CC BY
155
УДК [577.12:547.458.88]:577.15
А.Т. Безусов, М.Г. Л1ганенко
ПЕРЕТВОРЕННЯ ПЕКТИНОВИХ РЕЧОВИН П1Д ВПЛИВОМ ПЕКТИНАЗ
Наведено результати дослгджень щодо виробництва низькомолекулярних олггосахаридгв 1з пектиновм1сно'1 сировини, а саме з яблучних вичавок. Доведено, що отриманг речовини володгють антиадгезивними властивостями та здатш дгяти як пребютик.
Вступ. Природш бiополiмери викликають великий штерес у зв'язку з широким спектром гх бюлопчно! дп та можливютю практичного застосування в рiзних сферах. Серед полiсахаридiв рослинно! сировини одне з провщних мiсць займають пектиновi речовини.
Розпад пектинових речовин в органiзмi людини проходить у нижчому вщдш кишечника пiд дieю ферментiв мжрофлори, ступiнь розщеплення пектину знаходиться у межах вщ 0-100 %. У природних бiоценозах розщеплення пектинiв спричиняють мiкроорганiзми та вищi базiдальнi гриби за участю пектингiдролаз та пектинлiаз. Перетворення пектинових речовин обумовлено дieю рiзноманiтних пектиназ, таких як пол^алактуронази (ПГ), рамногалактуронази (РГ), пектинметилгалактуронази (ПМГ), пектинметилестерази (ПМЕ), пекат- i пектинлiази. Ввдомо, що пектолiтичнi ферменти мiкроорганiзмiв займають важливе мiсце у патогенезi рослин, вони також е перспективними для отримання вуглеводовмiсних з'еднань, що володшть iммуномодулюючою активнiстю, для отримання протопласлв у клiтиннiй iнженерii, у селекцп рослин, а також для освгглення сок1в i вин [1].
Постановка проблеми. Сьогодш процеси бютрансформаци компонентiв рослинног сировини е найбшьш перспективним напрямом прогресу в переробних галузях, заснованому на дii' ферменпв, що дозволяють ефективнiше i економшше використовувати сировину, впроваджувати новi технологи, досягати високоГ екологiчностi технологiй i високоГ якостi продуктiв.
Мета дослщження. Мета дослiджень полягае у встановленш механiзму, умов та параметрiв проходження ферментативного гiдролiзу рослинних полiсахаридiв для отримання низькомолекулярних олiгосахаридiв галактуроново! кислоти з пектину яблучних вичавок.
Результати дослвдження. У хiмiчному вiдношеннi пектиновi речовини, що мiстяться в яблуках, -це кислий полiсахарид. Основою пектинових речовин е молекулярний ланцюг, що складаеться iз залишк1в а-Б-галактуроново! кислоти, з'еднаних м1ж собою О-(1,4)-глшозидними зв'язками, рис. 1. У малих к1лькостях, зазвичай, наявнi фрагменти Ь-арабшози i Б-галактози, рiдше - Ь-рамнози, Б-ксилози, Ь-фукози [2].
Конформац1я пектинових речовин змшюеться у залежностi ввд температури, тривалостi процесу гiдролiзу, рН середовища. Надзвичайно рiзнi по молекулярнш масi пектиновi речовини розрiзняються за будовою ланцюпв i характером надмолекулярних структур. Пектиновi молекули мають переважно волокнисту структуру i ввдносяться до лшшних колоiдiв з довжиною молекули близько 0,00001 см. У водних розчинах пектинова молекула набувае форми сшрал^ Цю конформацш, звичайно, набувають макромолекули, у яких дальнiй конформацшний порядок у виглядi спiралi iммобiлiзований, наприклад,
Галактуронова кислота
Рис. 1. Фрагмент хiмiчноi формули пектину
водневими зв'язками. У водних розчинах пектин являе собою нашвгнучку макромолекулу, що мае конформацш спiралi з постшним поперечним розтином, карбоксильш групи яко! розташованi одна пiд одною.
Ферменти, що дшть на пектиновi речовини, подмють на двi групи: деетерифiкуючi та деполiмеризуючi. Деполiмеризуючi ферменти ввдносять до наступних класiв: гiдролази та транселiменази (лiази). Саме !х використовують для проведения регулючого ферментативного гiдролiзу пектинових речовин рослинних полiсахаридiв.
Активнiсть деполiмеризуючих ферментiв вимiрюють за зниженням в'язкосп, що дозволяе враховувати активнiсть ендоферменпв. Пдролiз ендо-ПГ проходить невпорядкованим шляхом, здеб№шого розщеплюються внутрiшнi зв'язки полiмеру [1]:
Полггалактуронова кислота + Н2О
I
Ол1гогалактуронов1 килоти + моногалактурнова кислота
При гiдролiзi 1-10 % зв'язшв, в'язшсть розчинiв галактуронанiв знижуеться не менше, нiж на 50 %. Основним шнцевим продуктом гiдролiзу пектинiв, в залежностi ввд джерела ферменту, можуть бути моно-, ди-, три- або тетрагалактуронова кислота. Бшьшють ендо-ПГ - ферменти молекулярно! маси 3-80 кДа, оптимум ди при рН ввд 3,5 до 6,5, температура 50 °С. Екзо-ПГ каталiзуе розщеплення к1нцевих a-1,4-глiкозидних зв'язкiв мiж залишками неетерифшовано! галактуроново! кислоти в рiзних пектинових полiсахаридах (полiгалактуронова кислота, пектати, пектини) з утворенням моногалактуроново! кислоти. Гiдролiз супроводжуеться незначним зниженням в'язкосп розчинiв субстратiв. Фермент розщеплюе пектати не повнiстю, приблизно на 50 %. Екзо-ПГ мають оптимум дИ при рН вщ 3,4 до 6,0 i температурi 3050 °С. Частково деградоваш субстрати, як правило, гiдролiзуються екзо-ПГ швидше високополiмерних.
Пектинметилестерази (ПМЕ) каталiзують вiдщеплення метальних груп вiд полiметил-галактуроново! кислоти з утворенням метанолу i частково деметоксильовано! галактуроново! кислоти. ПМЕ деетерифшуе пектин на 60-70 %. По мiрi зниження ступеня етерифшацп субстратiв знижуеться спорiдненiсть ферменту до них, i процес гiдролiзу проходить не до к1нця. ПМЕ в основному дiе на крупш молекули, метоксильованi олiгоуронiди розщеплюються повшьшше. ПМЕ проявляють максимальну активнiсть в iнтервалi рН 4,4-8, оптимальна температура 30-40 °С [1].
При сумюнш дИ ПГ i ПМЕ на високометоксильований пектин, перша стад1я гiдролiзу проходить шд дiею ПМЕ. Шсля часткового деметоксилювання субстрату починаеться гiдролiз полталактуроново! кислоти. Зниження молекулярно! маси пектину призводить до зниження реакци деметоксилювання. Основнi перетворення пектину при гiдролiзi комплексом ендо-ПГ, екзо-ПГ и ПМЕ можуть бути представлеш наступним чином:
Пектин
I
Деметоксильований пектин
Олггоуротди Моногалактуронова кислота
Для деградацп пектинових речовин поряд з пектинпдролазами використовують ферменти, що вщносяться до класу лiаз - пектинтранселiменази (ПТЕ). Цi ферменти викликають розривання глiкозидного 1-4 зв'язку шляхом транселiмiнацi!. Розрив мiж напiвацетальним киснем та 4-им вуглеводом супроводжуеться видаленням кисню, що знаходиться в траиспозицi! на 5-ому вуглевод^ в результатi чого виникае подвшний зв'язок мiж цими двома вуглеводами [1,3]:
кцсо—с=о он
он н^м —с = о
Рис. 2. Мехаиiзм дi! пектинтранселiменази на молекулу пектинових речовин
Отже, для досягнення поставлено! мети, слад проводити регулюючий ферментавний гiдролiз комплексом ферменпв, який складаеться з ферменту ендопектолггично! дi! (ендо-ПГ) та траиселiменазою (ендо-ПТЕ). Ведомо, що так1 олтесахариди складаються iз залишкiв галактуроново! кислоти i мають у кiнцi молекули мiж С4-С5 атомами вуглецю подвшний зв'язок, володшть
Н]00 — С = 0 ОИ
ом насо — с о
антиадгезивними властивостями. Саме така властивють дозволяе олиосахаридам блокувати зв'язок лiганд-рецепторiв з патогенними речовинами (тд патогенними у цьому випадку розумiють бактерi!, вiруси, гриби, катiони важких металiв) та проявляти себе як пребiотики [4].
Попередньо у лабораторних умовах нами були встановлеш оптимальш умови та параметри проведення ферментативного гiдролiзу рослинних полiсахаридiв, безпосередньо з яблучних вичавок, ферментом ендопектолiтично! дi! [5]. Другий етап дослвджень полягав у встановленш оптимальних умов та параметрiв проведення ферментативного гiдролiзу ферментом траиселiменазно! дi!.
Лiази найкраще проявляють сво! властивостi при рН в дiапазонi 6-8,5 та температурi 35-60 °С. У якостi попередньо! обробки яблучних вичавок запропоновано проводити гiдролiз активованою водою (рН=7,5), з додаванням поверхнево-активних речовин. За одиницю ПТЕ активносп приймали таку к1льк1сть ферменту, яка за 1 год гiдролiзу при температурi 40 °С утворюе ненасичеш продукти розщеплення молекули пектину, зб№шуе оптичну густину реакцiйно! сумiшi на 0,1 при довжиш хвилi 235 нм. Концентрашю олiгосахаридiв галактуроново! кислоти визначали карбазольним методом.
Опгнчаа
густнва. О
7 1 0,« -
0,5 " 0.4
0,3 " ОД "
0,1 -о
де: 1 - вижимки вщмип : активована вода (1:1) - фермент;
2 - вижимки вщмип : 1-% розчин ПАВ -фермент;
3 - вижимки вщмип : вода(1:1) - фермент
10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 Концентрдшя ГДЛДКТурОНОВОЙ КНСЛОТН, МКТ М1
Рис. 3. Глибина гiдролiзу за 30 хв
де: 1- вижимки вщмип : активована вода (1:1) - фермент;
2 - вижимки вщмип : 1-% розчин ПАВ -фермент;
3 - вижимки вщмип : вода (1:1) - фермент
галактурововон кнслотв, мкгм.1
Рис. 4. Глибина гiдролiзу за 60 хв
де: 1- вижимки вщмип : активована вода (1:1) - фермент;
2 - вижимки вщмип : 1-% розчин ПАВ -фермент;
3- вижимки ввдмил : вода (1:1) - фермент
лактурововон кислоти, мкг/мл
Рис. 5. Глибина гiдролiзу за 90 хв
Найкраща глибина пдрол1зу ферментом трансел1меназно1 дп спостер^алась шсля 90 хв проведення реакцп, при рН - 7,5 i температур1 40 °С. В результат! реакци отримано речовини молекулярною масою 3,5 кДа, частка ненасичених речовин складае 70 %.
Висновок. Проведен! дослвдження встановлюють параметри та умови ферментативного пдрол!зу пектинових речовин ферментом трансел!меназно1 дп i дозволяють отримати низькомолекулярш галактуронов! ол!госахариди.
Л1ТЕРАТУРА:
1. Чешкова А.В. Ферменты и технологии для текстиля, моющих средств, кожи, меха: Учеб. Пособие для вузов. - И.: ГОУВПО ИГХТУ, 2007. - 282 с.
2. Рудиченко В.Ф. Природш харчов! сорбенти як чинник здоров'я сучасно! людини. К.: Вища школа, 1997. - 367 с.
3. Патент RU (11) 2267324 (13) С2б МПК А61Л 31/70 - Препарат для уменьшения и/или блокирования адгезии патогенных веществ и организмов, применение антиадгезивных углеводов.
4. Безусов А.Т., Малькова М.Г. Технолопя виробництва галактуронових ол!госахарид!в i3 пектиновмюно! сировини [Тескст] / А.Т. Безусов, М.Г. Малькова // ОНАХТ, Харчова наука i технолопя. - 2010. - №1 (10).
БЕЗУСОВ Анатолш Тимофшович - д.т.н, професор, завщувач кафедри бютехнологп, консервованих продукпв i напо!в Одесько! нацюнально1 академй' харчових технологiй.
Шуков! iнтереси:
- науковi основи бютехнологп консервованих продукпв з рослинно! сировини i пдробюнпв;
- проблеми створення нових технологiй харчових продукпв.
Л1ГАНЕНКО Маргарита Геннадпвна - аспiрант II-го року навчання кафедри бютехнологп, консервованих продукпв i напо1в Одесько! нацюнально! академй' харчових технологiй.
Науковi штереси:
- проблеми створення нових технологш харчових продукпв;
- технологiя консервування плод!в i овоч!в.
