Определение оптимального источника ММСК для создания банка клеток Текст научной статьи по специальности «Биотехнологии в медицине»

С.Е. Волчков 1, О.В. Тюмина 1, Л.Т. Волова а Определение оптимального источника ММСК для создания банка клеток

1 ГУЗСО «Клинический центр клеточных технологий»

Самара, Россия

quality@cordbank.ru

2 ГОУ ВПО «Самарский государственный медицинский университет Федерального

агентства по здравоохранению и социальному развитию», Самара, Россия

S.E. Volchkov, Ü.V. Tyumina, T.L. Volova

Defining of the optimal source of hMMSC to create

a cell bank

Цель — определить оптимальный источник мульти-потентных мезенхимальных стромальных клеток (ММСК) с позиции доступности и этичности получения биологического материала, биологических свойств полученных клеток, с целью создания депозита клеточного материала.

Материал и методы. Было обработано 26 образцов пуповинной крови (ПК), 15 образцов костного мозга (КМ) и 15 образцов липоаспирата (ЛА). Проводили оценку пролиферативного потенциала с помощью автоматического анализатора клеток Vi-Cell XR фирмы Beckman Coulter (США), дифференцировку в адипо-генном, хондрогенном и остеогенном направлениях с применением коммерческих сред фирмы Miltenyi Biotec (Германия), цитологическое исследование, мор-фометрию и кластерный анализ проводили на микроскопе Axio Observer А1 фирмы Carl Zeiss (Германия), иммунофенотип оценивали на проточном цитометре FACS Canto фирмы Becton Dickinson (США); концентрацию цитокинов измеряли на проточном флюоримет-ре Lab Scan Х100 фирмы Luminex (США), наборами 27 plex assay фирмы BioRad (США). Исследование адгезивной способности клеток к различным имплантатам (лиофилизированная кость, металлорезина) проводили методом совместного культивирования с оценкой на сканирующем электронном микроскопе Quanta Inspect S фирмы FEI (Япония).

Результаты. Частота колониеобразования клеток из костного мозга составила 100%, доля колониеобразующих единиц среди мононуклеаров составила 0,0005%, максимальное количество удвоений культуры 31 удвоение, липоаспирата 100% и 0,25% и 27 удвоений, пуповинной крови 15,33% и 0,000059% и 60 удвоений соответственно. Скорость удвоения клеточной культуры составила 0,0376 уд/час для КМ, 0,0466 для ПК и 0,0262 для ЛА соответственно. Клетки всех источников были позитивны на CD44, CD73, CD90, CD105 и негативны на CD14, CD34, CD38, CD45, HLA-DR. Дифференцировка в адипогенном, хондрогенном и остеогенном направлении, была позитивной у всех источников. Адипогенная дифференци-рока клеток пуповинной крови была зарегистрирована только к 30 сут. против 21 у других источников. Морфологическое исследование и кластерный анализ показали схожесть клеток из разных источников. Клетки всех источников делились на три группы по размерам, «незрелые» — небольшие клетки с правильной веретенообразной формой, клетки имели площадь от 1000 до 8000 мкм2; «взрослые» — средние клетки, фиброб-ластоподобная форма, некоторые клетки имеют отростки, площадь от 8000 до 20 ООО мкм2; «гигантские» — крупные клетки, часто с неправильной, кубоидной формы, с множеством отростков, площадь таких клеток

от 20000 до 40000 мкм2 и выше. Концентрация цитокинов G-CSF, GM-CSF, IL-4, RANTES, TNF—, достоверно (р<0,05) менялась в течение культивирования во всех исследуемых группах в сторону увеличения концентрации, в то время, как FGF basic, IL-15, IL-17, IL-1 га, IL-6, IL-8, МСР-1 (MCAF), VEGF, Eotaxin, ylFN, IP-10, оставались без изменений (р>0,05). При совместном культивировании клеток и имплантатов было зафиксировано полное прорастание исследуемых имплантатов клетками из всех трех источников, что подтвердилось данными как световой, так и электронной микроскопии.

На основании анализа полученных результатов, мы определили, что клетки из костного мозга, пуповинной крови и липоаспирата имеют схожие биологические характеристики и могут быть отнесены к группе муль-типотентных мезенхимальных клеток. Данные лабораторных исследований, этической оценки и особенностей получения материала позволили выявить, что для быстрого и безопасного получения большого количества ММСК, необходимого для создания банка клеток, оптимальным источником является липоаспират.

Т.Т. Глазко

Эпигенетическая и мутационная изменчивость эмбриональных стволовых клеток

Российский государственный аграрный университет -МСХА им. КА. Тимирязева, Москва, Россия vglazko@yahoo.com

Т.Т. Glazko

Epigenetic and mutation variability of embryonic stem cells

Одна из проблем в разработках методов исследования и применения эмбриональных стволовых клеток (ЗСК) заключается в нестабильности их генетического аппарата, и, соответственно, генетической гетерогенности их популяций. Разнообразие механизмов, лежащих в основе такой нестабильности, их классификация и особенности мутационных спектров в разных линиях ЗСК до сих пор остаются недостаточно исследованными. В этой связи в настоящей работе выполнен сравнительный анализ мутационных спектров и характеристик эпигенетической изменчивости 8 сублиний линии ЗСК R1, полученной из эмбриона лабораторной линии мышей 129/Sv Наги и др. (Nagy et al., 1993), предоставленных для исследований к.б.н. Л.М. Межевикиной (Институт биофизики клетки РАН, Пущино) и эмбриональных герминативных (ЗГ) клеточных популяций на 15-м и 75-м пассажах клеточной линии G1, полученной из полового бугорка 12,5 дневного эмбриона мыши линии BALB/c, а также 14, 26 и 40 пассажах сублинии ОА, выделенной из линии G1 на 35-том пассаже путем высева клеток на среду, обедненную сывороточными факторами (предоставлено для исследований д.б.н. Л.Л. Лукаш, Институт молекулярной биологии и генетики НАНУ, Киев, Украина).

Препараты клеток получали стандартным путем, высушивали и окрашивали красителем Гимза («Мегск», Германия). Индивидуальное типирование хромосом проводили в соответствии с данными J.K. Cowell. В анализ включены следующие характеристики: анеуп-лоидия, полиплоидия, частота встречаемости метафаз с хромосомными аберрациями, с межхромосомными ассоциациями по типу робертсоновских транслокаций (РБ) и с опережающим расщеплением центромерных

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том V, 1У< 3, 2010