Преемственность цитогенетических характеристик в пассажах эмбриональной герминативной клеточной линии мыши G1 Текст научной статьи по специальности «Биологические науки»

■ И I II II

■тп

Оригинальные исследования

ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Преемственность цитогенетических характеристик в пассажах эмбриональной герминативной клеточной линии мыши 61

Т.Т. Глазко1, АЛ. Яцышина 2, О.В. Пидпала 2, ПЛ. Лукаш 2 1РСХА-МСХУ им. КА.Тимирязева, Москва, Россия 2 Институт молекулярной биологии и генетики НАНУ, Киев, Украина

Continuity of cytogenetic characteristics in passages of mice embryonic germ cell line G1

T.T. Glazko1, AP. Yacishina 2, O.V. Pidpala 2, L.L. Lukash 2 1RGAU-MAA of KA.Timirjazev's name, Moscow. Russia 2 Institute of molecular biology and genetics NASU. Kiev. Ukraine

Выполнен сравнительный анализ цитогенетических характеристик в популяциях клеток разных пассажей эмбриональной герминативной клеточной линии в1. полученной из полового бугорка 12.5-дневного эмбриона мыши линии ВАЬВ/с. Обнаружено, что несмотря на выраженную гетерогенность клеток по числу хромосом, робертсоновским транслокациям, для них характерны некоторые линейноспецифические черты кариотипа. в частности, близость числа хромосом к пента- и гексаплоидным наборам, а также присутствие транслокации Ц6;12]. Обсуждается возможность связи выявленных кариотипических особенностей с линеноспецифичес-кими механизмами поддержания полипотентности и пролиферации эмбриональных герминативных клеток в культуральных условиях.

Ключевые слова: эмбриональные герминативные клетки, робертсоновская транслокация.

The comparative analysis of cytogenetic characteristics in populations of cells of different passages of mice embryonic germ cell line G1 received from sexual puff of 12.5 days of embryo of the mouse of line BALB/c was carried out. It was revealed, that despite of the expressed heterogeneity of cells on number of chromosomes. Robertsonian translocation, some line specific karyotype features were characteristic for all investigated cell populations. It was. in particular, the closest of the chromosome numbers to penta- and hexaploidies. and also the presence of translocation t[6;12). The possible connections between revealing karyotype traits and the mechanisms of maintenance of cell poly potency and proliferation in cultural condition were discussed.

Key uiiords:embryonic germ cell, Robertsonian translocation.

Введение

Исследования эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) и эмбриональных герминативных (ЭГ) клеток занимают цен тральное место в изучении молекулярных основ ранних эта пов эмбриогенеза и в разработках новых методов клеточ ной терапии. ЭС клетки получают из внутренней клеточной массы бластоцист, ЭГ - потомки примордиальных герми нативных клеток. Эти клетки имеют общие характеристики плюрипотентности, к которым относятся неограниченная пролиферация, экспрессия ряда маркеров эмбриональных клеток, в частности, щелочной фосфатазы, Oct 4, а также способность дифференцироваться в производные всех трех зародышевых листков [1]. Считается, что кариотипическая эволюция таких эмбриональных клеток под влиянием уело вий культивирования может быть одной из причин сниже ния плюрипотентных свойств на более поздних пассажах [2].

В то же время, ранние события формирования линий эмбриональных клеток, специфика селекции клеточных кло нов после прохождения «кризиса», типичного для адапта ции клеток к новым условиям их культивирования in vitro [3], до сих пор остаются недостаточно исследованными в связи с ограниченностью количества клеток на этих пассажах. Важность изучения ранних событий обусловлена тем, что традиционно кариотипический анализ выполняется на

преобладающих («модальных») клеточных клонах, успешно переживших такой «кризис», что не исключает присутствия «минорных» вариантов и изменений их соотношений в процессах пассирования клеток. Так, кариотипирование независимо полученных 88 ЭСК линий мышей показало, что «нормальный» кариотип, как модальный в большинстве кле ток, обнаруживается только в 53 из них, причем в 52 линиях состав половых хромосом был ХУ, а у одной линии - XX; все остальные ЭСК линий несли различные типы цитогенетичес ких аномалий [4].

В целях исследований преемственности кариотипичес ких характеристик в разных пассажах ЭГ клеток в настоя щей работе выполнен анализ клеточных популяций ЭГ 61, полученных из полового бугорка 12,5 дневного эмбриона мыши линии ВА1_В/с [5, 6].

Материал и методы

В анализ включены популяции клеток 01, полученные на 15 м и 75 м пассажах после их выделения из полового бу горка 12,5 дневного эмбриона мыши линии ВА1_В/с, а так же три пассажа (35/14, 35/26 и 35/40) сублинии 01 ОА, выделенной из 01 на 35 м пассаже путем селекции на не зависимый рост от сывороточных факторов (1%) (5, 6]. Ме тодика получения метафазных пластинок детально описана

А

I I I I I I

■ I I I

Оригинальные исследования

в работе [6]. Клетки суспендировали и инкубировали 30 мин в растворе KCI (0,56%) при +37°С. Хромосомы фиксирова ли смесью метилового спирта и ледяной уксусной кислоты (3:1), трижды меняя фиксирующий раствор. Препараты рас капывали на холодные мокрые стекла, высушивали и окраши вали красителем Гимза («Merck», Германия). Окрашенные цитогенетические препараты анализировали с помощью микроскопа Carl Zeiss при увеличении в 10ОО раз. Метафаз ные пластинки фотографировали при помощи цифрового фотоаппарата Canon (PowerShot G6, Great Britain). Индиви дуальное типирование хромосом проводили в соответствии с данными Cowell J.K. (7). Анализировали количество хромо сом и их качественный состав; для отдельных метафазных пластинок составляли кариограммы. Подсчет количества хромосом (Хр) в клетках выполняли на фотографиях мета фазных пластинок.

Изменчивость клеточных популяций по числу Хр харак теризовали по следующим показателями: пределам варьи рования, долей клеток с модальным числом Хр и шириной модального класса. В связи с выраженным разнообразием ЭС клеток по количеству Хр учитывали количество клеток (в процентах от общего количества рассмотренных клеток) с близкими числами Хр, которые встречались чаще, чем дру гие, и обозначали его как условно модальное число Хр.

Результаты и обсуждение

Анализ распределения клеток по числу хромосом позво лил выявить их широкое разнообразие во всех исследован ных пассажах клеток (табл.1). По данным, представленным в этой таблице, видно, что клетки на протяжении 75 пасса жей сохраняют высокий уровень гетерогенности по присут ствию различных клонов, отличающихся по числу Хр. Тем не менее, наблюдается определенная предпочтительность по представленности среди них клеток с гиперпента и гипо гексаплоидным набором Хр (см. табл. 1).

Наиболее гетерогенной по присутствию клеток с разным числом Хр оказалась клеточная популяция линии G1 самого раннего из исследованных пассажей, G1 15. По сравнению с другими пассажами в ней выявляется относительно по вышенная частота встречаемости гипергексаплоидных кле ток (см. табл. 1). В пассажах сублинии G1 ОА, полученной путем селекции клеток на среде, обедненной сывороточны ми факторами, по сравнению с 15 м и 75 м пассажами линии G1, обнаруживается некоторая стабилизация клеток по числу Хр с тенденцией к увеличению доли гипотетрапло идных гипопентаплоидных клеток к 35/40 му пассажу сублинии G1 ОА.

Во всех рассмотренных клеточных популяциях наблюда ется высокая частота центрических слияний Хр (робертсонов ских транслокаций, РБ). В исходной линии ЭСК 61 на 15 м пассаже они встречались с частотой 2,1 ±0,3 на одну клет ку. Не уменьшалась частота их встречаемости и у сублинии ОА на 14 м, 26 м и 40 м пассажах (2,2±0,3; 2,2±0,2; 1,9±0,2 соответственно).

В некоторых работах высказываются предположения о том, что повышенная частота таких центрических слияний может быть связана с гиперплоидностью клеток (6). Однако в наших исследованиях не обнаружено прямой связи между числом Хр в клетках и присутствием робертсоновских транс локаций (табл. 2).

Как правило, центрические слияния наблюдались между гетерологичными хромосомами, только в одной клетке субли нии 61 ОА на 14 м пассаже была обнаружена изохромосома РБ (8;8) (рис. 1). В гетерологичных центрических слияниях принимали участие все без исключения хромосомы; в суб линии 61 ОА на 35/14 м пассаже относительно чаще, чем другие, в таких слияниях участвовали Хр 5, 8, 9, 10, 12 и 14 (см. рис. 1).

Для того, чтобы оценить особенности хромосомного соста ва, отдельные клетки каждого пассажа были кариотипирова ны. Пример результата кариотипирования метафаз сублинии 61 ОА на 35/14 м пассаже представлен в таблице 3. Вид но, что в большинстве случаев Хр присутствуют в метафазных пластинках в 4-6 копиях, за исключением Хр 6, 7 и 12, по которым обнаруживается определенный дефицит копий по сравнению с другими Хр (табл. 3). В относительно избыточном количестве копий представлена Хр 11 (см. табл. 3). Сходные тенденции наблюдаются и в кариотипированных клетках других клеточных популяций линии 61.

Рис, 1, Робертсоновские транслокации [РБ] в разных метафазах эмбриональной герминативной клеточной сублинии С1-0А на 35/14 пассаже.

Слева направо - РБ [8;8], РБ 15;?], РБ 15;?), РБ 15;?), РБ [5;16), РБ [5;8), РБ [9;14), РБ [19;?)

Таблица 1. Гетерогенность клеток по количеству хромосом в исследованных клеточных популяциях

Линия или сублиния Число исследованных клеток Число хромосом в клетке Доля клеток с условно модальным числом хромосом,%

Пределы варьирования Условно модальное

Линия 01, пассаж ^ SO 40-173 40; 108; 117; 126-127 6; 8; 6; 18

Линия 01, пассаж 7S 30 47-247 96-103; 108-116 16; 23

Сублиния G1-0A:

Пассаж ЗS/14 74 S8-126 110-112; 114-117; 123-126 14; 3S; 12

Пассаж ЗS/26 43 S0-12S 110-111; 113-11S 21; 26

Пассаж ЗS/40 70 SS-134 71-79; 90-9S 23; 19

І І І І І І

■ І І І

Оригинальные исследования

Таблица 2. Количество хромосом и робертсоновских транслокаций (РБ) в Б1 15 и в Б1-ОА 35/14

Таблица 3. Хромосомный состав метафазных пластинок сублинии Б1-ОА на 35/14 пассаже

Число хромосом Є1 15 пассаж (БО метафаз) Є1-ОА 35/14 пассаж (ЗО метафаз)

Кол-во клеток Кол-во РБ в каждой клетке Кол-во клеток Кол-во РБ в каждой клетке

40 3 2РБ, - -

44 I 1РБ - -

S4 I - - -

S8 - 1 2РБ

62 I 2РБ - -

63 I - - -

6S I 4РБ - -

66 1РБ, 1РБ - -

68 I 2РБ - -

73 I 3РБ 2 2РБ, 2РБ

7S I 2РБ - -

80 - 1 2РБ

81 I 3РБ - -

87 - 1 2РБ

89 I 1РБ - -

91 2РБ,22РБ - -

100 I 2РБ 1 1РБ

102 - 1 1 РБ

103 - 1 2РБ

105 I 2РБ 1 3РБ

106 - 1 2РБ

107 I 3РБ - -

108 2РБ, SРБ, 1РБ, - -

1РБ

110 I 2РБ 3 3РБ, SРБ, 2РБ

111 I 3РБ - -

114 - 8 0-2РБ

115 I 3РБ 2 3РБ,23РБ

116 I 2РБ - -

117 2 3РБ, 4РБ 1 1 РБ

119 - - 1 2РБ

120 - - 1 3РБ

121 2 3РБ,22РБ, 2 4РБ,24РБ

123 I SРБ - -

124 I 2РБ 1 1РБ

126 4 2РБ,24РБ,23РБ, 1 1 РБ

2РБ

127 S 2РБ,23РБ,24РБ, - -

3РБ, 1РБ

130 I 1 РБ - -

134 I 3РБ - -

135 2 1РБ, 2РБ - -

136 I 1 РБ - -

141 I 2РБ - -

173 I 6РБ - -

Номера метафаз / Хромосомы №1 №4 №9 №12 №22 №207 №8 №25

1 5 4 4 5 6 6 5 5

2 5 4 3 5 5 4 5 5

3 5 4 5 6 5 5 4 5

4 3 4 4 5 4 5 5 4

S 5 5 6 6 6 5 6 6

6 2 3 5 5 4 3 4 6

7 4 3 2 2 4 3 3 4

8 4 4 6 5 6 4 5 4

9 6 4 6 6 5 4 6 5

10 3 4 6 6 6 4 5 4

11 7 4 6 6 6 7 7 6

12 3 3 6 3 4 2 3 4

13 6 3 5 6 6 4 5 3

14 4 3 6 5 5 4 5 4

4 3 5 4 4 5 3 6

16 5 3 6 5 6 5 6 5

17 6 4 7 5 5 5 5 5

18 6 4 5 6 6 6 6 5

19 7 4 6 6 6 5 6 6

X 4+2У 4 4 1 1, 2У 4 4+2У 3

РБ 8; 19 10; ? 8;9 Х;15 3;14 1 ;Х 3;? 17;18

РБ РБ РБ РБ РБ РБ 7; 18 5; ? 3;14 7;? 12;? 8;13 ?;? 15;? 9;? Х;10 6;8 11;15 12;18 18;? 15;? 12;? 10;? 6;? 17;18 8;12 14;17 ?;?

Перестроенные 21 + 11+ 16+ 13+ 13+ 14+ 19+ 19+

хромосомы 2РБ 2РБ 1 РБ 6 РБ 3РБ 7РБ 4 РБ 5РБ

Суммарное количество плеч 125 89 126 121 121 120 125 124

Примечание. Знаком «-» отмечено отсутствие в рассмот ренных пассажах клеток с указанным в первом столбце числом хромосом.

Примечание. Цифрами в столбцах указано количество копий не перестроенных хромосом в каждой из кариотипированных метафаз; X, У - половые хромосомы; РБ - робертсоновские транслокации; знаком «?» отмечены случаи, когда в РБ участвует перестроенная нетипируемая хромосома.

Интересно отметить, что увеличение копийности Хр 11 выявлено в большом количестве линий ЭСК мыши, что свя зывают с локализацией в этой Хр гена БТАТЗ, участвующего в БТАТЭ/^АК пути контроля клеточной пролиферации и, соответственно, накоплением клеток с увеличенной копий ностью Хр11 при их отборе в культуральных условиях на высокий уровень пролиферативной активности [8].

Одна из возможных причин относительного дефицита копий Хр 6 и 12 может быть обусловлена тем, что в клетках всех рассмотренных популяций встречается транслокация между этими двумя хромосомами (рис. 2). Необходимо отме тить, что такая же транслокация была выявлена нами ранее в клетках миелом мышей той же линии ВА1_ЕЗ/с [9].

Транслокация Ь(6;12) не является типичной транслока цией для клеток миелом; как правило, в них встречаются варианты Ь(6; 15), Ь(12;15) транслокации между хромо сомами, несущими гены иммуноглобулинов (Хр 6,12) и туе онкоген (Хр 15) [10].

■ ИМИ!

Оригинальные исследования

Рис. 2. Примеры транслокаций между хромосомой 12 [сегменты А-Е] и хромосомой 6 [сегменты С-6), присутствующих в клеточных популяциях эмбриональной герминативной клеточной линии Б1 рассмотренных пассажей 15, 75, а также сублинии <31-ОА пассажей 35/14, 35/26 и 35/40.

Слева направо: хромосома 12, #6,12), #6,12), #6,12), #6,12), #6,12), хромосома б.Стрелками указаны места разрыва при транслокации: на хромосоме 12 разрыв проходит в сегменте Е, на хромосоме 6 - в сегменте С

В последние годы показано, что способность ЭСК к само копированию без дифференцировки зависит от экспрессии комплекса генов, таких, как Esrrb, ТЬхЗ и Тс11, Nanog, 0ct4 и Sox2. Экспрессия 0ct4 необходима для предупреждения диф ференцировки клеток в трофоэктодермальном направлении. Nanog и Sox2, по видимому, являются интегральными регу ляторами, подавляющими многие дифференцировочные про граммы, а экспрессия генов Esrrb, ТЬхЗ и Тс11 необходима для блокирования программ клеточной дифференцировки в клеточные линии, производные эпибласта [11].

Nanog локализован в сегменте F2 хромосомы 6, Тс11 -в сегменте Е хромосомы 12, a Esrrb - в сегменте D2 хромо сомы 12. ТЬхЗ локализован в сегменте F Хр 5, a Sox2 -в сегменте В Хр 3 (www.ncbi.nlm.nih.gov).

Таким образом, транслокация t(6; 12) объединяет три ключевых гена из пяти имеющихся, блокирующих клеточную дифференцировку и способствующих самокопированию кле ток в отношении сохранения плюрипотентности. Интересно отметить, что в сегменте С Хр 12 локализован псевдоген Nanog PS2.

Судя по дифференциальной исчерченности перестро енной хромосомы (см. рис. 2), разрыв в Хр 12 проходит по сегменту Е, в котором локализован ген Тс11. В Хр 6 разрыв попадает на сегмент С, расположенный существенно выше локализации Nanog.

На основании полученных данных можно предположить, что присутствие одной и той же транслокации Щ3;12) в клетках миелом, а также во всех рассмотренных популяциях ЭГ 61 в определенной степени может быть связано со способное тью опухолевых и ЭГ клеток сохранять полипотентность и избегать терминальных стадий дифференцировки.

Миеломы состоят из клеток потомков высокоспециали зированных В лимфоцитов, способных к таким специали зированным клеточным синтезам, как продукция иммуно глобулинов. Если предполагать наличие определенной связи между транслокацией Ь(6;12) и нарушением событий цито дифференцировки, то речь может идти только о поздних ее этапах.

Не исключено, что присутствие транслокации 1(6; 12) в миеломах и ЭГ клеток связано с общим происхождением клеток от линии мышей ВА1_В/с, а также с тем, что для ЭГ клеток этого происхождения присутствие Ь(6; 12) типично только для исследованной линии клеток ЭГ 61. Выяснение этих вопросов является предметом дальнейших исследо ваний.

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что в исследованных клеточных популяциях разных пассажей ЭГ 61, несмотря на селекцию в отношении неза висимости от сывороточных факторов, высокую гетероген ность по сочетанию клеток с разным числом Хр, постоянные процессы генерации популяционно генетического разнооб разия, о чем свидетельствуют широкие спектры робертсо новских транслокаций, а также наличие гипероктаплоидных клеток даже на 75 м пассаже ЭГ клеток 61, эта линия име ет свои кариотипические особенности. К основным из них, по видимому, относятся высокая частота встречаемости ро бертсоновских транслокаций (около 2 на клетку), преем ственность близости числа Хр к пента и гексаплоидному набору, а также присутствие транслокации Ь(6;12).

Можно предположить, что выявленные особенности сви детельствуют о наличии линейноспецифичных механизмов генерации генетической изменчивости, необходимой для адаптации клеток к росту в культуральных условиях в недиф ференцированном состоянии.

Работа выполнена при частичном финансировании Ми нистерства образования и науки Украины (№ Ф18/11 2006).

ЛИТЕРАТУРА:

1. Park J.H., Kim S.J., Lee J.B. et al. Establishment of a human embryonic germ cell line and comparison with mouse and human embryonic stem cells. Mol. Cells 2004; 17(2): 309 15.

2. Mitalipov S.M., Mitallipova M.M., Ivanov V.l. The effect of the duration of culturing on the pluripotency of mouse embryonic stem (ES) cells in vitro and in vivo. Ontogenez 1994; 25(6): 19 27.

3. Волгарева Г.М. Хромосомные маркеры мышиных гибридом. Журн. микробиол. эпидемиол. иммунобиол. 1986; 18(2): 69 73.

4. Sugawara A, Goto К., Sotomaru Y. et al. Current status of chromosomal abnormalities in mouse embryonic stem cell lines used in Japan. Comparative Medicine 2006; 56(1): 33 6.

5. Лукаш Л.Л., Яцишина А.П., Підпала O.B. и др. Одержання нових ліній стовбурових клітин миші і вивчення впливу мікрооточення на 'іхню каріотипічну мінливість in vitro. Физиология и биохимия культурных растений 2006; 38(2): 144 52.

6. Яцишина А.П., Підпала О.В., Кочубей Т.П., Лукаш Л.Л. Спонтанна каріотипічна еволюція клітин in vitro. Фактори експериментальної еволюції організмів 2004; Київ: КВІЦ: 88 92.

7. Cowell J.K. A photographic representation of the variability in the G banded structure of the chromosomes in the mouse karyotype. A guide to the identification of the individual chromosomes. Chromosoma 1984; 89(4): 294 320.

8. Raz R., Lee С. K., Cannizzaro L.A. et al. Essential role of STAT3 for embyonic stem cell pluripotency. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1999; 96(6): 2846 51.

9. Глазко T.T. Кариотипические особенности ряда клональных линий межвидовой гибридомы мышь норка. Цитология 1988; 30(5): 597 605.

10. Silva S., Kovalchuk A.L., Kim J.S. et al. BCL2 Accelerates inflammation induced balb/c plasmacytomas and promotes novel tumors with coexisting t[12;15) and t[6;15) translocations. Cancer Research 2003; 63(24): 8656 63.

11. Ivanova N., Dobrin R., Lu R. et al. Dissecting self renewal in stem cells with RNA interference. Nature 2006; 442(7102): 533 8.

Поступила: 11.06.2007

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том II, hl< 3, 2007