CC BY
138
УДК 579.66
Л.Х. Халимова, И.Р. Хасанов, Н.И. Петухова, В.В. Зорин
Исследование деградации фенола, хлорфенолов и 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты консорциумом микроорганизмов-деструкторов
Уфимский государственный нефтяной технический университет 450062, г. Уфа, ул. Космонавтов, 1; тел.: (3472) 43-19-35, Е-mail:bio@rusoil.net
Исследованы процессы деградации фенола, хлорфенолов и 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты консорциумом микроорганизмов-деструкторов в ростовых условиях. Консорциум, созданный на основе трех наиболее активных штаммов (Д2, Д22 и Ф93), способен осуществлять биодеградацию хлорированных фенолов (2-хлорфенола, 2,4-дихлорфенола, 2,4-дихлор-феноксиуксусной кислоты) при их индивидуальном содержании в модельном водном растворе до 250 мг/л, а также фенола при его содержании до 1000 мг/л. Показано, что соотношение микроорганизмов в составе консорциума практически не изменяется в процессах биодеградации ксенобиотиков. Определена видовая принадлежность микроорганизмов в составе консорциума (Bacillus sp. Д2, Pseudomonas sp. Д22 и Rhodococcus sp. Ф93). Ключевые слова: микроорганизмы-деструкторы, консорциум, биодеградация, 2,4-дихлорфе-ноксиуксусная кислота, хлорфенолы
Хлорорганические соединения и особенно производные фенола широко используются в качестве гербицидов и регуляторов роста растений Благодаря высокой токсичности и устойчивости к биоразложению, такие хлорсо-держащие ароматические соединения, как 2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота (2,4-Д), 2,4-дихлорфенол (2,4-ДХФ), 2-хлорфенол (2-ХФ), фенол, накапливаются в воде и почве и представляют реальную угрозу для окружающей среды .
Ранее нами были исследованы микроорганизмы-деструкторы, обладающие высокой деградирующей активностью по отношению к 2,4-Д, 2,4-ДХФ, 4-ХФ, 2-ХФ в условиях трансформации 3' 4
В связи с этим, в работе было проведено исследование биодеградации фенола, 2-хлор-фенола, 2,4-дихлорфенола и 2,4-Д с помощью консорциума микроорганизмов-деструкторов, созданного на основе трех наиболее активных штаммов Д2, Д22 и Ф93, в ростовых условиях на жидкой минеральной среде.
Для оценки стабильности исследуемого консорциума микроорганизмов-деструкторов определяли соотношение микроорганизмов в
Дата поступления 20.02.06
составе консорциума в процессах биодеградации ксенобиотиков. Также определена видовая принадлежность микроорганизмов в составе консорциума (Bacillus sp^2, Pseudomonas sp. Д22 и Rhodococcus sp. Ф93).
В результате исследования обнаружено, что процесс биодеградации фенола (концентрация 1000 мг/л) в ростовых условиях осуществляется более эффективно микроорганизмами консорциума по сравнению с его составляющими индивидуальными штаммами (Bacillus Д2, Pseudomonas Д22 и Rhodococcus Ф93) (рис. 1а).
Исследование кинетики деградации 2-ХФ, 2,4- ДХФ, 2,4-Д в условиях роста исследуемых микроорганизмов и их консорциума на жидкой минеральной среде с начальной концентрацией соединений 250 мг/л показало, что наибольшая скорость деструкции всех ксенобиотиков наблюдалась у сообщества из трех исследуемых штаммов (рис. 1б-г). Так, например, при биодеградации 2,4-Д микроорганизмами консорциума установлено, что на 5 сутки уровень деградации субстрата составлял более 80%, в то время как для наиболее активных штаммов Pseudomonas Д-22 и Rhodococcus Ф-93 степень деградации этого ксенобиотика составляла 60—80 % (рис. 1г).
Биодеградация исследуемых ксенобиотиков: фенола (1000 мг/л), 2-ХФ, 2,4-ДХФ, 2,4-Д (концентрация 250 мг/л) сопровождается большим приростом биомассы консорциума по сравнению с индивидуальными штаммами, что, вероятно, объясняется коменсальным эффектом, возникающем в консорциуме между микроорганизмами. (рис. 2).
Результаты исследования численности микроорганизмов в составе консорциума в условиях биодеструкции ксенобиотиков, представленные на рис. 3, показывают, что состав консорциума обнаруживает небольшие колебания в численности всех микроорганизмов (10—15 %) без явного преобладания или подавления роста отдельных культур, что свидетельствуют об устойчивом характере взаимосвязей микроорганизмов в процессе биодеструкции ксенобиотиков.
А
Б
000
800 -
600 -
400 -
200 -
0 3 6 9 12 15 Сутки
В
250
200
150
100
50
3 5 8 10 15 Время, сут
250
200
А-А — А ш — — д___
е
* 150
2
«
и я л
И
<Ц Я
я о
50
250
R 200 «
Ч. 150 2
^ 100 «
<Ц
я я о
« 50
Время, сут Г
10 15
3 5 8 10 15 Время, сут
0
0
0
0
0
-◊- Pseudomonas sp. Д22 к0нс0рциум
-А- Rhodococcus sp. Ф93
-□- Bacillus sp. Д2 5 контроль
Рис. 1. Деградация фенола (А), 2-хлорфенола (Б), 2,4-дихлорфенола (В),2,4-Д (Г) микроорганизмами (начальные концентрации: фенол-1000 мг/л; 2,4-ДХФ; 2-ХФ и 2,4-Д по 250 мг/л; минеральная среда СР-1; температура 30 0С; 150 об/мин)
s ч «
80
60 -
g § ES Ю
40 -
20 -
фенол
2-хФ
2,4-дхФ
2,4-Д
□ Pseudomonas sp. Д22
□ Rhodococcus sp. Ф93
□ Bacillus spfl2
□ консорциум
Рис. 2. Относительное увеличение биомассы микроорганизмов в ростовых условиях деградации ксенобиотиков (начальные концентрации: фенол — 1000 мг/л; 2,4-ДХФ; 2-ХФ и 2,4-Д по 250 мг/л; минеральная среда СР-1; 150 об/мин; температура 30 оС; 15 сут.)
2,4-дхф 2,4-дхф 2-хф фенол
I
'-<-t-,-,-г
0 20 40 60 80 100 состав консорциума, %
■ Pseudomonas sp. Д22 □ Bacillus sp. Д2 □ Rhodococcus sp. Ф93 Рис. 3. Соотношение микроорганизмов в составе консорциума при росте на ксенобиотиках (концентрации фенола - 1000 мг/л; 2,4-ДХФ; 2-ХФ и 2,4-Д по 250 мг/л; минеральная среда СР-1; 150 об/мин; температура 30 оС; 10 сут)
Таким образом, исследование деструкции 2,4-Д, фенола и 2-ХФ, 2,4-ДХФ в условиях роста показало, что созданный консорциум на основе штаммов Bacillus Д-2, Pseudomonas Д-22 и Rhodococcus Ф-93 устойчив и эффективно использует токсические субстраты в качестве источника углерода и энергии. При этом численности различных микроорганизмов в составе консорциума приблизительно равны и практически не изменяются в процессе биодеградации.
Материалы и методы
Для создания консорциума штаммы Bacillus Д-2, Pseudomonas Д-22 и Rhodococcus Ф-93 выращивали на агаризованной среде (СР-1) с разбавленным гидролизатом кильки (1:3) и фенолом в концентрации 200 мг/л в качестве индуктора в течение 3-5 сут. при температуре 30 оС. Затем производили смыв микроорганизмов в качалочные колбы на 250 мл с 50 мл пита-
тельной минеральной среды и инкубировали еще в течение суток при температуре 30 оС. Для получения консорциума смешивали суспензии штаммов Bacillus Д-2, Pseudomonas Д-22 и Rhodococcus Ф-93 с одинаковой величиной оптической плотности в равных пропорциях.
Для исследования роста микроорганизмов в процессе деградации ксенобиотиков использовали жидкую минеральную среду (СР-2) состава (г/л): KH2PO4 - 0,8 г; (NH4) 2SO4 -1,0 г; Na2HPO4 - 1,2 г; FeSO4 - 1 мг; MnSO4 - 1 мг; MgSO4 - 0,2 г; (NH4)3MoO4 - 2 мг; дрожжевой автолизат - 50 мг; рН 6,8 - 7,0).
Определение фенола и 2-ХФ, 2,4-ДХФ, 2,4-Д проводили спектрофотометрическим методом с использованием 4-аминоантипирина 4.
Для определения состава консорциума в исследованиях по биодеградации ксенобиотиков были произведены высевы 10 суточных суспензий на среду СР-1 и определена численность клеток отдельных штаммов методом предельных разбавлений, которую выражали в процентах от общего числа клеток 5.
Изучение биодеградации фенола и хлорфе-нолов, 2,4-Д осуществляли на среде СР-2 на термостатированной качалке (150 об/мин) при температуре 30 оС в течение 15 сут. Концентрация исследуемых субстратов составляла: фенола -1000 мг/л; 2,4-Д; 2,4-дХФ; о-ХФ - по 250 мг/л.
Определена видовая принадлежность микроорганизмов в составе консорциума известными методами идентификации 6-9.
Литература
1. Список пестицидов и агрохимикатов, разрешенных к применению в РФ // Защита и карантин растений.- 1998.- №5.- С. 119.
2. Вредные вещества в промышленности. Органические вещества.- Ленинград: Химия, 1976.-Т.1.- 234 с.
3. Халимова. Л.Х., Газизов Д.Р., Петухова Н.И., Зорин В.В. // Баш. хим. ж.- 2004.- Т. 11, №1.- С. 54.
4. Халимова. Л.Х., Шагивалеева С.Б., Петухова Н.И., Зорин В.В. // Баш. хим. ж.- 2005.Т. 12, № 1.- С. 65.
5. Практикум по микробиологии / Под ред. Егорова Н.С.- М.: Изд-во МГУ, 1974.- 48 с.
6. Коренман И.М. Фотометрический анализ. Методы определения органических соединений.-М: Химия,1975.- 75 с.
7. Методы общей бактериологии./ Под ред. Ф. Герхардта.- М.: Мир, 1984.- Т. 3.- С. 263.
8. Определение бактерий Берджи / Под ред. Дж. Хоулта, Н. Крига, П. Снита, Дж. Стейли, С. Уилльямса.- М.: Мир, 1997.- Т. 1.- 430 с.
9. Определение бактерий Берджи / Под ред. Дж. Хоулта, Н. Крига, П. Снита, Дж. Стейли, С. Уилльямса.- М.: Мир, 1997.- Т. 2.- 800 с.
0
