ^-1р, а также лимфокина ^-4, что формирует условия для хронизации (прогрессирования) патологического процесса как в печени, так и в бронхолегоч-ной системе.
2. Пентоксифиллин обладает способностью модулировать плазмин-индуциро-ванный синтез мононуклеарными лейкоцитами TGF-p1, Т^-а и ^-1р, что является патофизиологическим обоснованием использования препарата в комплексной (антифибротической) терапии сочетанной гепатопульмональ-ной патологии.
Литература
1. Лебедев К.А., Понякина И.Д.. Иммунограмма в клинической практике. — М.: Наука, 1990. — 224 с.
2. Лурия ЕА. Кроветворная и лимфоидная ткань в культурах. — М.: Медицина, 1972. — 176 с.
3. Лурия ЕА. Органные культуры кроветворной и
лимфоидной ткани: Автореф. дис. ..д-ра биол. наук: 03.099 / Академия мед. наук СССР. - М., 1972. -37 с.
4. Cellular and molecular mechanisms in chronic obstructive pulmonary disease: an overview / Di Stefano A., Caramori G., Ricciardolo F.L. et al. // Clin. Exp. Allergy. - 2004. - Vol.34(8) - P. 1156-1167.
5. Colson A., Willems B., Thissen J.P. Inhibition of TNF-alpha production by pentoxifylline does not prevent endotoxin-induced decrease in serum IGF-I / / J. Endocrinol. - 2003. - Vol 178, №1. - P.101-109.
6. Diehl A.M. Cytokine regulation of liver injury and repair // Immunol. Rev. - 2000. - Vol.174. - P. 160171.
7. Friedman S.L. Cytokines and fibrogenesis // Semin. Liver Dis. - 1999. - Vol.19. - P. 129-140.
8. Gonta A, Dan G.-A., Codita I. Effects of pentox-ifylline on TNF-alpha and endothelial dysfunction in pa-
tients with severe heart failure / / Eur. J. Heart Failure. -2000. - Vol. 2, Suppl.1. - P. 9-19.
9. Inhibition of plasminogen activators or matrix metal-loproteinases prevents cardiac rupture but impairs therapeutic angiogenesis and causes cardiac failure / S.Hey-mans, A.Luttun, D.Nuyens et al. / / Nat. Med. - 1999.
- Vol.5. - P. 1135-1142.
10. Jutel M. Adhesion molecules in allergic inflammation / Allergology & Clinical Immunology International.
- 1999. - Vol.5, №3. - P. 153-158.
11. Kapp A., Textor A., Krutmann J., Moller A. Im-munomodulating cytokines in atopic dermatitis and psoriasis: production of tumour necrosis factor and lymphotoxin by mononuclear cells in vitro // Br. J. Dermatol. - 1997.
- Vol. 122(5). - P. 587-592.
12. O'Donnell R., Breen D., Wilson S., Djukanovic R. Inflammatory cells in the airways in COPD / / Thorax. - 2006.-Vol.61. - P.448-454.
13. Pentoxifylline protects L929fibroblasts from TNF-a toxicity via the induction of heme ooxygenase-1 / G.-S.Oh, H.-O.Pae, M.-K.Moon et al. // Biochem. Biophys. Resear. Communic. - 2003. - Vol.302, №1. - P. 109113.
14. Plasminogen activation induced pericellular fibronectin proteolysis promotes fibroblast apoptosis / J.C. Horowitz, D.S. Rogers, R.H. Simon et al. // Am.
J. Respir. Cell. Mol. Biol. - 2008. - Vol.38, №1. - P.
78-87.
15. Plasminogen deficiency results in poor clearance of non-fibrin matrix and persistent activation of hepatic stellate cells after an acute injury / V.L. Ng, G.E. Sabla, H.Melin-Aldana et al. // J. Hepatol. - 2001. - Vol. 35. - P. 881-889.
16. Spurzem J.R., Rennard S.I. Pathogenesis of COPD // Semin. Respir. Crit. Care. Med. - 2005. -Vol.26. - P. 142-153.
Вплив пентоксифтшу на плазмшчндуковану функцюнальну актившсть культури кл^ин мононуклеарних лейкоци^в у хворих з поеднаною гепатопульмональною патолопею
М. А. Захарова
У хворих на цироз печ1нки (ЦП), що протжае в поеднанш з хрошчним обструктивним захворюванням леген1в (ХОЗЛ), вивчено вм^т цитоюшв у культуральному середовищi культури мононуклеарних лейкоцилв i установлено, що при поеднанш гепатопульмональнш патологи зростае плазмш-шдукований синтез мононуклеарними лейкоцитами фактора роста TGF-p1, прозапальних цитоюшв (i3 властивостями факторiв роста) TNF-a i IL-1p, а також лiмфокiну IL-4, що формуе умови для хрошзацп (прогресування) патолопчного процесу як в печшщ, так i в бронхолегеневш системь Шд впливом введення в культуральне середовище пентоксифшшу плазмш-щдукований синтез мононуклеарними лейкоцитами TGF-p1, TNF-a i IL-1p знижуеться, що е патофiзiологiчним обГрунтуванням використання препарату в комплекснш (антифiбротичнiй) терапи поеднано!" гепатопульмонально!" патологи.
Ключовi слова: пентоксифшш, плазмш, лейкоцити, цитокши, цироз печшки, хрошчне обструктивне захворювання легешв.
The influence of pentoxyphilline upon plasmin-induced functional activity of cellular culture of mononuclear leukocytes in patients with combined hepato-pulmonary pathology
M. A. Zakharova
In patients with liver cirrhosis (LC) in combination with chronic obstructive pulmonary disease (COPD) the concentration of cytokines in culture medium of mononuclear leucocytes was established. It is proved, that mononuclear leucocytes increase plasmin-induced synthesis of ground factor TGF-p1, pro-inflammatory cytokines (with ground factor features) TNF-a and IL-1p, and lymphokine IL-4 in combined hepatopulmonary pathology. It forms background for chronic course (progression) of pathology not only in the liver, but also in bronchopulmonary system. The plasmin-induced synthesis by mononuclear leucocytes of ground factors TGF-p1, TNF-a and IL-1p decreases upon the influence of pentoxyphilline in culture medium. This fact is pathogenetical grounding of the usage of the medicine in the complex (antifibrotic) therapy of combined hepatopulmonary pathology.
Key words: pentoxyphilline, plasmin, leucocytes, cytokines, liver cirrhosis, chronic obstructive pulmonary disease.
