CC BY
36
С.Е. Волчков 1, О.В. Тюмина 1, Л.Т. Волова а Определение оптимального источника ММСК для создания банка клеток
1 ГУЗСО «Клинический центр клеточных технологий»
Самара, Россия
2 ГОУ ВПО «Самарский государственный медицинский университет Федерального
агентства по здравоохранению и социальному развитию», Самара, Россия
S.E. Volchkov, O.V. Tyumina, T.L. Volova
Defining of the optimal source of hMMSC to create
a cell bank
Цель — определить оптимальный источник мульти-потентных мезенхимальных стромальных клеток (ММСК) с позиции доступности и этичности получения биологического материала, биологических свойств полученных клеток, с целью создания депозита клеточного материала.
Материал и методы. Было обработано 26 образцов пуповинной крови (ПК), 15 образцов костного мозга (КМ) и 15 образцов липоаспирата (ЛА). Проводили оценку пролиферативного потенциала с помощью автоматического анализатора клеток Vi-Cell XR фирмы Beckman Coulter (США), дифференцировку в адипо-генном, хондрогенном и остеогенном направлениях с применением коммерческих сред фирмы Miltenyi Biotec (Германия), цитологическое исследование, мор-фометрию и кластерный анализ проводили на микроскопе Axio Observer А1 фирмы Carl Zeiss (Германия), иммунофенотип оценивали на проточном цитометре FACS Canto фирмы Becton Dickinson (США); концентрацию цитокинов измеряли на проточном флюоримет-ре Lab Scan Х100 фирмы Luminex (США), наборами 27 plex assay фирмы BioRad (США). Исследование адгезивной способности клеток к различным имплантатам (лиофилизированная кость, металлорезина) проводили методом совместного культивирования с оценкой на сканирующем электронном микроскопе Quanta Inspect S фирмы FEI (Япония).
Результаты. Частота колониеобразования клеток из костного мозга составила 100%, доля колониеобразующих единиц среди мононуклеаров составила 0,0005%, максимальное количество удвоений культуры 31 удвоение, липоаспирата 100% и 0,25% и 27 удвоений, пуповинной крови 15,33% и 0,000059% и 60 удвоений соответственно. Скорость удвоения клеточной культуры составила 0,0376 уд/час для КМ, 0,0466 для ПК и 0,0262 для ЛА соответственно. Клетки всех источников были позитивны на CD44, CD73, CD90, CD105 и негативны на CD14, CD34, CD38, CD45, HLA-DR. Дифференцировка в адипогенном, хондрогенном и остеогенном направлении, была позитивной у всех источников. Адипогенная дифференци-рока клеток пуповинной крови была зарегистрирована только к 30 сут. против 21 у других источников. Морфологическое исследование и кластерный анализ показали схожесть клеток из разных источников. Клетки всех источников делились на три группы по размерам, «незрелые» — небольшие клетки с правильной веретенообразной формой, клетки имели площадь от 1000 до 8000 мкм2; «взрослые» — средние клетки, фиброб-ластоподобная форма, некоторые клетки имеют отростки, площадь от 8000 до 20 ООО мкм2; «гигантские» — крупные клетки, часто с неправильной, кубоидной формы, с множеством отростков, площадь таких клеток
от 20000 до 40000 мкм2 и выше. Концентрация цитокинов G-CSF, GM-CSF, IL-4, RANTES, TNF—, достоверно (р<0,05) менялась в течение культивирования во всех исследуемых группах в сторону увеличения концентрации, в то время, как FGF basic, IL-15, IL-17, IL-1 га, IL-6, IL-8, МСР-1 (MCAF), VEGF, Eotaxin, ylFN, IP-10, оставались без изменений (р>0,05). При совместном культивировании клеток и имплантатов было зафиксировано полное прорастание исследуемых имплантатов клетками из всех трех источников, что подтвердилось данными как световой, так и электронной микроскопии.
На основании анализа полученных результатов, мы определили, что клетки из костного мозга, пуповинной крови и липоаспирата имеют схожие биологические характеристики и могут быть отнесены к группе муль-типотентных мезенхимальных клеток. Данные лабораторных исследований, этической оценки и особенностей получения материала позволили выявить, что для быстрого и безопасного получения большого количества ММСК, необходимого для создания банка клеток, оптимальным источником является липоаспират.
Т.Т. Глазко
Эпигенетическая и мутационная изменчивость эмбриональных стволовых клеток
Российский государственный аграрный университет -МСХА им. КА. Тимирязева, Москва, Россия [email protected]
Т.Т. Glazko
Epigenetic and mutation variability of embryonic stem cells
Одна из проблем в разработках методов исследования и применения эмбриональных стволовых клеток (ЗСК) заключается в нестабильности их генетического аппарата, и, соответственно, генетической гетерогенности их популяций. Разнообразие механизмов, лежащих в основе такой нестабильности, их классификация и особенности мутационных спектров в разных линиях ЗСК до сих пор остаются недостаточно исследованными. В этой связи в настоящей работе выполнен сравнительный анализ мутационных спектров и характеристик эпигенетической изменчивости 8 сублиний линии ЗСК R1, полученной из эмбриона лабораторной линии мышей 129/Sv Наги и др. (Nagy et al., 1993), предоставленных для исследований к.б.н. Л.М. Межевикиной (Институт биофизики клетки РАН, Пущино) и эмбриональных герминативных (ЗГ) клеточных популяций на 15-м и 75-м пассажах клеточной линии G1, полученной из полового бугорка 12,5 дневного эмбриона мыши линии BALB/c, а также 14, 26 и 40 пассажах сублинии ОА, выделенной из линии G1 на 35-том пассаже путем высева клеток на среду, обедненную сывороточными факторами (предоставлено для исследований д.б.н. Л.Л. Лукаш, Институт молекулярной биологии и генетики НАНУ, Киев, Украина).
Препараты клеток получали стандартным путем, высушивали и окрашивали красителем Гимза («Мегск», Германия). Индивидуальное типирование хромосом проводили в соответствии с данными J.K. Cowell. В анализ включены следующие характеристики: анеуп-лоидия, полиплоидия, частота встречаемости метафаз с хромосомными аберрациями, с межхромосомными ассоциациями по типу робертсоновских транслокаций (РБ) и с опережающим расщеплением центромерных
районов (ОР). Количество метафаз, двуядерных лейкоцитов, лейкоцитов с микроядрами, апоптозных клеток оценивали на тех же препаратах в клетках с сохраненной цитоплазмой в промилле (%□).
Рассмотрены частоты встречаемости различных цитогенетических аномалий в 8 клеточных популяциях исходной линии R1, отличающихся количеством пассажей после размораживания. Количество хромосом в клетках было относительно стабильным и колебалось от 37 до 42, однако популяции клеток широко варьировали по составу РБ. Во всех исследованных популяциях обнаруживался избыток копий хромосомы 8. Для около половины метафаз характерно присутствие спонтанного дифференциального окрашивания хромосом, без предварительной обработки трипсином (G-бендинг). Частота встречаемости таких клеток уменьшалась с увеличением количества пассажей. Обнаружены выраженные отличия между клеточными популяциями по частотам встречаемости метафаз с ОР, что, по литературным данным, является маркерной особенностью герминативной популяции эмбриональных клеток (Bernardino-Sgherri et al., 2002). В таких метафазах наблюдались сложные межхро-мосомные перестройки по центромерным районам. В общем, для группы сублиний ЭСК R1, при около-диплоидном числе хромосом, типичны выраженная гетерогенность по различным типам цитогенетических аномалий и РБ, темпам клеточного деления, а также по таким эпигенетическим характеристикам, как склонность к образованию эмбриоидных тел, спонтанному G-бендингу и частотам встречаемости клеток с ОР.
Популяции клеток разных пассажей ЭГ G1 отличались друг от друга по числу хромосом, близкому к тет-ра- пента- и гексаплоидным наборам, с относительным увеличением количества диплоидных клеток к 75 пассажу. Выявлены конфигурации метафаз, свидетельствующие о многополюсных митозах и межклеточных слияниях. Наблюдается выраженная гетерогенность клеток по различным вариантам РБ, относительный дефицит копий хромосом 6, 7 и 12 и избыток — хромосомы 11. Во всех исследованных клеточных популяциях присутствовала транслокация t(6;12). Обнаружен новый тип хромосомных аберраций, обусловленный хромосомными разрывами в проксимальных участках. В популяциях клеток ЭГ G1, так же, как и в сублиниях ЭСК R1, выявлена выраженная гетерогенность по эпигенетическим характеристикам: метафазам со спонтанным G-бендингом, частота которых убывает с увеличением времени культивирования клеток, а также клеток с деспирализацией перицентромерных районов хромосом и ОР.
Для 8 групп клеток ЭСК R1 линейноспецифичным была выраженная избыточность количества копий хромосомы 8 при сохранении околодиплоидного набора, для 5 групп — выявление специфики клеток ЭГ G1 — полиплоидизация с формированием множественных межхромосомных транслокаций при постоянном присутствии t(6; 12). Транслокация t(6; 12) объединяет три ключевых гена (Nanog, Тс11, Esrrb) из пяти имеющихся (Esrrb, ТЬхЗ и Тс11, Nanog, 0ct4 и Sox2), блокирующих клеточную дифференцировку и способствующих самокопированию клеток. Хромосомы 8 и 11 несут ключевые гены пути JAK-STAT, контролирующего активацию пролиферации.
Полученные данные свидетельствуют о наличии линейноспецифичных механизмов генерации генетической изменчивости, необходимой для адаптации
клеток к росту в культуральных условиях в недифференцированном состоянии. В то же время, конечный итог такой адаптации приводит к изменению хромосомного баланса в сторону увеличения копийности хромосом, несущих гены активации клеточной пролиферации. Это соответствует селективным условиям культивирования клеток, направленным на поддержание высоких темпов клеточного деления, препятствующих клеточной дифференцировке. В случае ЭСК R1 генерация генетической изменчивости клонов, из которых отбираются наиболее успешно пролиферирующие, включает нарушение распределения хромосом по дочерним клеткам, по-видимому, с участием повышенной частоты формирования РБ, для клеток ЭГ G1 — полиплоидизацию, повышение частоты хромосомных разрывов и обменов. При сходном направлении эволюции клонального состава в сторону поддержания пролиферации, ее механизмы имеют выраженную линейную специфику.
А.Н. Гольцев, Т.Г. Дубрава, Е.Д. Луценко,
Л.В. Останкова, И.Ю. Мацевитая, М.В. Останков,
М.А. Сироус, Е.А. Порожан, К.А. Гольцев,
А.Ю. Димитров
Проявление иммунокорригирующего эффекта криоконсервированных клеток фетальной печени разных сроков гестации в условиях развития экспериментальной модели реакции «трансплантат против хозяина»*
Институт проблем криобиологии и криомедицины
НАН Украины, Харьков, Украина
A.N. Goltsev, T.G. Dubrava. ED. Lutsenko, L.V. Ostankova,
I.Yu Matsevitaya, M.V. Ostankov, M.A. Sirous, E.A. Porozhan,
K.A. Goltsev, A.Yu. Dimitrov
Manifestation of immune correcting effect of cryopreserved cells of fetal liver of different gestation terms under development conditions of experimental model of graft versus ghost reaction
В работе проведена сравнительная оценка иммунокорригирующей активности криоконсервированных и нативных клеток фетальной печени (КФП) разных сроков гестации в экспериментальной модели локальной РТПХ (лРТПХ). Индукцию лРТПХ проводили на мышах линии C57BI/6 путем подкожного введения в подушечку задней лапы клеток лимфоузлов (ЛУ) линии СВА/Н. Через 1 сут. после инициации лРТПХ мышам внутривенно вводили нативные (нКФП) или криоконсерви-рованные (кКФП) КФП 14-х или 18-х сут. гестации мышей линии СВА. На 5-е сут. после инициации патологии оценивали следующие показатели: индекс РТПХ, содержание Treg (FoxP3+, Сй4+С025+клеток) лимфоузлов (ЛУ) на проточном цитофлуориметре FACS Calibur (Becton Dickinson, USA), экспрессию гена tgf-p — методом ПЦР; содержание ИЛ-2, ИЛ-10, ФНО-— в сыворотке крови животных — иммуноферментным методом на анализаторе Stat Fax 2100 (USA). Установлено, что при индукции лРТПХ манифестируются признаки характерные для патологий аутоиммунного генеза. В условиях развития лРТПХ, КФП минимизируют клинические признаки патологии и интенсивность развития иммуновоспалительной реакции. Терапевтическая активность КФП в большей степени коррелировала с содержанием в ЛУ FOXP3+ клеток и экспрессией гена
* Статья опубликована полностью в рубрике «Оригинальные исследования».
