Agromyces sp. Ibrb-34dcp новый штамм-деструктор фенола и 2,4-дихлорфенола Текст научной статьи по специальности «Экологические биотехнологии»

УДК: 579.841.15:579.222.3

AGROMYCES SP. IBRB-34DCP - НОВЫЙ ШТАММ-ДЕСТРУКТОР ФЕНОЛА И 2,4-ДИХЛОРФЕНОЛА

©2013 В.В. Коробов1, Н.В. Жарикова1, Л.Г. Анисимова4, Т.Р. Ясаков1, И.В. Кусова2, Е.Ю. Журенко1, Е.Г. Галкин3, Т.В. Маркушева1

Институт биологии Уфимского научного центра РАН, г. Уфа 2 Уфимский государственный авиационный технический университет, г. Уфа 3Институт органической химии Уфимского научного центра РАН, г. Уфа 4 ООО «Живое земледелие», г. Краснодар

Поступила 13.06.2013

Из смешанного консорциума почвенных бактерий, подвергавшихся воздействию факторов химического производства Уфимского промышленного узла, выделен штамм Agromyces sp. IBRB-34DCP, способный утилизировать фенол и 2,4-дихлорфенол (2,4-ДХФ). В периодической культуре Agromyces sp. IBRB-34DCP количество фенола в культуральной среде снижалось на 74%, 2,4-ДХФ - на 73%.

Ключевые слова', деструкция, фенол, 2,4-дихпорфенол, Agromyces sp.

Среди многочисленной группы токсичных синтетических соединений, поступающих в окружающую среду со стоками и отходами, существенное место занимает фенол и его галогениды [1,2].

Судьба загрязнителей ароматического ряда в окружающей среде в значительной степени зависит от метаболической активности микроорганизмов [3]. Показано, что почвобитающие микроорганизмы - главные агенты детоксикации и утилизации загрязнителей. Микроорганизмы способны минерализовать от 10 до 70% общего объема поступающих в окружающую среду ксенобиотиков путем включения их в нормальные биосферные метаболические циклы [4-6].

Цель настоящей работы - выявить характеристики нового природного штамма-деструктора фенола и 2,4-дихлорфенола Agromyces ер. ЮКВ-34БСР.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

Объектом исследования являлся штамм Agromy-се.\ ер. 1ВЯВ-340СР. Штамм был выделен из образца смешанных популяций микроорганизмов, подвергавшихся воздействию факторов нефтехимического производства.

Посевной материал бактерий получали выращиванием в разбавленном мясопептонном бульоне (1МПБ:7Н20) при температуре +30°С. Далее культуру засевали в количестве 0,01% от объема в жидкую минеральную среду следующего состава в г/л:

]ЧН4а - 1; К2НР04- 5; Мё804 -7Н2 О - 0,05; Ре804-7Н20 - 0,005; Си804-5Н20 - 0,001; 2п804 -0,008; рН - 6,8-7,0. В данную минеральную среду

Коробов Владислав Викторович, к.б.н., старший научный сотрудник; Жарикова Натапья Владимировна, к.б.н., старший научный сотрудник; Анисимова Линия Георгиевна, микробиолог; Ясаков Тимур Рамилевич, к.б.н., научный сотрудник; Кусова Ирина Ваперъевна, к.т.н., доцент; Журенко Евгения Юрьевна, к.б.н., старший научный сотрудник; Галкин Евгений Григорьевич, к.х.н., старший научный сотрудник; Маркушева Татьяна Вячеславовна, дб.н., руководитель группы, e-mail: tvmark(a!anrb.ru

объемом 100 мл в качестве единственного источника углерода и энергии вносили фенол и 2,4-ДХФ в концентрации 100 мг/л. Суспензии инкубировали в термостатированных орбитальных встряхивате-лях УВМТ-12-250 при 115-120 об/мин. Рост культур контролировали по значению оптической плотности клеточной массы при длине волны 590 нм на фотоколориметре КФК-2.

Определение количества фенолов в культуральной жидкости проводили согласно стандартного фотометрического метода [7]. Для анализов отбирали 5 мл культуральной жидкости, которую освобождали от клеток бактерий центрифугированием при 5 тыс. об. / мин в течение 30 мин. Далее к пробе последовательно добавляли 30 мкл 2% раствора 4-аминоантипирина, 100 мкл 2 н раствора аммиака и 100 мкл 2 % раствора калия железосине-родистого. Смесь перемешивали после добавления каждого компонента реакции и через 10 мин измеряли коэффициент пропускания на фотоколориметре КФК-2 при длине волны 540 нм. Концентрацию фенолов определяли по градуировочному графику, построенному в стандартных условиях.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Среди микроорганизмов, способных к деградации хлорированных производных фенола, особое место принадлежит бактериям, которые часто способны трансформировать несколько органических соединений.

В ходе настоящей работы на селективных средах был выделен штамм Agromyces ер. 1ВЯВ-34ЭСР - деструктор фенола и 2,4-дихлорфенола. Идентифицирование изолята проводили согласно признакам культурально-морфологической и фи-зиолого-биохимической дифференциации [8].

Культура Agromyces ер. 1ВЯВ-340СР при росте на МПА образовывала колонии лимонно - желтого цвета пастообразной консистенции. После снятия колоний петлей в агаре оставался четкий след в виде пятна. Клетки, составлявшие колонии, имели форму палочек и положительную окраску по Гра-

Экология

му. Для штамма был характерен аэробный рост в диапазоне температур от +22°С до +41°С, с оптимумом рН среды - 6,8, использование в качестве источника углерода глюкозы, галактозы, рамнозы, маннозы и ксилозы и отсутствие каталазной и ок-сидазоной активности.

Штамм способен использовать в качестве источника углерода и энергии фенол и дихлорфенол. Динамика роста и минерализации фенола и его хлорированных производных культуры Agromyces ер. 1ВЯВ-34ЭСР в модельных условиях приведены на рис. (А, В). Из рисунка видно, что Agromyces ер 1ВЯВ-34ЭСР накапливает массу клеток в условиях использования фенола в качестве источника пита-

ния и энергии в периодической культуре в течение шести суток. Значение оптической плотности клеточной суспензии достигало максимума (0,13 ОЕ) и в дальнейшем оно плавно снижалось. Концентрация фенола менялась к 3-м суткам на 44%, к 9-м -на 74% от исходного значения.

На среде с 2,4-ДХФ изменение значений оптической плотности отмечалось с первых суток культивирования Agromyces ер 1ВЯВ-340СР. Максимальное значение составляло на 7-е сут инкубации 0,2 ОЕ, затем после 3-суточной стационарной фазы культура заканчивала свой рост. Количество 2,4-ДХФ уменьшалось к 3-м сут на 45%, к 9-м - на 73% от начального состояния.

Время, сутки

фенол —à—2,4-ДХФ

10080604020-о- À щ

1 Z 7

i 7 1 f_ z 1 £ % 71 f. TL 1— V

0 1 3 б 9

□ фенол 100 80 56 46 26

□ 2,4-ДХФ 100 55 55 47 27

А В

Рис. Зависимость значений оптической плотности клеточной суспензии СЮ 590 (А) и динамика содержания субстратов в среде культивирования (В) от времени инкубации А^отусея ер 1ВШЗ-34ВСР в условиях использования фенола и 2,4-ДХФ в качестве источников углерода и энергии

Полученные данные показывают, что штамм Agromyces sp IBRB-34DCP способен утилизировать фенол и 2,4-ДХФ в водной среде. Из приведенного видно, что уровень ассимиляции фенола и 2,4-ДХФ штамма Agromyces sp IBRB-34DCP в ходе культивирования был примерно одинаков (73-74%).

На аэробных бактериях ранее было показано, что микроорганизмы, способные использовать молекулы фенола и его хлорированных производных в качестве единственного источника углерода и энергии относятся к родам Arthrobacter [9], Bacillus [10], Pseudomonas [11], Rhodococcus [12], Sphingo-monas [13] и, несмотря на то, что бактерии рода Agromyces широко распространены и очень многочисленны в почве, ранее не было упоминаний о том, что представители рода Agromyces способны вовлекать в обмен веществ ксенобиотики ароматического ряда, содержащие хлор.

В результате данного исследования выделена новая культура рода Agromyces. Установлено, что штамм Agromyces sp IBRB-34DCP может утилизировать фенол и 2,4-ДХФ. Приведенные характеристики показали, что применение культуры Agromy-

ces sp IBRB-34DCP может позволить существенно снизить концентрацию фенола и его хлорпроизвод-ных в водной среде.

Работа выполнена при поддержке гранта Программы фундаментальных исследований Президиума РАН «Живая природа: современное состояние и проблемы развития» и государственного контракта № 14.512.11.0077 ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2013 годы».

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Маркупиева Т.В., Журенко Е.Ю., Кусова II.B. Бактерии-деструкторы фенола и его хлорированных производных. Уфа: Гил ем, 2002. 108 с.

2. Жарикова Н.В., Журенко Е.Ю., Коробов В.В., Ясаков Т.Р., Анистюва Л.Г., Маркушева Т.В. Биоразнообразие бактерий-деструкторов хлорированных феноксикислот //Вестник ОГУ. 2009. № 6. С. 121-123.

3. Журенко Е.Ю., Коробов В.В., Жарикова Н.В., Ясаков Т.Р., Анисимова Л.Г., Маркупиева Т.В. Особенности структуры микробиоты техногенной экосистемы Северного промузла РБ: бактерии-деструкторы фенола и 2,4-дихлорфенола//Изв. СамНЦРАН. 2011. Т. 13. № 5(2).

4. Маркушева Т.В., Журенко Е.Ю., Жарикова Н.В., Коробов В.В., Ясаков Т.Р., Анисимова Л.Г. Штаммы-деструкторы хлорфеноксикислот гамма - подкласса протеобактерий // Известия СамНЦ РАН. 2011. Т. 13. № 5(2). С. 194-195.

5. Жарикова Н.В., Журенко Е.Ю., Коробов В.В., Ясаков Т.Р., Анисимова Л.Г., Актуганов Г.Э., Маркушева Т.В. Характеристика консорциума бактерий-деструкторов 2,4,5-трихлорфеноксиуксусной кислоты // Вестник Урал. мед. акад. науки. 2011. №4/1 (38). С. 173-174.

6. Журенко Е.Ю., Жарикова Н.В., Ясаков Т.Р., Коробов В.В., Маркушева Т.В. Особенности антагонистических взаимодействий природных штаммов-деструкторов ароматических галогенидов // Известия УфНЦ РАН. 2012. №3. С. 53-57.

7. Губен-Вейпь П. Методы органической химии. М.: Гос-химиздат, 1963. 1032 с.

8. Определитель бактерий Берджи. М.: Мир, 1997. 799 с.

9. Unell Al. et al. Degradation of mixtures of phenolic compounds by Arthrobacter chlorophenolicus A6 II Biodégradation. 2008. V. 19. N. 4. P. 495-505.

10. Tallur P.N. et al. Biodégradation of p-Cresol by Bacillus sp. Strain PHN 1 // Curr. Microbiology. 2006. V. 53. N 6. P. 529-533.

11. Lin J. et al. Bacterial removal of toxic phenols from an industrial effluent // African J. Biotechnology. 2008. V. 7. N. 13. P. 2232-2238.

12. Ferraroni M. et al. Preliminary crystallographic analysis of 3-chlorocatechol 1,2-dioxygenase of a new modified ortho-pathway from the gram-positive Rhodococcus opacus 1CP grown on 2-chlorophenol // Acta Crystallographica. 2003. V. 59. P. 188-190.

13. Ederer M.M. et al. PCP degradation is mediated by closely related strains of the genus Sphingomonas II Mol. Ecol. 1997. V. 6. P. 39-49.

AGROMYCES SP. IBRB-34DCP - NEW STRAIN-DESTRUCTOR OF PHENOL

AND 2,4-DICHLOROPHENOL

©2013 V.V. Korobov1, N.V. Zharikova1, L.G. Anisimova4, T.R. Yasakov1,1.V. Kusova2, E.Yu. Zhurenko1, E.G. Galkin3, T.V. Markusheva1

institute of Biology, Ufa Sci. Centre of RAS, Ufa 2Ufa State Aviation Technical University, Ufa institute of Organic Cheinistiy, Ufa Sci. Centre of RAS, Ufa 4 LLC «Live agriculture», Krasnodar

The new bacterial strain Agromyces sp. IBRB-34DCP degrades phenol and 2,4-dichlorophenol (2,4-DCP). Phenol and 2,4-DCP was reduced to 74% and 73% respectively under aerobic batch conditions.

Key words: destruction, phenol, 2,4-dichlorphenol, Agromyces sp.

Vladislav Korobov, Candidate of Biology, senior researcher; Na-talya Zharikova, Candidate of Biology, senior researcher; Liliya Anisimova, microbiologist; Timur Yasakov, Candidate of Biology, researcher; Irina Kusova, Candidate of Technics, associate professor; Evgeniya Zhurenko, Candidate of Biology, senior researcher; Evgeniy Galkin, Candidate of Chemistry, senior researcher; Tatyana Markusheva, Doctor of Biology, team leader, e-mail: tvmark(S)anrb.ru