CC BY
52
УДК 579.66
Л. Х. Халимова, Р. Р. Ахмалетдинов, Н. И. Петухова, В. В. Зорин
Получение активной биомассы микроорганизмов-деструкторов фенолов и 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты
Уфимский государственный нефтяной технический университет 450062, г. Уфа, ул. Космонавтов, 1; тел.: (3472) 43-19-35, е-maihbio@rusoiLnet
Для получения активной биомассы консорциума микроорганизмов-деструкторов фенолов и 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты подобраны ростовые субстраты, способствующие накоплению высоких концентраций биомассы без потерь каталитической активности деструкции ксенобиотиков.
Установлено, что выращивание биомассы консорциума на жидкой среде, состоящей из смеси фенола и глицерина, позволяет поддерживать 80—95 %-ю стабильность деградируюшей способности и относительно высокий урожай клеток.
Ключевые слова: микроорганизмы-деструкторы, активная биомасса, консорциум, биодеградация, хлорфенолы, 2,4-дихлорфеноксиуксус-ная кислота.
Фенол и его хлорированные производные, используемые в сельском хозяйстве для борьбы с сорной растительностью, обладают высокой токсичностью и устойчивостью к биоразложению. Зачастую эти компоненты плохо усваиваются микробиоценозом активного ила или почв, проникают в очищенную или грунтовую воду, представляя угрозу для экологии почв и водных источников.
Для решения этой проблемы успешно используют специализированные микроорганизмы-деструкторы, которые способны к наиболее полной утилизации подобных токсикантов.
Ранее нами были выделены и исследованы микроорганизмы-деструкторы 2,4-дихлорфе-ноксиуксусной кислоты, 2,4-дихлорфенола (2,4-ДХФ), 4-хлорфенола, 2-хлорфенола в периодических условиях роста и трансформации. На основе трех наиболее активных и устойчивых штаммов (Rhodococcus sp. Ф-93, Bacillus sp. Д-2, Pseudomonas sp. Д-22) был создан эффективный консорциум 1-3.
Известно, что наиболее стабильно деструктивные свойства штаммов-деструкторов поддерживаются на средах, содержащих в качестве источника углерода разрушаемые ксенобиотики. Однако концентрация такой биомассы недостаточна (или достаточно мала)
в связи с невысокими концентрациями ксенобиотиков и низким экономическим коэффициентом токсических субстратов 4.
В настоящей работе произведен подбор субстратов для быстрого восстановления деградирующей активности консорциума микроорганизмов-деструкторов, исследована биодеградация фенола и 2,4-ДХФ консорциумом, выращенным на смеси фенола и глицерина.
Объектом исследования служил консорциум микроорганизмов-деструкторов, созданный на основе штаммов Pseudomonas sp. Ф93, Rhodococcus sp. Д22 и Bacillus sp Д2.
Динамика роста консорциума микроорганизмов на различных субстратах (глицерине, глюкозе, ацетате, этаноле и феноле) показала, что наиболее высокий выход биомассы достигается при выращивании микроорганизмов на глицерине и глюкозе, и он в 4—5 раз превышает прирост биомассы при росте консорциума на феноле (рис.1).
100-
75-
50.
25.
11П
И S а и
я
S
ч
Рис. 1. Относительный прирост биомассы исследуемого консорциума на различных субстратах
0
Дата поступления 26.03.07
Исследование динамики трансформации фенола с использованием биомассы консорциума, выращенной на различных субстратах, показало, что наиболее эффективно деструктивные свойства сохраняются на минеральной среде с фенолом (рис. 2). Отметим, что скорость деградации фенола консорциумом, выращенным на глицерине, также была относительно высокой (около 70%).
Однако скорость прироста биомассы и урожайность клеток минимальны при росте консорциума на феноле (рис. 1). В случае непрерывного культивирования (при незапланированном увеличении скорости разбавления) это может привести к вымыванию клеток консорциума из реактора и снизить эффективность деградации ксенобиотиков. Использование же глицерина в качестве источника углерода значительно (почти в 4 раза) повышает урожайность консорциума, хотя и снижает его деструктивные свойства (на 30%).
Вследствие этого выращивание консорциума на минеральной среде с глицерином и добавкой фенола может привести к большему приросту биомассы и сохранению высокой деградирующей активности консорциума.
При исследовании в ростовых условиях кинетики деградации фенола консорциумом, выращенным в смеси глицерина (0.1%) и фенола (0.03%), были получены результаты, аналогичные использованию биомассы, выращенной на феноле —относительная скорость деградации фенола составила 92—95 % (рис. 3).
В случае деградации 2,4-ДХФ скорость его деструкции консорциумом, выращенным на смеси фенола и глицерина, составляет 80% от скорости деградации консорциума, выращенного на феноле. Следует отметить, что при этом концентрация биомассы в 2.5—3 раза превышает аналогичные концентрации биомассы консорциума, выращенного на феноле.
100 V? 80---
к
§ 60---
та
ч
£ 40---
<и
Ч 20---
0
фенол 2,4-ДХФ
□ рост на феноле ■ рост на феноле и глицерине
Рис. 3. Влияние условий выращивания консорциума (в присутствии смеси глицерина и фенола и на феноле) на деградацию фенола и 2,4-ДХФ
Таким образом, для получения активной биомассы консорциума деструкторов фенолов и 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты необходимо поддерживать консорциум микроорганизмов в условиях роста на жидкой минеральной среде с фенолом или смеси фенола и глицерина.
глицерин этанол глюкоза фенол ацетат №
Рис. 2. Влияние природы субстрата выращивания на процесс трансформации фенола исследуемым консорциумом ( концентрация фенола —1000 мг/л; 0.05 М фосфатный буфер рН 6.8)
Экспериментальная часть
Для создания консорциума штаммы Bacillus sp. Д-2, Pseudomonas sp. Д-22 и Rhodococcus sp. Ф-93 выращивали на агари-зованной среде (СР-1) с разбавленным гидро-лизатом кильки (1:3) в течение 3—5 сут при температуре 30 оС. Затем производили смыв микроорганизмов в качалочные колбы емкостью 250 мл с 50 мл питательной минеральной среды и инкубировали еще в течение суток при 30 оС. Для получения консорциума смешивали в равных пропорциях суспензии штаммов Bacillus sp. Д-2, Pseudomonas sp. Д-22 и Rhodococcus sp. Ф-93 с одинаковой величиной оптической плотности.
Для исследования роста микроорганизмов использовали жидкую минеральную среду (СР-2) состава (г/л): KH2PO4 — 0.8; (NH4)2SO4 - 1.0; Na2HPO4 - 1.2; FeSO4 -0.001; MnS04-0.001; MgS04-0.2; (NH4)3MoO4 - 0.002; дрожжевой автолизат — 0.05; рН 6.8-7.0). В качестве исследуемых субстратов использовали глицерин, этанол, глюкозу, ацетат натрия и фенол в концентрации 0.1%; 2,4-ДХФ - 0.03%.
По достижении максимальной концентрации биомассы клетки отцентрифуговывали
при 17000 g, дважды промывали 0.05М фосфатным буфером рН 6.8 и использовали в дальнейших опытах по исследованию деградации 2,4-ДХФ и фенола в модельных растворах.
Исследование деградации фенола (1000 мг/л) в условиях трансформации проводили собранными клетками консорциума в условиях термостатирования при температуре 30 оС и встряхивания (150 об/мин) в 0.05 М фосфатном буфере рН 6.8.
Определение фенола и 2,4-ДХФ проводили спектрофотометрическим методом с использованием 4-аминоантипирина [5].
Литература
1. Халимова. Л. Х., Газизов Д. Р., Петухова Н. И., Зорин В. В. // Баш. хим. ж.- 2004.- Т. 11, № 1.- С. 54.
2. Халимова. Л. Х., Шагивалеева С. Б., Петухова Н. И., Зорин В. В. // Баш. хим. ж.- 2005.Т. 12, № 1.- С. 65.
3. Халимова. Л. Х., Хасанов И. Р., Петухова Н. И., Зорин В. В. // Баш. хим. ж.- 2006.- Т. 13, № 1.- С. 71.
4. Карасевич Ю. Н. Основы селекции микроорганизмов, утилизирующие синтетические органические соединения.- М: Наука, 1982.- 144 с.
5. Коренман И. М. Фотометрический анализ. Методы определения органических соединений.-М: Химия, 1975.- 75 с.
