CC BY
11иииниииниииивминвиии
УДК : 616.24+616.36-004:612.112
Динамика функциональной активности мононуклеарных лейкоцитов под влиянием активатора плазминогена мочевого типа у больных с сочетанной гепатопульмональной патологией
М. А. Захарова, В. Ф. Кубышкин
Крымский государственный медицинский университет им. С.И. Георгиевского, Симферополь Ключевые слова: мононуклеарные лейкоциты, цитокины, цирроз печени, хроническое обструктивное заболевание лёгких
Известно, что в патогенезе хронических неспецифических заболеваний как печени, так и органов дыхания особое значение уделяется двум взаимосвязанным процессам: активности воспалительного (дистрофического) процесса и интенсивности фиброобразова-ния [6, 7, 17, 24]. Обсуждается роль генетических дефектов в развитии генерализованного поражения эластических волокон, объясняющих такую сочетанную патологию, как эмфизема легких, цирроз печени (ЦП) и аневризмы сосудов [16]. Возможным подтверждением этой концепции является связь идентифицированного кЬи М. и Teramoto S. (2007) у больных ХОЗЛ гена Е1А с повышенным синтезом TGF-p, 1САМ-1 и ^-8 эпителиальными клетками [14]. Liebhart J. и соавт. (2005) относят генный полиморфизм TGF-p1 к существенным факторами риска хронического обструктивного заболевания легких (ХОЗЛ), а Хие К и соавт. (2003) - к факторам риска ЦП [26].
Нужно подчеркнуть, что расшифровка в последнее десятилетие цитокин-зависи-мых процессов иницииации, течения и формирования исходов воспалительных процессов различного генеза и локализации существенно дополнила учение о воспалении [2, 8, 10]. В рамках же современной "цитокиновой" патогенетической концепции хронического воспаления к основным "цитокинпродуцирующим" клеткам относятся мононуклеарные лейкоциты [18]. Так, убедительно доказано модулирующее влияние мононуклеарных лейкоцитов на цитокиновый потенциал (включая фиброгенные цитокины) и на уровне тканей печени и легких [11].
С другой стороны, к активаторам (включая №-рВ-зависимым) синтеза ши-
рокого спектра цитокинов мононуклеар-ными лейкоцитами и клетками сосудистого эндотелия относятся такие факторы фибринолиза (образующиеся in loko morbi), как активаторы плазминогена -кровяной, тканевый, а также присутствующий в системном кровотоке мочевой (урокиназа, urokinase-type plasminogen activator - uPA) и активная форма фибри-нолитического фермента - плазмин [15]. Плазмин, плазминоген и активаторы плазминогена относятся к модуляторам репаративной регенерации как печени, так и слизистой оболочки бронхов и легочной паренхимы, а также TGF-pl-зави-симого апоптоза фибробласта - важнейшего момента в развитии фиброзообразо-вания [20, 21, 25].
Очевидная в рамках "цитокиновой" патогенетической концепции хронических заболеваний воспалительного характера научная обоснованность коррекции цито-кинового (включая факторы роста) го-меостаза позволила, в частности, выявить пентоксифиллин-зависимую модуляцию синтеза лимфоцитами инсулиноподобно-го фактора роста, фактора роста фи-бробластов-2, а также ингибирующее влияние препарата на синтез и биологические эффекты TNF-a , IL-8 и IL-6 [9, 12, 19]. Эти факты явились для нас научной аргументацией включения в сферу научного поиска изучение пентоксифил-лин-зависимой функциональной активности лейкоцитов.
Основной целью исследования явилось научное обоснование целесообразности использования и оценка клинической эффективности применения пентоксифил-лина для коррекции цитокинового (факторы роста) гомеостаза в комплексном лечении ЦП, протекающего в сочетании с
ХОЗЛ. В настоящей работе нами предпринята попытка подойти к проблеме расшифровки патогенетических особенностей сочетанного течения ХОЗЛ и ЦП с позиции оценки пентоксифиллин-зависи-мого uPA-индуцированного синтеза цито-кинов мононуклеарными клетками в культуральном эксперименте in vitro.
Материал и методы
Под наблюдением состояло 35 больных ЦП (преимущественно - алкогольного ге-неза), разделенных на две группы. В 1-ю группу вошли 16 больных, страдающих ЦП (контрольная группа), во 2-ю группу - 19 больных с сочетанным течением ЦП и ХОЗЛ I-II степени тяжести (опытная группа).
Нами использован модифицированный метод краткосрочных органных культур, обеспечивающий культивирование моно-нуклеарных лейкоцитов in vitro по Лурия Е.А. [3, 4]. Уровень цитокинов в культу-ральной среде культуры мононуклеарных лейкоцитов определяли иммунофермент-ным методом с использованием коммерческих наборов (ООО "Цитокины" (Россия) IL-1b, протеиновый контур - TNF-a, IL-4). Содержание в культуральной среде активной формы трансформирующего фактора роста p1 (TGF- р1) определяли методом иммуноферментного анализа с использованием тест-системы "TGFp1 Emax® ImmunoAssay System" (Promega, США). Оценка результатов осуществлялась фотометрически.
Результаты и обсуждение
Результаты исследования пентоксифил-лин-зависимого uPA -индуцированного
Табл. 1
Влияние пентоксифиллина на uPA-индуцированный синтез цитокинов культурой мононуклеарных клеток у больных 1-й и 2-й групп, пг/мл культуральной среды
Показа-тель Этап эксперимента Стат. показ. 1-я ГРуппа, n = 16 2-я ГРуппа, n = 19
TGF-P1 Эксперимент 1 (уровень TGF-P1 в культуральной среде) M ± m Р Р1 39,87 ± 1,39 47,13 ± 1,55 < 0,001
Эксперимент 2 (преинкубация клеток с иРА ^ культивация) M ± m Р Р1 41,14 ± 1,68 > 0,5 49,92 ± 1,81 < 0,5 < 0,001
Эксперимент 3 (преинкубация клеток с иРА ^ отмывание клеток ^ инкубация клеток с пентоксифиллином ^ культивация) M ± m Р Р1 40,87 ± 1,43 > 0,5 45,83 ± 1,37 > 0,5 < 0,02
TNF-a Эксперимент 1 (уровень Т^-а в культуральной среде) M ± m Р Р1 15,25 ± 0,65 19,59 ± 0,95 < 0,001
Эксперимент 2 (преинкубация клеток с иРА ^ культивация) M ± m Р Р1 17,61 ± 0,54 < 0,01 21,39 ± 0,96 < 0,2 < 0,001
Эксперимент 3 (преинкубация клеток с иРА ^ отмывание клеток ^ инкубация клеток с пентоксифиллином ^ культивация) M ± m Р Р1 16,88 ± 0,75 < 0,2 20,52 ± 0,97 < 0,5 < 0,01
IL-1P Эксперимент 1 (уровень в культуральной среде) M ± m Р Р1 22,08 ± 0,75 36,69 ± 1,71 < 0,001
Эксперимент 2 (преинкубация клеток с иРА ^ культивация) M ± m Р Р1 23,27 ± 0,91 < 0,5 35,90 ± 1,19 > 0,5 < 0,001
Эксперимент 3 (преинкубация клеток с иРА ^ отмывание клеток ^ инкубация клеток с пентоксифиллином ^ культивация) M ± m Р Р1 22,48 ± 0,56 > 0,5 35,25 ± 1,21 > 0,5 < 0,001
IL-4 Эксперимент 1 (уровень ^-4 в культуральной среде) M ± m Р Р1 3,41 ± 0,15 5,45 ± 0,31 < 0,001
Эксперимент 2 (преинкубация клеток с иРА ^ культивация) M ± m Р Р1 2,56 ± 0,12 < 0,001 4,14 ± 0,21 < 0,001 < 0,001
Эксперимент 3 (преинкубация клеток с иРА ^ отмывание клеток ^ инкубация клеток с пентоксифиллином ^ культивация) M ± m Р Р1 2,06 ± 0,10 < 0,001 3,05 ± 0,12 < 0,001 < 0,001
Примечание: р - достоверность различий, высчитанная в сравнении с экспериментом 1 в той же группе больных, р1 - достоверность различий, высчитанная в сравнении с 1-й группой больных в соответствующем эксперименте.
синтеза уровня цитокинов в культураль- клеарными клетками, что может высту- растание уровня IL-4 коррелирует с воз-ной среде культуры мононуклеарных кле- пать в качестве существенного патогене- растанием уровня TGF-p1 и, напротив, ток больных 1-й и 2-й групп представле- тического механизма трансформации ре- снижение уровня лимфокина приводит к ны в табл. 1. паративной регенерации тканей в дисре- резкому снижению уровня TGF-p1,
Анализ представленного в табл. цифро- генерацию за счет нарушения кинетики уменьшению как легочного фиброза, так вого материала свидетельствует, что ди- воспалительного процесса [1, 5]. и фиброза печени [13, 22, 23]. Установле-
намики синтеза активной формы TGF-p1 Нами также установлено, что уровень но также, что пентоксифиллин обладает культурой мононуклеарных клеток под IL-1p в супернатанте культуры монону- способностью усиливать цитокин-моду-влиянием uPA у больных как 1-й, так и 2- клеарных клеток у больных 1-й и 2-й лирующее влияние uPA за счет возможной групп не выявлено. Установлено также, групп под влиянием инкубации клеток с го IL-4-опосредованного снижения уров-что при отсутствии uPA-индуцированно- uPA в экспериментах 2 и 3 в сравнению с ня факторов роста в очаге воспаления. го синтеза активной формы TGF-p1 от- экспериментом 1 (в той же группе) суще- Таким образом, анализ представленных сутствует и пентоксифиллин-зависимое ственно не меняется. нами научных фактов позволяет сделать
снижение исследованного показателя Под влиянием инкубации клеток с uPA следующие выводы:
(эксперимент 3). уровень лимфокина IL-4 в культуральной 1. У больных ЦП, протекающем в соче-
Под влиянием инкубации клеток с uPA среде культуры мононуклеарных лейко- тании с ХОЗЛ, в культуральной экспери-(эксперимент 2) имеет место статистиче- цитов у больных 1-й группы снижается ментальной модели выявлен повышен-ски значимая стимуляция синтеза TNF-a на 24,9 % (р < 0,001), у больных 2-й груп- ный синтез мононуклеарными лейкоци-мононуклеарными клетками только у пы - на 24,0 % (р < 0,001). В сравнении с тами фактора роста TGF-p1, провоспали-больных 1-й группы (на 15,5 %, р < 0,01), экспериментом 2 под влиянием инкуба- тельных цитокинов (со свойствами фак-а также возвращение величины исследо- ции клеток с пентоксифиллином уровень торов роста) TNF-a и IL-1p, а также лим-ванного показателя к исходному (в экспе- лимфокина IL-4 также статистически зна- фокина IL-4, что формирует условия для рименте 1) уровню в экспериментальной чимо снижается у больных как 1-й, так и хронизации (прогрессирования) патоло-модели с пентоксифиллином (экспери- 2-й групп (достоверность различия меж- гического процесса как в печени, так и в мент 3). У больных 2-й группы уровень ду величиной показателя в эксперимен- бронхолегочной системе. TNF-a в супернатанте культуры клеток тах 2 и 3 меньше 0,01). 2. Пентоксифиллин обладает способно-
под влиянием uPA и пентоксифиллина су- Указанные факты позволяют предполо- стью усиливать цитокин-модулирующее щественно не меняется. Таким образом, у жить, что in vivo uPA в очаге воспаления влияние uPA за счет возможного IL-4-больных с сочетанной гепатопульмональ- может оказывать антифибротический эф- опосредованного снижения уровня фак-ной патологией выявлена потеря uPA-ин- фект путем ингибиции синтеза монону- торов роста в очаге воспаления. дуцированного синтеза TNF-a монону- клеарами лимфокина IL-4, так как воз-
Литература
1. Воспаление. Руководство для врачей / Под ред. В.В. Серова, В.С. Паукова. - М.: Медицина, 1995. -640 с.
2. Ковальчук Л.В., Ганковская Л.В., Рубакова Э.И. Система цитокинов. - М.: Медицина, 1999. -
343 с.
3. Лурия ЕА. Кроветворная и лимфоидная ткань в культурах. - М.: Медицина, 1972. - 176 с.
4. Лурия ЕА. Органные культуры кроветворной и лимфоидной ткани: Автореф. дис. ...д-ра биол. наук: 03.099 / Академия мед. наук СССР. - М., 1972. -37 с.
5. Маянский Д.Н. Хроническое воспаление.- М.: Медицина, 1991. - 272 с.
6. Чучалин А.Г. Хронические обструктивные болезни легких.- М.: ЗАО "Из-во БИНОМ", СПб.: Невский Диалект, 1998. - 512 с.
7. Albanis E, Friedman S.L. Hepatic fibrosis. Pathogenesis and principles of therapy / / Clin. Liver Dis. - 2001. - N.5. - Р.315 - 334.
8. Barnes P.J., Shapiro S.D., Pauwels RA. Chronic obstructive pulmonary disease: molecular and cellular mechanisms // Eur. Respir. J. - 2003. - Vol. 22. - P. 672-688.
9. Colson A, Willems B., Thissen J.P. Inhibition of TNF-alpha production by pentoxifylline does not prevent endotoxin-induced decrease in serum IGF-I / / J. Endocrinol. - 2003. - Vol 178, №1. - P.101-109.
10. Fausto N., Laird A.D., Weber E.M. Role of growth factors and cytokines in hepatic regeneration / / FASEB J. - 1999. - Vol. 9. - P. 1527-1536.
11. Friedman S.L. Cytokines and fibrogenesis // Semin. Liver Dis. - 1999. - Vol. 19. - P. 129-140.
12. Gonta A., Dan G.-A., Codita I. Effects of pentoxifylline on TNF-alpha and endothelial dysfunction in patients with severe heart failure / / Eur. J. Heart Failure. - 2000. - Vol. 2, Suppl.1. - P. 9-19.
13. Interleukin-4 induces tissue fibrosis by selectively stimulating and activating transforming growth factor ?1 / C.G.Lee, RHomer, ZTZhu et al. // J. Exp. Med. -2001. - Vol. 194. - P. 809-821.
14. Ishii M., Teramoto S. Respiratory infection in the pathogenesis of COPD // Nipp. Rinsho. - 2007. - Vol. 65, № 4. - P. 617-622.
15. Jutel M. Adhesion molecules in allergic inflammation / Allergology & Clinical Immunology International. - 1999. - Vol. 5, № 3. - P. 153-158.
16. Kisseleva T., Brenner D.A. Mechanisms of fibrogenesis // Exper. Biol. Med. - 2008. - Vol.233, N.2. - P. 109 - 122.
17. Mechanisms of pulmonary fibrosis / V.J.Thannickal, G.B.Toews, E.S.White et al. // Annu. Rev. Med. - 2004. - Vol. 55. - P. 395-417.
18. O'Donnell R., Breen D., Wilson S., Djukanovic R. Inflammatory cells in the airways in COPD / / Thorax. - 2006. - Vol. 61. - P. 448-454.
19. Pentoxifylline protects L929fibroblasts from TNF-a toxicity via the induction of heme oxygenase-1 / G.-S.Oh, H.-O.Pae, M.-KMoon et al. // Biochem. Biophys.
Resear. Communic. - 2003. - Vol.302, №1. - P. 109113.
20. Plasminogen activation induced pericellular fibronectin proteolysis promotes fibroblast apoptosis [ J.C.Horowitz, D.S.Rogers, RH.Simon et al. [ [ Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. - 2008. - Vol. 38, № 1. - P.
78-87.
21. Plasminogen deficiency results in poor clearance of non-fibrin matrix and persistent activation of hepatic stellate cells after an acute injury [ V.L.Ng, G.E.Sabla, HMelin-Aldana et al. [ [ J. Hepatol. - 2001. - Vol. 35. - P. 881-889.
22. Production of type 2 cytokines by CD8 + lung cells is associated with greater decline in pulmonary function in patients with systemic sclerosis [ S.P.Atamas,
V.V.Yurovsky, R.Wise et al. [ [ Arthritis Rheum. -1999. - Vol.42. - P.1168-1179.
23. Pulmonary tuberculosis in BALB[ c mice with nonfunctional IL-4 genes: changes in the inflammatory effects of TNF-a and in the regulation of fibrosis [ R.Hern? ndez-Pando, DAguilar, M.L.Hern?ndez et al. [[ Eur. J. Immunol. - 2004. - Vol. 34. - P. 174-183.
24. Safadi R., Friedman S.L. Hepatic fibrosis - role of hepatic stellate cell activation [[ Med. Gen. Med. 2002. - Vol. 15, № 4. - P. 27.
25. Spurzem J.R., Rennard S.I. Pathogenesis of COPD [[ Semin. Respir. Crit. Care. Med. - 2005. -Vol. 26. - P. 142-153.
26. TGF-beta1 gene polymorphism in chronic obstructive pulmonary disease [ J.Liebhart, M.Polak, R.Dobek et al. [[ Pneumonol. Alergol. Pol. - 2005. -Vol. 73, № 3. - P. 216-220.
Динамка функцюнальноТ активност культури кл^ин мононуклеарних лейкоци^в тд впливом активатора плазмшогену сечового типу у хворих iз поеднаною гепатопульмональною патолопею
М. А. Захарова, В. Ф. Кубишкт
У хворих на цироз печшки, що протжае в поеднанш з хрошчним обструктивним захворюванням легешв вивчено вм^т цитоюшв у культуральному середовищi культури мононуклеарних лейкоцилв i виявлено шдвищений иРА-щдукований синтез мононуклеарами фактора росту TGF-p1, прозапальних цитокшш (дз властивостями факторiв росту) Т№-а i 1Ь-1р, а також лiмфокiну 1Ь-4, що формуе умови для прогресування патолопчного процесу як в печшщ, так i в бронхолегеневш системь Шд впливом введення в культуральне середовище пентоксифшшу виявлено посилення цитокш-модулюючого впливу иРА за рахунок можливого 1Ь-4-опосередкованого зниження рiвня факторiв росту.
Ключовi слова: мононуклеарш лейкоцити, цитокши, цироз печiнки, хрошчне обструктивне захворювання легешв.
Dynamic of functional activity mononuclear leucocytes cellular culture under influence of plasmynogen activator of urinal type of patients with combined hepatopulmonary pathology
M. A. Zakharova, V. F. Kubyishkin
The increased uPA-inducted synthesis of mononuclear growth factor TGF-p1, antiinflammation cytokine (with the property of growth factor) TNF-a and IL-1p, and lymphokine IL-4, that formed conditions to progress of pathology process both in hepar and broncho-pulmonory system in patients with liver cirrhosis plus chronic obstructive pulmonary disease (COPD) was revealed in contain of cytokine in the cultural of mononuclear leucocytes. Strengthen of cytokine modulator influence uPA upon the growth factor decrease was revealed under influence of adding in culture penthoxyphyllin. .
Key words: mononuclear monocytes, cytokines, liver cirrhosis, chronic obstructive pulmonary disease.
