CC BY
27БИОЛОГИЯ, БИОХИМИЯ И ГЕНЕТИКА
УДК 579.841.15:579.222.3
BACILLUS SUBTILIS В-1742Д - ДЕСТРУКТОР ФЕНОЛА И 2,4-ДИХЛОРФЕНОЛА
© В.В. Коробов, Н.В. Жарикова, Л.Г. Анисимова, Т.Р. Ясаков,
Е.Ю. Журенко, И.В. Кусова, Т.В. Маркушева
Выделен новый штамм Bacillus subtilis В-1742Д, способный утилизировать фенол и 2,4-дихлорфенол (2,4-ДХФ). В периодической культуре количество фенола в культуральной среде снижалось на 33%, а 2,4-ДХФ - на 70%. На примере ОАО «Уфахимпром» показано, что культура Bacillus subtilis В-1742Д способна утилизировать фенолы в реальных сточных водах нефтехимического производства.
Ключевые слова: деструкция, фенол, 2,4-дихлорфенол, Bacillus subtilis
Фенол и его производные широко используются практически во всех областях промышленности: в производстве лаков и красок, синтетических смол, пластификаторов, поверхностно-активных и дубильных веществ, ядохимикатов, стабилизаторов, антисептиков [1-2]. Вследствие интенсивного использования фенолов фенольные соединения постоянно присутствуют в сточных водах многих предприятий химического профиля, а также коксо- и нефтехимии, целлюлозной и деревообрабатывающей промышленности. Наличие заместителей в составе молекулы фенола приводит к усложнению процесса минерализации ароматического кольца, следовательно, и к ухудшению очистки стоков. Из-за высокой устойчивости к разложению синтетические ароматические соединения могут накапливаться в окружающей среде, а аккумуляция в организме животных и человека может привести к развитию ряда заболеваний, в т.ч. и онкологических.
Одним из наиболее безопасных и перспективных подходов к решению проблемы улучшения качества очистки сточных вод от фенола и его хлорированных производных являются технологии с применением микроорганизмов. Способность к акцептированию
и расщеплению ксенобиотиков позволяет осуществить переработку значительных объемов загрязнений без образования продуктов вторичного поражения среды. Поэтому современный этап исследований микробиологической конверсии ксенобиотиков характеризуется выраженным практическим интересом к поиску новых штаммов для использования в технологиях ремедиации среды [3].
Цель настоящей работы - выявить возможность применения нового штамма-деструктора Bacillus subtilis В-1742Д для улучшения процесса очистки промышленных сточных вод от фенола и 2,4-дихлорфенола.
Условия эксперимента. Объектом исследования являлся штамм Bacillus subtilis В-1742Д, который был выделен из образца природного сообщества микроорганизмов, подвергавшегося воздействию факторов нефтехимического производства на территории Уфимского промузла, который объединяет предприятия, использующие в своих производственных циклах фенол и его хлорированные производные. Штамм был идентифицирован, согласно признакам культуральноморфологической, физиолого-биохимической
КОРОБОВ Владислав Викторович - к.б.н., Институт биологии УНЦ РАН, е-шай: vacikk@mail.ru ЖАРИКОВА Наталья Владимировна - к.б.н., Институт биологии УНЦ РАН, е-шаП: puzzle111@yandex.ru АНИСИМОВА Лилия Георгиевна, Институт биологии УНЦ РАН, е-шаП: anisimovavalilya@gmail.com ЯСАКОВ Тимур Рамилевич - к.б.н., Институт биологии УНЦ РАН, е-mail: yasakovt@gmail.com ЖУРЕНКО Евгения Юрьевна - к.б.н., Институт биологии УНЦ РАН, е-mail: zhurenkoe@gmail.com КУ СОВА Ирина Валерьевна - к.т.н., У фимский государственный авиационный технический университет, е-mail: ib@anrb.ru
МАРКУШЕВА Татьяна Вячеславовна - к.б.н., Институт биологии УНЦ РАН, е-mail: tvmark@anrb.ru
дифференциации и типирования по последовательности гена 16S рРНК, как Bacillus subtilis [4]. Для культуры характерен аэробный рост, при этом оптимальные условия наблюдались в диапазоне температур от +30°С до +40°С и значениях pH, близких к нейтральным: 6,8-7,2. Клетки по Граму положительные, имели форму коротких палочек. Штамм использовал в качестве источника углерода мальтозу, сахарозу, арабинозу, сорбит, маннозу, цитрат и малонат натрия, обладал каталазной и нитратредуктаз-ной активностью, осуществлял гидролиз желатины, крахмала и казеина. Изолят не использовал в качестве источников питания рамнозу, галактозу и лактозу и не проявлял леци-тиназную активность. Депонирование штамма B. subtilis В-1742Д произведено во Всероссийской коллекции микроорганизмов Государственного научно-исследовательского института (ВКПМ ГосНИИ) генетики и селекции промышленных микроорганизмов.
Посевной материал бактерий получали выращиванием в разбавленном мясопептон-ном бульоне (1МПБ:7Н2О) при температуре +30оС. Далее культуру засевали в количестве 0,01% объема в жидкую минеральную среду следующего состава в г/л: NH4Cl - 1; K2HPO4 -5; MgSO47H2O - 0,05; FeSO47H2O - 0,005; CuSO45H2O - 0,001; ZnSO4 - 0,008; pH - 6,87,0. В данную минеральную среду объемом 100 мл вносили фенол или 2,4-ДХФ в концентрации 100 мг/л. Колбы инкубировали в термостатированных орбитальных встряхивате-лях УВМТ-12-250 при 115-120 об/мин. Рост контролировали по значению оптической плотности клеточной суспензии при длине волны 590 нм на фотоколориметре КФК-2.
Определение количества фенолов в культуральной жидкости проводили согласно стандартного фотометрического метода [5]. Для анализов отбирали 5 мл культуральной жидкости, которую освобождали от клеток бактерий центрифугированием при 5 тыс. об. / мин в течение 30 мин. Далее к пробе последовательно добавляли 30 мкл 2%-го раствора 4-аминоантипирина, 100 мкл 2 н раствора аммиака и 100 мкл 2%-го раствора калия железосинеродистого. Смесь перемешивали после добавления каждого компонента реакции и через 10 мин измеряли коэффициент пропускания на фотоколориметре КФК-2 при длине
волны 540 нм. Концентрацию фенолов определяли по градуировочному графику, построенному в стандартных условиях определения.
Количество фенолов в реальных сточных водах определяли согласно методическому руководству по анализу сточных вод нефтеперерабатывающих и нефтехимических заводов [6]. Отобранные пробы сточных вод консервировали для предотвращения окисления фенолов 50%-м едким натром из расчета 5 мл NaOH на 1л пробы. Затем помещали пробу в перегонную колбу, добавляли 10%-й раствор CuS04 (1 мл на 100 мл) и подкисляли разбавленной серной кислотой. После этого из проб отгоняли фенолы. Ход определения фенолов меняли в зависимости от их концентрации в полученном отгоне. При концентрации фенолов больше 0,4 мг/л определение проводили так же, как в культуральной жидкости. При содержании фенолов меньше 0,4 мг/л соединения извлекали экстрагирующей смесью хло-роформ-изоамиловый спирт и водные растворы экстрактов фотоколориметрировали после реакции с 4-аминоантипирином в присутствии калия железосинеродистого. Содержание фенола в анализируемой пробе находили по калибровочной кривой, которую строили по значениям стандартных образцов.
Результаты и обсуждение. Бациллы обладают удивительной жизнеспособностью, они не только часто доминируют в природных экосистемах, но и способны выживать в постоянно меняющихся условиях трансформированных экосистем, включая загрязненные промышленные экотопы. Известна способность бактерии рода Bacillus деградировать самые разнообразные ксенобиотики: осуществлять минерализацию фенантренов [7], разнообразных бифенилов [8], нафталина [9], фталатов [10].
В настоящем исследовании изучена способность штамма B. subtilis В-1742Д минерализовать молекулы фенола и 2,4-дихлорфено-ла. Динамика роста культуры B. subtilis В-1742Д в модельных условиях использования фенола и 2,4-ДХФ в качестве единственного источника углерода и энергии приведена на рис. 1.
Существенное накопление массы клеток штамма B. subtilis В-1742Д при использовании фенола в периодической культуре происходило в течение суток. Значение оптической
А
Время,сутки —■— фенол —А— 2,4-ДХФ
В
Рис. 1. Зависимость значений оптической плотности клеточной суспензии ОБ590 от времени инкубации B. subtilis В-1742Д в условиях использования фенола и 2,4-ДХФ в качестве источников углерода и энергии (А). Динамика содержания фенола и 2,4-ДХФ в среде культивирования (В)
плотности клеточной суспензии достигало за это время максимального значения (0,56 ОЕ), затем клетки штамма заканчивали свой рост. Уровень ассимиляция фенола достигал к первым суткам 33% контроля (см. рис. 1).
В среде с 2,4-ДХФ значение оптической плотности клеточной суспензии В. subtilis В-1742Д достигало 0,15 ОЕ, а концентрация 2,4-ДХФ снижалась за первые сутки на 36%, и далее к третьим суткам на 70 % начального уровня (см. рис. 1). Измерение оптической плотности клеточной суспензии штамма В. subtilis В-1742Д в условиях роста на 2,4-ДХФ было затруднено и показатель ОД оставался на низком уровне в связи с образованием видимых скоплений клеток и клеточных пленок.
Из приведенного видно, что уровень ассимиляции фенола и 2,4-ДХФ штамма В. subtilis В-1742Д на первые сутки культивирования был примерно одинаков. Далее, к третьим суткам культура на феноле заканчивала свой рост, при этом количество субстрата в среде не изменялось, а культура на 2,4-ДХФ к третьим суткам утилизировала галогензаме-щенный аналог фенола на 70%. Полученные данные показывают, что штамм В. subtilis В-1742Д способен утилизировать фенол и 2,4-ДХФ в водной среде.
С учетом того, что штамм В. subtilis В-1742Д обладает метаболической активностью в отношении фенолов, была исследована возможность практического применения культу-
ры B. subtilis В-1742Д для улучшения качества очистки сточных вод от фенола и его хлорированных производных. С этой целью были проведены испытания штамма на сточных водах ОАО «Уфахимпром».
Согласно характеристике стоков данного предприятия, усредненное содержание фенолов в пробе сточных вод составляло 30,4 мг/л. Применение культуры B. subtilis В-1742Д позволило увеличить степень доочистки вод от фенолов в течение двух суток на 66,4%. Далее к 5-м сут инкубации суммарное содержание фенолов падало до 0,03% (0,01мг/л).
Испытания штамма B. subtilis В-1742Д на ОАО «Уфахимпром» (рис. 2) показали, что культура активна в реальных условиях сточных вод. Приведенные характеристики по доочистке стоков показали, что применение культуры B. subtilis В-1742Д позволяет существенно снизить концентрацию фенолов в стоке химического предприятия.
Сравнительный анализ полученных результатов с данными ранее проведенных исследований на аэробных бактериях показал, что микроорганизмы, способные использовать молекулы фенола и 2,4-ДХФ в качестве единственного источника углерода и энергии, в большинстве относены к родам Arthrobacter, Pseudomonas, Rhodococcus. Вместе с тем выделено несколько штаммов рода Bacillus, способных осуществлять конверсию фенола и 2,4-ДХФ.
Рис. 2. Содержание фенолов в пробе сточных вод ОАО «Уфахимпром» до и после процесса доочистки с использованием штамма В. зиЫШз В-1742Д
Из вод, загрязненных фенольными соединениями, были выделены бактериальные штаммы, принадлежащие роду Bacillus, способные расти на феноле и алкилфенолах применяемых в качестве источника углерода и энергии. Авторами был определен наиболее активный в утилизации ксенобиотиков изо-лят - Bacilluspumilis [11].
Из активного ила стальной фабрики был выделен штамм Bacillus cereus Jp-A. В лабораторных условиях фенол при начальной концентрации 0,47, 0,94 и 1,41 г/л был полностью деградирован в пределах 16, 24 и 32 ч соответственно, но рост штамма ингибировался когда концентрация фенола была 2,82 г/л [12].
Таллуром с соавторами была выделена из почвы культура Bacillus sp. PHN 1, способная утилизировать фенол, р-крезол, о-крезол, м-крезол, 4-гидроксибензойную и гентизиновую кислоты в качестве единственного источника углерода и энергии [13].
Была выделена чистая культура Bacillus cereus GN1, деградирующая 2,4-ДХФ. Деградация 2,4-ДХФ была исследована в жидкой среде в аэробных условиях при начальной концентрации 1,9 52,6 мг/л 2,4-ДХФ. Уровень деградации 2,4-ДХФ мог быть вплоть до концентрации 37,6 мг/л, а более высокие концен-
трации 2,4-ДХФ (52,6 мг/л) оказывались ингибирующими для клеточного роста [14].
Из загрязненной почвы выделен бактериальный консорциум состоящий из четырех видов Bacillus, осуществляющих эффективную биодеградацию 2-хлорфенола, 3-хлорфенола, 2,4-дихлорфенола. Количества 2,4-ДХФ, ме-таболизированные за 21-й день, достигали пиковых значений 197-235 мг/л [15].
В результате данного исследования выделена новая культура рода Bacillus вида subtilis. Установлено, что штамм может утилизировать фенол и 2,4-ДХФ. Культура B. subtilis В-1742Д сохраняет свои свойства в условиях промышленного стока.
Работа выполнена в рамках гранта Президиума РАН «Биоразнообразие и динамика генофондов».
ЛИТЕРАТУРА
1. Грушко Я.М. Вредные органические соединения в промышленных сточных водах. Л.: Химия, 1982. 216 с.
2. Харлампович Г. Д., Чуркин Ю.В. Фенолы. М.: Химия, 1974. 376 с.
3. Methodologies for the characterization of microbes in industrial environments: a review / J. Mauko-
nen [et al.] // J. Industrial Microbiology and Biotechnology. 2003. V. 52, №. 6. P. 327-356.
4. Определитель бактерий Берджи / под ред. Дж. Хоулта [и др]. 9-е изд. М.: Мир, 1997. 799 с.
5. Губен-Вейль И. Методы органической химии. М.: Госхимиздат, 1963. 1032 с.
6. Методическое руководство по анализу сточных вод нефтеперерабатывающих и нефтехимических заводов. М., 1977. C. 367-387.
7. Angus B. Carmichael, Luet-Lok Wong. Protein engineering of Bacillus megaterium CYP102. The oxidation of polycyclic aromatic hydrocarbons // Eur. J. Biochem. 2001. V. 268. P. 3117-3125.
8. Hanumanthanaik P. Doddamani, Harichandra Z. Ninnekar. Biodegradation of Phenanthrene by a Bacillus Species // Current Microbiology. 2000. V! 41, №. 1. P. 11-14.
9. Budambula N.L.M., Mwachiro E.C. Isolation and characterization of naphthalene utilising bacteria from Nairobi River // Asian Journal of Microbiology, Biotechnology and Environmental Sciences. 2006. V! 8. P. 1-8.
10. Enhanced and potential degradation of o-phthalate by Bacillus sp. immobilized cells in alginate
and polyurethane / K.P Neelakanteshwar [et al.] // International Biodeterioration & Biodegradation. 2006. V. 57. P. 82-87.
11. Gunther K., Schlosser D., Fritsche W. Phenol and cresol metabolism in Bacillus pumilis isolated from contaminated groundwater // J. Basic. Microbiol. 1995. V. 35, № 2. P. 83-92.
12. Isolation and identification of Bacillus cereus strain Jp-A and its capability in phenol degradation / S Li [et al.] // Chinese Journal of Applied Ecology. 2006. V. 17, №. 5. P. 920-924.
13. Biodegradation of p-Cresol by Bacillus sp. Strain PHN 1 / P.N.Tallur [et al.] // Current Microbiology. 2006. V. 53, № 6. P. 529-533.
14. Degradation of 2,4-dichlorophenol by Bacillus sp. isolated from an aeration pond in the Baikalsk pulp and paper mill (Russia) / G. Matafonova [et al.] // International Biodeterioration & Biodegradation. 2006. V. 58, № 3-4. P. 209-212.
15. Biodegradation of 2,4-dichlorophenol by a Bacillus consortium / Y. Herrera [et al.] // World J Microbiol Biotechnol. 2008. V. 24. P. 55-60.
BACILLUS SUBTILIS B-1742D - PHENOL AND 2,4-DICHLOROPHENOL DESTRUCTOR
© V.V. Korobov, N.V. Zharikova, L.G. Anisimova, T.R. Yasakov,
E.Yu. Zhurenko, I.V. Kusova, T.V. Markusheva
A new bacterial strain Bacillus subtilis B-1742D degrades phenol and 2,4-dichlorophenol (2,4-DCP). Phenol and 2,4-DCP was reduced to 33% and 70% respectively under aerobic batch conditions. On the exampled «Ufahimprom» it is shown that culture Bacillus subtilis B-1742D capable to utilize phenols in real sewages of petrochemical production.
Key words: destruction, phenol, 2,4-dichlorophenol, Bacillus subtilis
