Научная статья на тему 'Взаимные мультифрактальные спектры I. точные спектры'

Взаимные мультифрактальные спектры I. точные спектры Текст научной статьи по специальности «Экологические биотехнологии»

CC BY
124
27
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.
Журнал
Проблемы анализа
WOS
Scopus
ВАК
MathSciNet

Аннотация научной статьи по экологическим биотехнологиям, автор научной работы — Светова Н. Ю.

В работе рассмотрены точные взаимные мультифрактальные спектры, определенные для вероятностных борелевских мер, получены оценки для введенных спектров. Настоящая статья является продолжением статьи [1].I

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Похожие темы научных работ по экологическим биотехнологиям , автор научной работы — Светова Н. Ю.

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

t has introduced the fine mutual multifractal spectra for Borel probability measures and received the estimations for these spectra.

Текст научной работы на тему «Взаимные мультифрактальные спектры I. точные спектры»

БИОЛОГИЯ, БИОХИМИЯ И ГЕНЕТИКА

УДК 579.841.15:579.222.3

BACILLUS SUBTILIS В-1742Д - ДЕСТРУКТОР ФЕНОЛА И 2,4-ДИХЛОРФЕНОЛА

© В.В. Коробов, Н.В. Жарикова, Л.Г. Анисимова, Т.Р. Ясаков,

Е.Ю. Журенко, И.В. Кусова, Т.В. Маркушева

Выделен новый штамм Bacillus subtilis В-1742Д, способный утилизировать фенол и 2,4-дихлорфенол (2,4-ДХФ). В периодической культуре количество фенола в культуральной среде снижалось на 33%, а 2,4-ДХФ - на 70%. На примере ОАО «Уфахимпром» показано, что культура Bacillus subtilis В-1742Д способна утилизировать фенолы в реальных сточных водах нефтехимического производства.

Ключевые слова: деструкция, фенол, 2,4-дихлорфенол, Bacillus subtilis

Фенол и его производные широко используются практически во всех областях промышленности: в производстве лаков и красок, синтетических смол, пластификаторов, поверхностно-активных и дубильных веществ, ядохимикатов, стабилизаторов, антисептиков [1-2]. Вследствие интенсивного использования фенолов фенольные соединения постоянно присутствуют в сточных водах многих предприятий химического профиля, а также коксо- и нефтехимии, целлюлозной и деревообрабатывающей промышленности. Наличие заместителей в составе молекулы фенола приводит к усложнению процесса минерализации ароматического кольца, следовательно, и к ухудшению очистки стоков. Из-за высокой устойчивости к разложению синтетические ароматические соединения могут накапливаться в окружающей среде, а аккумуляция в организме животных и человека может привести к развитию ряда заболеваний, в т.ч. и онкологических.

Одним из наиболее безопасных и перспективных подходов к решению проблемы улучшения качества очистки сточных вод от фенола и его хлорированных производных являются технологии с применением микроорганизмов. Способность к акцептированию

и расщеплению ксенобиотиков позволяет осуществить переработку значительных объемов загрязнений без образования продуктов вторичного поражения среды. Поэтому современный этап исследований микробиологической конверсии ксенобиотиков характеризуется выраженным практическим интересом к поиску новых штаммов для использования в технологиях ремедиации среды [3].

Цель настоящей работы - выявить возможность применения нового штамма-деструктора Bacillus subtilis В-1742Д для улучшения процесса очистки промышленных сточных вод от фенола и 2,4-дихлорфенола.

Условия эксперимента. Объектом исследования являлся штамм Bacillus subtilis В-1742Д, который был выделен из образца природного сообщества микроорганизмов, подвергавшегося воздействию факторов нефтехимического производства на территории Уфимского промузла, который объединяет предприятия, использующие в своих производственных циклах фенол и его хлорированные производные. Штамм был идентифицирован, согласно признакам культуральноморфологической, физиолого-биохимической

КОРОБОВ Владислав Викторович - к.б.н., Институт биологии УНЦ РАН, е-шай: [email protected] ЖАРИКОВА Наталья Владимировна - к.б.н., Институт биологии УНЦ РАН, е-шаП: [email protected] АНИСИМОВА Лилия Георгиевна, Институт биологии УНЦ РАН, е-шаП: [email protected] ЯСАКОВ Тимур Рамилевич - к.б.н., Институт биологии УНЦ РАН, е-mail: [email protected] ЖУРЕНКО Евгения Юрьевна - к.б.н., Институт биологии УНЦ РАН, е-mail: [email protected] КУ СОВА Ирина Валерьевна - к.т.н., У фимский государственный авиационный технический университет, е-mail: [email protected]

МАРКУШЕВА Татьяна Вячеславовна - к.б.н., Институт биологии УНЦ РАН, е-mail: [email protected]

дифференциации и типирования по последовательности гена 16S рРНК, как Bacillus subtilis [4]. Для культуры характерен аэробный рост, при этом оптимальные условия наблюдались в диапазоне температур от +30°С до +40°С и значениях pH, близких к нейтральным: 6,8-7,2. Клетки по Граму положительные, имели форму коротких палочек. Штамм использовал в качестве источника углерода мальтозу, сахарозу, арабинозу, сорбит, маннозу, цитрат и малонат натрия, обладал каталазной и нитратредуктаз-ной активностью, осуществлял гидролиз желатины, крахмала и казеина. Изолят не использовал в качестве источников питания рамнозу, галактозу и лактозу и не проявлял леци-тиназную активность. Депонирование штамма B. subtilis В-1742Д произведено во Всероссийской коллекции микроорганизмов Государственного научно-исследовательского института (ВКПМ ГосНИИ) генетики и селекции промышленных микроорганизмов.

Посевной материал бактерий получали выращиванием в разбавленном мясопептон-ном бульоне (1МПБ:7Н2О) при температуре +30оС. Далее культуру засевали в количестве 0,01% объема в жидкую минеральную среду следующего состава в г/л: NH4Cl - 1; K2HPO4 -5; MgSO47H2O - 0,05; FeSO47H2O - 0,005; CuSO45H2O - 0,001; ZnSO4 - 0,008; pH - 6,87,0. В данную минеральную среду объемом 100 мл вносили фенол или 2,4-ДХФ в концентрации 100 мг/л. Колбы инкубировали в термостатированных орбитальных встряхивате-лях УВМТ-12-250 при 115-120 об/мин. Рост контролировали по значению оптической плотности клеточной суспензии при длине волны 590 нм на фотоколориметре КФК-2.

Определение количества фенолов в культуральной жидкости проводили согласно стандартного фотометрического метода [5]. Для анализов отбирали 5 мл культуральной жидкости, которую освобождали от клеток бактерий центрифугированием при 5 тыс. об. / мин в течение 30 мин. Далее к пробе последовательно добавляли 30 мкл 2%-го раствора 4-аминоантипирина, 100 мкл 2 н раствора аммиака и 100 мкл 2%-го раствора калия железосинеродистого. Смесь перемешивали после добавления каждого компонента реакции и через 10 мин измеряли коэффициент пропускания на фотоколориметре КФК-2 при длине

волны 540 нм. Концентрацию фенолов определяли по градуировочному графику, построенному в стандартных условиях определения.

Количество фенолов в реальных сточных водах определяли согласно методическому руководству по анализу сточных вод нефтеперерабатывающих и нефтехимических заводов [6]. Отобранные пробы сточных вод консервировали для предотвращения окисления фенолов 50%-м едким натром из расчета 5 мл NaOH на 1л пробы. Затем помещали пробу в перегонную колбу, добавляли 10%-й раствор CuS04 (1 мл на 100 мл) и подкисляли разбавленной серной кислотой. После этого из проб отгоняли фенолы. Ход определения фенолов меняли в зависимости от их концентрации в полученном отгоне. При концентрации фенолов больше 0,4 мг/л определение проводили так же, как в культуральной жидкости. При содержании фенолов меньше 0,4 мг/л соединения извлекали экстрагирующей смесью хло-роформ-изоамиловый спирт и водные растворы экстрактов фотоколориметрировали после реакции с 4-аминоантипирином в присутствии калия железосинеродистого. Содержание фенола в анализируемой пробе находили по калибровочной кривой, которую строили по значениям стандартных образцов.

Результаты и обсуждение. Бациллы обладают удивительной жизнеспособностью, они не только часто доминируют в природных экосистемах, но и способны выживать в постоянно меняющихся условиях трансформированных экосистем, включая загрязненные промышленные экотопы. Известна способность бактерии рода Bacillus деградировать самые разнообразные ксенобиотики: осуществлять минерализацию фенантренов [7], разнообразных бифенилов [8], нафталина [9], фталатов [10].

В настоящем исследовании изучена способность штамма B. subtilis В-1742Д минерализовать молекулы фенола и 2,4-дихлорфено-ла. Динамика роста культуры B. subtilis В-1742Д в модельных условиях использования фенола и 2,4-ДХФ в качестве единственного источника углерода и энергии приведена на рис. 1.

Существенное накопление массы клеток штамма B. subtilis В-1742Д при использовании фенола в периодической культуре происходило в течение суток. Значение оптической

А

Время,сутки —■— фенол —А— 2,4-ДХФ

В

Рис. 1. Зависимость значений оптической плотности клеточной суспензии ОБ590 от времени инкубации B. subtilis В-1742Д в условиях использования фенола и 2,4-ДХФ в качестве источников углерода и энергии (А). Динамика содержания фенола и 2,4-ДХФ в среде культивирования (В)

плотности клеточной суспензии достигало за это время максимального значения (0,56 ОЕ), затем клетки штамма заканчивали свой рост. Уровень ассимиляция фенола достигал к первым суткам 33% контроля (см. рис. 1).

В среде с 2,4-ДХФ значение оптической плотности клеточной суспензии В. subtilis В-1742Д достигало 0,15 ОЕ, а концентрация 2,4-ДХФ снижалась за первые сутки на 36%, и далее к третьим суткам на 70 % начального уровня (см. рис. 1). Измерение оптической плотности клеточной суспензии штамма В. subtilis В-1742Д в условиях роста на 2,4-ДХФ было затруднено и показатель ОД оставался на низком уровне в связи с образованием видимых скоплений клеток и клеточных пленок.

Из приведенного видно, что уровень ассимиляции фенола и 2,4-ДХФ штамма В. subtilis В-1742Д на первые сутки культивирования был примерно одинаков. Далее, к третьим суткам культура на феноле заканчивала свой рост, при этом количество субстрата в среде не изменялось, а культура на 2,4-ДХФ к третьим суткам утилизировала галогензаме-щенный аналог фенола на 70%. Полученные данные показывают, что штамм В. subtilis В-1742Д способен утилизировать фенол и 2,4-ДХФ в водной среде.

С учетом того, что штамм В. subtilis В-1742Д обладает метаболической активностью в отношении фенолов, была исследована возможность практического применения культу-

ры B. subtilis В-1742Д для улучшения качества очистки сточных вод от фенола и его хлорированных производных. С этой целью были проведены испытания штамма на сточных водах ОАО «Уфахимпром».

Согласно характеристике стоков данного предприятия, усредненное содержание фенолов в пробе сточных вод составляло 30,4 мг/л. Применение культуры B. subtilis В-1742Д позволило увеличить степень доочистки вод от фенолов в течение двух суток на 66,4%. Далее к 5-м сут инкубации суммарное содержание фенолов падало до 0,03% (0,01мг/л).

Испытания штамма B. subtilis В-1742Д на ОАО «Уфахимпром» (рис. 2) показали, что культура активна в реальных условиях сточных вод. Приведенные характеристики по доочистке стоков показали, что применение культуры B. subtilis В-1742Д позволяет существенно снизить концентрацию фенолов в стоке химического предприятия.

Сравнительный анализ полученных результатов с данными ранее проведенных исследований на аэробных бактериях показал, что микроорганизмы, способные использовать молекулы фенола и 2,4-ДХФ в качестве единственного источника углерода и энергии, в большинстве относены к родам Arthrobacter, Pseudomonas, Rhodococcus. Вместе с тем выделено несколько штаммов рода Bacillus, способных осуществлять конверсию фенола и 2,4-ДХФ.

Рис. 2. Содержание фенолов в пробе сточных вод ОАО «Уфахимпром» до и после процесса доочистки с использованием штамма В. зиЫШз В-1742Д

Из вод, загрязненных фенольными соединениями, были выделены бактериальные штаммы, принадлежащие роду Bacillus, способные расти на феноле и алкилфенолах применяемых в качестве источника углерода и энергии. Авторами был определен наиболее активный в утилизации ксенобиотиков изо-лят - Bacilluspumilis [11].

Из активного ила стальной фабрики был выделен штамм Bacillus cereus Jp-A. В лабораторных условиях фенол при начальной концентрации 0,47, 0,94 и 1,41 г/л был полностью деградирован в пределах 16, 24 и 32 ч соответственно, но рост штамма ингибировался когда концентрация фенола была 2,82 г/л [12].

Таллуром с соавторами была выделена из почвы культура Bacillus sp. PHN 1, способная утилизировать фенол, р-крезол, о-крезол, м-крезол, 4-гидроксибензойную и гентизиновую кислоты в качестве единственного источника углерода и энергии [13].

Была выделена чистая культура Bacillus cereus GN1, деградирующая 2,4-ДХФ. Деградация 2,4-ДХФ была исследована в жидкой среде в аэробных условиях при начальной концентрации 1,9 52,6 мг/л 2,4-ДХФ. Уровень деградации 2,4-ДХФ мог быть вплоть до концентрации 37,6 мг/л, а более высокие концен-

трации 2,4-ДХФ (52,6 мг/л) оказывались ингибирующими для клеточного роста [14].

Из загрязненной почвы выделен бактериальный консорциум состоящий из четырех видов Bacillus, осуществляющих эффективную биодеградацию 2-хлорфенола, 3-хлорфенола, 2,4-дихлорфенола. Количества 2,4-ДХФ, ме-таболизированные за 21-й день, достигали пиковых значений 197-235 мг/л [15].

В результате данного исследования выделена новая культура рода Bacillus вида subtilis. Установлено, что штамм может утилизировать фенол и 2,4-ДХФ. Культура B. subtilis В-1742Д сохраняет свои свойства в условиях промышленного стока.

Работа выполнена в рамках гранта Президиума РАН «Биоразнообразие и динамика генофондов».

ЛИТЕРАТУРА

1. Грушко Я.М. Вредные органические соединения в промышленных сточных водах. Л.: Химия, 1982. 216 с.

2. Харлампович Г. Д., Чуркин Ю.В. Фенолы. М.: Химия, 1974. 376 с.

3. Methodologies for the characterization of microbes in industrial environments: a review / J. Mauko-

nen [et al.] // J. Industrial Microbiology and Biotechnology. 2003. V. 52, №. 6. P. 327-356.

4. Определитель бактерий Берджи / под ред. Дж. Хоулта [и др]. 9-е изд. М.: Мир, 1997. 799 с.

5. Губен-Вейль И. Методы органической химии. М.: Госхимиздат, 1963. 1032 с.

6. Методическое руководство по анализу сточных вод нефтеперерабатывающих и нефтехимических заводов. М., 1977. C. 367-387.

7. Angus B. Carmichael, Luet-Lok Wong. Protein engineering of Bacillus megaterium CYP102. The oxidation of polycyclic aromatic hydrocarbons // Eur. J. Biochem. 2001. V. 268. P. 3117-3125.

8. Hanumanthanaik P. Doddamani, Harichandra Z. Ninnekar. Biodegradation of Phenanthrene by a Bacillus Species // Current Microbiology. 2000. V! 41, №. 1. P. 11-14.

9. Budambula N.L.M., Mwachiro E.C. Isolation and characterization of naphthalene utilising bacteria from Nairobi River // Asian Journal of Microbiology, Biotechnology and Environmental Sciences. 2006. V! 8. P. 1-8.

10. Enhanced and potential degradation of o-phthalate by Bacillus sp. immobilized cells in alginate

and polyurethane / K.P Neelakanteshwar [et al.] // International Biodeterioration & Biodegradation. 2006. V. 57. P. 82-87.

11. Gunther K., Schlosser D., Fritsche W. Phenol and cresol metabolism in Bacillus pumilis isolated from contaminated groundwater // J. Basic. Microbiol. 1995. V. 35, № 2. P. 83-92.

12. Isolation and identification of Bacillus cereus strain Jp-A and its capability in phenol degradation / S Li [et al.] // Chinese Journal of Applied Ecology. 2006. V. 17, №. 5. P. 920-924.

13. Biodegradation of p-Cresol by Bacillus sp. Strain PHN 1 / P.N.Tallur [et al.] // Current Microbiology. 2006. V. 53, № 6. P. 529-533.

14. Degradation of 2,4-dichlorophenol by Bacillus sp. isolated from an aeration pond in the Baikalsk pulp and paper mill (Russia) / G. Matafonova [et al.] // International Biodeterioration & Biodegradation. 2006. V. 58, № 3-4. P. 209-212.

15. Biodegradation of 2,4-dichlorophenol by a Bacillus consortium / Y. Herrera [et al.] // World J Microbiol Biotechnol. 2008. V. 24. P. 55-60.

BACILLUS SUBTILIS B-1742D - PHENOL AND 2,4-DICHLOROPHENOL DESTRUCTOR

© V.V. Korobov, N.V. Zharikova, L.G. Anisimova, T.R. Yasakov,

E.Yu. Zhurenko, I.V. Kusova, T.V. Markusheva

A new bacterial strain Bacillus subtilis B-1742D degrades phenol and 2,4-dichlorophenol (2,4-DCP). Phenol and 2,4-DCP was reduced to 33% and 70% respectively under aerobic batch conditions. On the exampled «Ufahimprom» it is shown that culture Bacillus subtilis B-1742D capable to utilize phenols in real sewages of petrochemical production.

Key words: destruction, phenol, 2,4-dichlorophenol, Bacillus subtilis

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.