CC BY
170
Оригинальные исследования
51
Влияние пористых трехмерных имплантатов из нитинола на культуру мультипотентных мезенхимных стромальных клеток
С.Е. Волчков 1, И.В. Шишковский 21, И.М. Байриков 1
1 Самарский государственный медицинский университет, Самара
2 Физический институт им. П.Н. Лебедева РАН, Самарский филиал, Самара
Influence of porous three-dimensional implants from nitinol on culture of multipotent mesenchymal stromal cells
S.E. Volchkov1, I.V. Shishkovsky12, I.M. Bairikov1
1 Samara State Medical University, Samara
2 P.N. Lebedev Physics Institute of RAS, Samara branch, Samara
Представлены результаты исследования биосовместимости in vitro пористых трехмерных имплантатов из никелида титана (нитинола). Пористые материалы были получены методом послойного селективного лазерного спекания и инкубированы с культурой мультипотентных мезенхимных стромальных клеток (ММСК). С помощью световой и электронной микроскопии были исследованы микроструктуры поверхности полученных имплантатов. Было показано, что полученные материалы не обладают токсическим или иным повреждающим действием, однако снижают пролиферативную активность ММСК и их способность к миграции.
Ключевые слова: трехмерные имплантаты, нитинол, селективное лазерное спекание, мультипотентные мезенхимные стромальные клетки.
В современной хирургической практике, особенно в травматологии и ортопедии, стоматологии и челюстно-лицевой хирургии большое значение имеют различные имплантаты, показанные при целом ряде заболеваний как для временного применения (пластины для накостного остеосинтеза, винты и т.п.), так и для постоянного (дентальные имплантаты, эндопротезы). Одним из основных требований к материалам, пригодным для изготовления подобных изделий, помимо оптимальных механических свойств, являются отсутствие токсичности и биологическая совместимость, которая в случае нерезорбируемых материалов состоит в инертности и оптимальной интеграции с тканями реципиентного ложа — без соединительнотканной капсулы [1]. Ведущим подходом для усиления биосовместимости имплантатов является модификация их поверхности и структуры. Известно, что микроструктурированная поверхность в сравнении с гладкой оказывает более выраженное влияние на морфологические особенности и «поведение» клеток, модулирует их пролиферацию. При этом наблюдается синергетическое влияние структур микронного и субмикронного масштабов [2, 3]. Также намечается тенденция к замене монолитных имплантационных материалов пористыми, позволяющими добиться большей интеграции с тканями реципиентного ложа за счет врастания регенерата в структуру имплантата. В последнее время появились работы по использованию нитерметаллидной фазы
e-mail: [email protected]
The results of in vitro studies about biocompatibility of three-dimensional porous implants made of nickel-titanium (nitinol) are presented in this article. The porous scaffolds were created via layer-by layer selective laser sintering method and incubated with cultures of multipotent mesenchymal stromal cells. The microstructures of implants surface were observed by scanning electron and optical microscopy. It was shown that nitinol implants have neither toxicity nor other damage action on cells, but decrease the proliferative activity and migration ability of MMSC.
Key words: three-dimensional implant, nitinol, selective laser sintering multipotent mesenchymal stromal cells.
никелида титана (нитинол) [2, 4]. Интерес к этому материалу связан с тем, что в нем возможна реализация эффекта памяти формы.
Первые данные о биологических свойствах имплантатов могут быть получены in vitro — при инкубировании с культурами клеток, в частности, с мультипотентными мезенхимальными стромальными клетками (ММСК) [5, 6]. Согласно современным данным, ММСК могут быть выделены из различных источников, прежде всего из красного костного мозга. Однако процедура получения этого материала достаточно травматична и может вызвать ряд нежелательных реакций [7]. Поэтому в качестве альтернативного источника ММСК с успехом используется жировая ткань, а также, как в настоящем исследовании, пуповинная кровь [5, 8]. Инкубирование имплантатов с культурами ММСК позволяет оценить биологические свойства материалов, как то: токсичность, мутагенность, влияние на пролиферативную активность клеток, дифференцировку, способность к миграции, а также пригодность поверхности для клеточной адгезии, что характеризует степень возможной интеграции имплантата in vivo [9]. Именно на оценку биологических свойств пористых трехмерных имплантатов из нитинола и было нацелено наше исследование.
Технология быстрого прототипирования имеет неоспоримый медицинский потенциал за счет возможности изготовления индивидуальных имплантатов
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том VIII, № 1, 2013
52
Оригинальные исследования
с заранее определенной внутренней и(или) внешней формой поверхности. Преимуществом метода селективного лазерного спекания/плавления (СЛС/П), относящегося к данной технологии, является создание готовых к применению, т.е. функциональных имплантов по данным 3D компьютерной томографии и без лишних операций формирования литьевых форм [2—4, 10—14]. Контролирование дизайна внутренней структуры поровых каналов еще на стадии компьютерного моделирования позволяет интенсифицировать прорастание соединительных тканей в пористый матрикс, увеличить площадь соприкосновения (а, следовательно,и механическую прочность) между имплантом и костью. Пористые каналы могут быть насыщены лекарственными препаратами для активации вживления, предотвращая некроз клеток.
Материал и методы
Объект исследования
Процесс быстрого прототипирования методом СЛС 3D биоматрикса подробно описан ранее [2]. Внешний вид пористых матриксов из нитинола моделировался нами средствами CAD и далее синтезирован в Самарском филиале ФИАН на установке для послойного лазерного синтеза (рис.1).
Рис. 1. Матриксы из нитинола: А - с регулярной пористостью; Б - со случайной пористостью
Перед лазерным спеканием порошки нитинола (Полема, Россия) предварительно просушивали в вакуумном шкафу в течение 2 ч при 300°С. Исходная дисперсность всех порошков составляла около 100 мкм, чтобы быть соизмеримой с диаметром пятна лазерного излучения, и контролировалась ситовым анализом. В результате лазерного спекания для формировались трехмерные плоские пористые матриксы размером около 10x10xd мм, где d — толщина монослоя, приблизительно 0,5—1 мм в зависимости от режима лазерного спекания (см. рис. 1). Матриксы имели в зависимости от режима СЛС развитую пористость до 40%, открытую пористость около 30—40%, размер пор при спекании был соизмерим с размером исходной фракции или меньше ее не более, чем в 1,5—2 раза, с плотность 3,5—4 г/см3 (около 6,5 г/см3 у литого нитинола), водопоглощение порядка 7—12 % [2].
Исследование биосовместимости
с культурой ММСК
Исследуемые материалы отмывали стерильным фосфатно-солевым буфером (PBS), затем стерилизовали в автоклаве при 121°С, 20 мин. при давлении 120 кПа. Имплантаты из нитинола (n = 10) инкубировали с культурами ММСК. В качестве контроля использовали культуры ММСК без каких либо дополнительных материалов. ММСК получали из Вартонова студня пуповины новорожденных детей, после подписания матерями информированного согласия. Клетки выделяли методом эксплантов. Культивирование в исследуемых и контрольной группах продолжалось в течение 26 сут. в стандартных условиях: 37°C, 5% CO2 в инкубаторе MCO-20AIC (Sanyo, Япония). Питательную среду аМЕМ (Sigma, США) с добавлением 10% FBS (Gibco, США), 2 мМ l-alanyl-gluthamine (Invitrogen, США) меняли каждые 5 сут., или ранее при изменении индикатора среды. Для определения принадлежности полученных клеток к группе ММСК использовали протокол, согласно рекомендациям международного сообщества клеточной терапии. Иммунофенотипирование проводили по следующим антигенам: CD 90, CD 44, CD 106, CD 45, HLA-ABC, HLA-DR, CD 73, CD 34, CD 144, CD 105, CD 117, CD 62L, CD 133, CD 14 на проточном цитофлюориметре FACS Canto (Becton Dickinson, США). Индукция дифференцировки в остеогенном, хондрогенном и адипогенном направлении проводилась с с помощью специальных сред: NH Osteodiff, NH Chondrodiff, NH Adipodiff (Miltenyi Biotec, Германия), — по инструкции производителя. Оценка дифференцировочного потенциала проводилась по изменению морфологии клеток и подтверждалась цитохимическими реакциями с OilRed O (Sigma, США) для оценки адипогенеза, на щелочную фосфатазу FAST BCIP/NBT (Sigma, США) для оценки остеогенеза, а также иммуноцитохимической реакцией с антителами к аггрекану (Abcam, Англия) для оценки хондрогеннной дифференцировки. Оценка пролиферативной активности проводилась на клеточном анализаторе концентрации и жизнеспособности ViCell XR (Beckman Coulter, США). Скорость пролиферации определяли по формуле: x = [log10(NH) - log10(N1)]/log10(2), где NH -количество клеток при посеве культуры, N1 — количество клеток после экспансии.
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том VIII, № 1, 2013
Оригинальные исследования
53
Для оценки токсичности материала оценивали морфологию клеток с проведением морфометрического анализа, выполняли подсчет скорости удвоения, а также определяли способность клеток к миграции c использованием эксперимента «Time lapse» на микроскопе AxioObserver A1 (Carl Zeiss, Германия), с системой инкубации. Этот эксперимент включал в себя культивирование культуры клеток в течение 4 ч. со скоростью съемки видео 10 кадров в мин. Оценка видео, расчет дистанций движения клеток и морфологии проводились на программном обеспечении Image-Pro PLUS (Media Cybernetics, США) и AxioVision (Carl Zeiss, Германия). Кластерный анализ культур — выделение движущихся объектов (клеток), расчеты траекторий и дистанций перемещения — проводился на программном комплексе ImageJ и Image Pro Plus, деление клеток на группы оценивалось в программе по плотности пикселей на объект.
Результаты и обсуждение
Морфологический анализ
Как отмечалось выше, ранее нами проводилось тестирование синтезированного методом СЛС ни-тинола в сравнении с чистым титаном на культуре дермальных фибробластов 4—18 пассажей, в том числе с добавками гидроксиапатита (ГАП) [4]. В качестве положительного контроля (наряду с интактной группой) был использован литой стоматологический титан марки «Рема». Была показана хорошая биосовместимость нитинола даже без добавок ГАП. При этом с помощью электронной микроскопии было показано, что в отличие от литой поверхности титана, адгезия фибробластов к пористой поверхности проходила более активно.
Нами были получены культуры ММСК, отвечающие утвержденным критериям (иммунофенотип, дифференцировочный потенциал). Исследуемые клетки экспрессировали следующие антигены: CD 90, 44, HLA-ABC, 73,105, что является характерным признаком стромальных клеток. Наблюдалось отсутствие экспрессии следующих антигенов: CD 45,
106, 34, 144, 62L, HLA-DR, 133, 14, что также подтверждает принадлежность к стромальным клеткам. В ходе эксперимента была выявлена слабая положительная экспрессия CD 117 (c-kit), являющегося рецептором для SCF. Позитивная экспрессия этого маркера свидетельствует о «недифференцированности» исследуемых клеток. ММСК имели типичную морфологию в культуре: фибробластоподобную (веретеновидную) форму, одно ядро с несколькими ядрышками (рис. 2). При этом за 10 дней культивирования происходило увеличение плотности культуры с 35% до 100%.
Материалы из нитинола, помещенные в культуральную посуду уже на этапе адгезии первичной популяции, несколько уменьшали скорость экспансии ММСК: у края NiTi матрикса увеличение количества клеток наблюдалось в меньшей степени, чем в контроле. В течение 10 сут. в присутствии матрикса из нитинола плотность культуры увеличивалась значительно медленнее в сравнении с контрольной группой и не равномерно среди экспериментов данной группы (от 60 до 95%). На десятый день максимальная плотность ММСК (95, 85 и 60%) была достигнута только в трех из 10 случаев в экспериментальной группе. В дополнение наблюдались небольшие колонии в непосредственной близости от материала, с морфологией «старых» клеток (рис. 3).
Первые клетки, адгезировавшиеся к поверхности материала, были обнаружены лишь на 13 сут. (рис. 4).
Таким образом, в контроле образование клеточного монослоя произошло за 16 сут., скорость пролиферации составила 0,03 уд/ч или 0,694 уд/сут., а общее количество удвоений за период культивирования составило 11,1 (рис. 5). Морфология клеток оставалась нормальной на протяжении всего культивирования. Естественное появление «стареющих» клеток в культуре составило не более 20% от всей популяции. Процессы старения характеризовались увеличением объема ядра и цитоплазмы, увеличением площадей клеток, а также изменением их формы на кубическую.
Рис. 2. Первичные культуры ММСК: А - 2 сут.; Б - 10 сут. культивирования
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том VIII, № 1, 2013
54
Оригинальные исследования
Рис. 3. Культуры ММСК, инкубированные с матриксами из нитинола: А - 2 сут., Б - 10 сут. культивирования. 1 - матрикс из нитинола
Рис. 4. ММСК на поверхности матриксов из нитинола: А - 13 сут.; Б, В - 25 сут. инкубирования.
Стрелками указаны адгезировавшиеся клетки;
А - световая микроскопия;
Б-В - сканирующая электронная микроскопия
В группе NiTi скорость пролиферации составила 0,02 уд/ч или 0,532 уд/сут., а общее количество удвоений за период культивирования — 10,63. В результате исследования в серии «нитинол» был выявлен незначительный эффект угнетения пролиферативной активности клеточной культуры, что связано, возможно, с повышенной пористостью материала и его подвижностью в культуральной посуде, приводящей к повреждению монослоя.
Сортировка клеток по «площади», по «возрасту» и способности к миграции
В зависимости от интенсивности роста клеточной популяции по морфологическим признакам был проведен анализ и отдельная выборка клеток на разных этапах развития, характеризующая процесс старения (рис. 5А). Все клетки были условно разделены на три категории: молодые, взрослые и старые (табл.).
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том VIII, № 1, 2013
Оригинальные исследования
55
п^н|я^
А
Рис. 5. Культуры ММСК, маркированные в зависимости от возрастных изменений:
А - морфометрический ряд клеток от самой молодой (справа и снизу) до «старой» (слева и сверху), цифрами обозначено количество в культуре; Б - контрольная группа; В - экспериментальная группа (клетки вблизи матрикса из нитинола). Красный цвет - молодые клетки, синий - взрослые, зеленый - старые. Морфометрический анализ
Соотношение морфологических классов клеток
Категории клеток Абсолютное количество, % Средняя площадь
контроль нитинол контроль нитинол
Молодые клетки 1797/60,57 1154/ 65,27 201,5±60,8 174,0±53,8
Взрослые клетки 1169/ 39,41 547/ 30,94 543,4±210,6 426,6±111,1
Старые клетки 1/ 0,034 67/ 3,79 2708,5±0,1 1143,7±482,7
Морфологическая обработка фотографий культур ММСК проводилась в каждой группе и серии экспериментов на 3, 15 и 25 сут. культивирования (рис. 5). Первая категория ММСК — молодые, активно делящиеся и мигрирующие по поверхности культуральной посуды клетки, веретеновидной формы, площадью не более 5000 мкм2. Вторая категория — «взрослые» клетки, треугольной или неправильной формы, площадью от 5000 до 16 000 мкм2, способные к пролиферации и миграции. Третья категория — «гигантские клетки», неправильной формы, с заостренными краями, очень большой площадью поверхности: от 16 000 и до 40 000 мкм2, в редких случаях и выше; не участвуют в делении, практически не мигрируют.
На рис. 5 видно, что если в контроле преобладают «молодые» активно пролиферирующие клетки, то вблизи 3D матрикса большое количество «старых» — гигантских и малоподвижных клеток. Поэтому общая скорость удвоения культуры при наличии матрикса значительно ниже, чем в контроле.
Оценка способности к миграции (механотаксис) проводилась методом сравнения траекторий
движения клеток между сериями «Контроль» и «Нитинол». В контрольной группе за время наблюдения клетки преодолевали дистанцию (в среднем) 350,4±187,0 мкм, а клетки из экспериментальной в схожих условиях «проходили» около 42,5±29,9 мкм.
По нашим данным, важна не просто пористость матрикса для оптимального совмещения с культурами клеток, а размеры пор, которые должны быть «сопоставимы» с размерами клеток. Клетки выстраиваются перпендикулярно матриксу и плотность их наиболее высока лишь у отдельных пор, что отмечалось нами ранее [4]. Возможно, что чрезмерная субмикронная пористость также вредна для ММСК, имеющих размеры 50—100 мкм, как и ее полное отсутствие.
Заключение
Таким образом не было выявлено токсических эффектов матриксов из нитинола. Однако исследуемый материал оказывал несколько негативное влияние на пролиферативную и миграционную
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том VIII, № 1, 2013
56
Оригинальные исследования
активность ММСК. Заселение клетками матрикса начиналось только с 13 сут. культивирования.
Другим принципиальным результатом является следующий обнаруженный нами факт, который еще требует объяснений и дальнейших исследований. Если в контроле (т.е. без матрикса) процент молодых, малых по площади, но активно делящихся ММСК был очень высок (более 50—60%), то при инкубировании с матриксом из нитинола ММСК вырастали до больших размеров — быстро старели (или
ЛИТЕРАТУРА:
Binyamin G., Shafi B.M., Mery C.M. Biomaterials: a primer for surgeons. Semin. Pediatr. Surg. 2006; 15(4): 276—83.
Шишковский И.В. Лазерный синтез функциональных мезо-структур и объемных изделий. М.: Физматлит; 2009.
Zinger O., Anselme K., Denzer A. et al. Time-dependent morphology and adhesion of osteoblastic cells on titanium model surfaces featuring scale-resolved topography. Biomaterials 2004; 25(14): 2695-711.
Шишковский И.В., Морозов Ю.Г., Фокеев С.В. и др. Лазерный синтез и сравнительное тестирование трехмерного пористого матрикса из титана и никелида титана как репозитария для стволовых клеток. Порошковая металлургия. 2011; 50(9/10): 42-57.
Волчков С.Е., Тюмина О.В., Тороповский А.Н. и др. Сравнительная характеристика мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток из разных источников. Клеточная трансплантология и тканевая инженерия 2009; (3): 8-9.
Salamon A., Toldy E. Use of mesenchymal stem cells from adult bone marrow for injured tissue repair. Orv. Hetil. 2009; 150(27): 1259-65.
Bain B.J. Bone marrow aspiration. J. Clin. Pathol. 2001; 54: 657-663.
«скатывались» в дифференцировку), а активность их деления резко снижалась.
Благодарности
Исследования проводились при поддержке РФФИ (проекты № 13-08-97001р_Поволжье_а и 13-08-12120-офи_м) и гранта Президиума РАН 2011 гг. по программе «Фундаментальные науки — медицине».
Kern S., Eichler H., Stoeve J. et al. Comparative analysis of mesenchymal stem cells from bone marrow, umbilical cord blood, or adipose tissue. Stem Cells 2006; 24: 1294-301.
Nirmalanandhan V.S., Sittampalam G.S. Stem cells in drug discovery, tissue engineering, and regenerative medicine: emerging opportunities and challenges. J. Biomol. Screen. 2009; 14(7): 755-68
Leong K.F., Phua K.S., Chua C.K. et al. Fabrication of porous polymeric matrix drug delivery devices using the selective laser sintering technique. Proc. Instn. Mech. Engrs. Part H. 2001; 215: 191-201.
Kanczler J.M., Mirmalek-Sani S., Hanley N.A. et al. Biocompatibility and osteogenic potential of human fetal femur-derived cells on surface selective laser sintered scaffolds. Acta Biomaterialia 2009; 5: 2063-71.
Engel B., Bourell D.L. Titanium alloy powder preparation for SLS. Rapid Prototyping 2000; 6: 97-106.
Das U.S., Wohlert M., Beaman J.J. et al. Processing of titanium net shapes by SLS/HIP. Mater. Des. 1999; 20: 115-21.
Williams J.M., Adewunmi A.I., Schek R.M. et al. Bone tissue engineering using polycaprolactone scaffolds fabricated via selective laser sintering. Biomaterials 2005; 26: 4817-27.
Поступила 05.02.2013
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том VIII, № 1, 2013
