CC BY
44
оригинальные статьи полупромышленный метод синтеза... 1 B5
А.Н. Бадаев1, В.Н. Осипов2, К.А. Охманович1, В.Е. Фёдоров1
ПОЛУПРОМЫШЛЕННЫЙ МЕТОД СИНТЕЗА
7-8 ФРАГМЕНТА ОКТРЕОТИДА И ЕГО ПРОИЗВОДНЫХ
1ЗАО «Фарм-Синтез», Москва 2ФГБУ «РОНЦим. Н.НБлохина», Москва
Контактная информация
Осипов Василий Николаевич, старший научный сотрудник лаборатории химического синтеза НИИ экспериментальной диагностики и терапии опухолей адрес: 115478, Москва, Каширское шоссе, 24; тел. +7(495)673-79-76 e-mail: ovn@front.ru
Статья поступила 27.02.2014, принята к печати 04.04.2014.
Резюме
Разработан новый улучшенный жидкофазный метод синтеза 7-8 фрагмента октреотида и его производных. Предложенный способ позволяет получать целевой дипептид в полупромышленном масштабе с содержанием основного вещества более 95 % и предусматривает регенерацию используемого в процессе синтеза HOBt.
Ключевые слова: октреотид, полупромышленный синтез, HCys(Acm)ThrOl, пептиды.
A.N. Balaev1, V.N. Osipov2, V.E. Fedorov1, K.A. Okhmanovich1 AN IMPROVED LARGE SCALE SYNTHESIS
OF THE 7-8 FRAGMENT OF OCTREOTIDE AND ITS DERIVATIVES
1CJSC «PHARM-SINTEZ», Moscow
2FSBI «N.N. Blokhin RCRC», Moscow
Abstract
A new improved liquid-phase method of preparation of the 7-8 fragment of octreotide and its derivatives was developed. This method allows to prepare target dipeptide with a purity of more than 95 %, is easily scalable and provides regeneration of the HOBt .
Key words: octreotide, large scale synthesis, HCys(Acm)ThrOl, peptides.
Введение
Октреотид - синтетический аналог природного гормона соматостатина, обладающий большей избирательностью и продолжительностью действия [5]. В настоящее время Октреотид широко используется в химиотерапии при наличии опухолей, активно экспрессирующих рецепторы к соматостатину (в частности - эндокринные опухоли ЖКТ и поджелудочной железы).
Дипептид HCys(Acm)ThrOl (или его гидрохлорид 1), являющийся 7-8 фрагментом Октреотида, является одним из ключевых пептидных блоков используемых при синтезе Октреотида [1]:
OH OH
OO
1
Кроме того, дипептид 1 используют и при синтезе радиоизотопных ^роизводных Октреотида, таких как Октреотид 1п [2] и Октреотид Тс [3], применяемых для радионуклидной диагностики опухолей и установления их рецепторного статуса.
Целью настоящей работы является разработка нового жидкофазного способа получения дипептида 1, пригодного для полупромышленного производства, оптимизация использования растворителей на отдельных стадиях процесса и изучение возможности регенерации конденсирующего агента НОВ!
№ 2/том 13/2014
Материалы и методы
Аналитическую ВЭЖХ проводили на хроматографе фирмы Shimadzu. Колонка: Grom-Sil 12J ODS-4HE, 5pm, 250-4,6 mm. Условия: A - вода + фосфатный буфер pH 3, B - ацетонитрил, градиент 20 % B (0 мин) 60 % B (10 мин) 70 % B (15 мин) 70 % B (30 мин),. ТСХ проводили на пластинах Merck TLC Silica gel 60 F254, проявление нингидрином. Спектры ЯМР получены на приборе Bruker AM-360 (рабочая частота 360.13 МГц). В качестве растворителя применяли CDCl3, DMSO-d6, D2O. Спектры ЯМР 13C получены на приборе Bruker AM-360 (рабочая частота 90.56 МГц). В качестве растворителя применяли CDCl3, D2O. Угол удельного вращения измеряли на автоматическом поляриметре "OTAGO" AP-300. Спектры ESI-MS регестрирова-ли на приборе "Agilent LC/MS 1200" при ионизации пробы электрораспылением в режиме регистрации положительных ионов. Пробы готовили в системе ацетонитрил/вода 1/1, концентрация 2 мг/мл. Условия анализа: поток 1 мл/мин, давление на нибулай-зере 20 psi, температура 360°C, скорость потока осушающего газа 9 л/мин, напряжение 3500 В, целевая масса от 100 до 2000. Температуру плавления определяли на приборе марки "Melting Point M-565" (BUCHI).
HCys(Acm)OH (3)
Растворяют 3363 г (21.34 моль) гидрохлорида цистеина (2) в 5 л воды. Охлаждают полученный раствор до 0°C, доводят 12N соляной кислотой до pH=1, при этой температуре и перемешивании приливают небольшими порциями 2580 г (28.96 моль)
РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ
оригинальные статьи
полупромышленный метод синтеза ...
К-(гидроксиметил)ацетамида. Перемешивают реакционную массу 66-70 ч при комнатной температуре. Поддерживая температуру 25-30°С доводят до рН=7 50% раствором гидроксида натрия (~ 840 г сухого КаОН). Оставляют реакционную массу на 48 ч при 5°С. Выпавший продукт отфильтровывают, промывают на фильтре 3 л ледяной воды и сушат в вакууме до постоянного веса (40°С, 10 мм рт.ст.). Получают 2845 г (71.1%) бесцветного крупнокристаллического 3. Содержание основного вещества 96.9% (ВЭЖХ). [а]в =-44.41 (4% р-р, вода). ТСХ: ВиОН/АсОН/Н2О 4/2.5/2. Щ2)=0.51, Щ3)=0.44. Т.пл. 184-186°С. Спектр ЯМР 1Н (Б2О, 5, м.д.): 2.14 (8, 3Н, СОСНУ). 3.21-3.27 (т, 2Н, Р-Н), 4.02-4.09 (т, 1Н, а-Н), 4.49-4.54 (т, 2Н, ЫНСН:) )• Е8М8, т/г (1%): 193.0 [М+Н]+ (100), 385.1 [2М+Н]+ (54.9), 407.1 [2М+Щ+ (6.2).
BocCys(Acm)OH (4)
Суспендируют 1561 г (8.12 моль) 3 в 5.4 л воды. При перемешивании и температуре 23-25°С приливают раствор гидроксида натрия, приготовленный растворением 357.4 г (8.94 моль) гидроксида натрия в воде (до 2.23 л). рН полученного раствора 10.0 (точность 0.1). После полного растворения добавляют 1949.8 г (8.93 моль) расплавленного трет-бутилпирокарбоната. Перемешивают реакционную массу 16 ч при 23-25°С. Промывают реакционную массу 3 л этилацетата и нейтрализуют 50 %-ной серной кислотой до рН 2-3 (~ 0.9 л). Водный слой и выпавшее масло промывают 2.5 л смеси петролейный эфир/диэтиловый эфир 1/1. Экстрагируют 2 раза по 3 л этилацетата. Водный слой насыщают хлористым натрием и ещё экстрагируют 2 раза по 1 л этилацетата. Объединённые этилацетат-ные фракции сушат сульфатом натрия, упаривают на роторном испарителе в вакууме (45 °С, 20 мм рт.ст.), к остатку добавляют 1 л этилацетата и снова упаривают в вакууме. Полученное масло при охлаждении кристаллизуется, его растирают и сушат в вакууме до постоянного веса (40 °С, 10 мм рт.ст.). Получают 2240 г (94.4%) белых кристаллов 4. Содержание основного вещества 98.7% (ВЭЖХ). [а]в25=-35.38 (1% р-р, вода). ТСХ: СНС13/МеОН/АсОН 15/4/1. Щ3)=0.08, Щ4)=0.63. Т.пл. 108-110°С. Спектр ЯМР 1Н (Б2О, 5, м.д.): 1.28 (8, 9Н, 3СНз), 2.16 (8, 3Н, СОСНз), 3.25-3.32 (т, 2Н, Р-Н), 4.11-4.17 (т, 1Н, а-Н), 4.50-4.56 (т, 2Н, ЫНС'Н^). Е8М8 (режим регистрации отрицательных ионов), т/г (1%): 291.1 [М-Н]- (100), 405.0 [М+ТБА-Н]- (61.7), 583.0 [2М-Н]- (13.0).
BocCys(Acm)-ThrOMe (6)
Последовательно растворяют в 1.5 л хлористого метилена 517 г (1.77 моль) 4, 180 г (1.78 моль) К-метилморфолина, 300 г (1.96 моль) моногидрата К-гидроксибензотриазола и 300 г (1.77 моль) 5 при комнатной температуре. После полного растворения охлаждают до 0°С и прикапывают раствор 404 г (1.96 моль) дициклогексилкарбодиимида в 500 мл хлористого метилена в течении 30-45 мин. Нагревают до комнатной температуры и перемешивают реакционную массу 12-15 ч. Отфильтровывают выпавшую дициклогексилмочевину и промывают её на фильтре 3 раза по 100 мл хлористого метилена и 2 раза по 300 мл 5 %-ного водного раствора карбоната натрия. К объединённым жидким фазам добавляют 1.9 л воды. При перемешивании добавляют 10 %-ный раствор карбоната натрия до рН=9. Отделяют слой хлористого метилена и промывают его 2.5 л 3% раствора карбоната натрия.
Объединённые водные слои передают на стадию регенерации N-гидроксибензотриазола. Органический слой последовательно промывают 2 л воды, 1 л 5 %-ного раствора лимонной кислоты и 1 л воды. Сушат сульфатом натрия, упаривают в вакууме досуха (30°C, 30 мм рт.ст.), маслообразный остаток промывают 2 раза по 300 мл гексана и выдерживают в вакууме до постоянного веса (45°C, 5 мм рт.ст.). Получают 527 г (73.1%) аморфного 6. Содержание основного вещества 92.8% (ВЭЖХ). ТСХ: CHCl3/MeOH 9/1. Rf(5)=0.39, Rf(4)=0.87, Rf(6)=0.61; ESMS, m/z (I%): 308.4 [M-Boc+H]+ (28.9), 408.2+[M+H]+ (68.1) , 430.2 [M+Na]+ (9.8) ,
446.0 [M+K]+ (100). Аналитический образец 6 (чистота 97.5%) получают хроматографической очисткой на колонке с силикагелем (элюент хлороформ/метиловый спирт 5/1). [a]D29= -23.71 (5% р-р, метиловый спирт). Спектр ЯМР :H (CDCl3, 5, м.д.): 1.23 (d, 3H, CH3), 1.43 (s, 9H, 3*CH3), 2.01 (s, 3H, COCH3), 2.73-2.81 (m, 1H, SCH), 2.97-3.04 (m, 1H, SCH), 3.48 (br s, 1H, OH), 3.72 (s, 3H, COOCH3), 4.18-4.25 (m, 1H, CHCOOMe), 4.29-4.33 (m, 1H, CHOH), 4.46-4.56 (m, 2H, SCH2NH), 4.65-4.58 (m, 1H, CH), 5.68 (d, 1H, NHCOOBu-t), 7.20 (br s, 1H, AcNH), 7.45 (d, 1H, CONH). Спектр ЯМР 13C (CDCl3, 5, м.д.): 171.41, 170.95 (2C), 155.78, 80.22, 67.66, 57.95, 53.21, 52.35, 40.74, 34.12, 28.71 (3C), 22.98, 20.05.
Регенерация N-гидроксибензотриазола.
Объединённые водные фазы промывают 500 мл серного эфира, подкисляют концентрированной серной кислотой до pH=3 и отфильтровывают кристаллы N-гидроксибензотриазола. Суспендируют полученные кристаллы в 500 мл воды и повторно фильтруют. Промывают их на фильтре 200 мл гексана и сушат 5 ч в вакууме (30-40 C°,5 мм рт.ст.) до постоянного веса. Получают 247 г белого мелкокристаллического N-гидроксибензотриазола. Ко-эфициент регенерации 82,3 %. Полученный N-гидроксибензотриазол используют на стадии получения 6 без дополнительной очистки.
BocCys(Acm)-ThrOl (7)
Растворяют 968 г (2.38 моль) 6 в 3.5 л 96 %-ного этилового спирта. Охлаждают полученный раствор до 0 °C и небольшими порциями при энергичном перемешивании в течении 2 ч присыпают 100 г (2.64 моль) боргидрида натрия так чтобы температура не превышала 10 °C. После окончания прибавления перемешивают 1 час при комнатной температуре. К реакционной массе при перемешивании прикапывают 50 %-ную уксусную кислоту до pH 6-7 (~ 1 л). Отгоняют этиловый спирт в вакууме на роторном испарителе (не выше 40°C). Фильтруют выпавшую твёрдую фазу. Водную фазу промывают 1 л смеси диэтиловый эфир/гексан 1/1 и экстрагируют 2 раза хлористым метиленом 3+1 л. Экстракты хлористого метилена сушат сульфатом натрия и отгоняют на роторном испарителе в вакууме (40-50 °C, 20 мм рт.ст.). Остаток последовательно промывают: 2 раза по 0.5 л смеси этилаце-тат/гексан 1/1 и 2 раза 0.3 л гексана. Сушат в вакууме масляного насоса до постоянного веса. Получают 685 г (75.8%) карамелеобразного 7. Содержание основного вещества 94.6% (ВЭЖХ). ТСХ: CHCl3/MeOH 5/1. Rf(6)=0.70, Rf(7)=0.42; ESMS, m/z (I%): 280.4 [M-Boc+H]+ (15.7), 380.2 [M+H]+ (100) ,
402.1 [M+Na]+ (7.9) , 418.1 [M+K]+ (89.7). Аналитический образец 7 (чистота 98.3%) получают хроматографической очисткой на колонке с силикагелем
№ 2/том 13/2014
РОССИИСКИИ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИИ ЖУРНАЛ
оригинальные статьи полупромышленный метод синтеза... 1 87
(элюент этилацетат/метиловый спирт 5/1). [а]в20= -21.53 (3% р-р, метиловый спирт). Спектр ЯМР 1Н (СБС1з, 8, м.д.): 1.20 (а, 3Н, СНз), 145 (s, 9Н, 3*СНз), 2.03 (s, 3Н, СОСНз), 2.83-2.99 (т, 2Н, $СН2), 3.53 (Ьг s, 1Н, ОН), 3.68 (Ьг s, 1Н, ОН), 3.743.84 (т, 2Н, СН2ОН+СНОН), 4.09-4.17 (т, 1Н, СНСН2ОН), 4.25-4.32 (т, 1Н, 8СН:ЫН). 4.39-4.46 (т, 1Н, СНСОЫН), 4.51-4.59 (т, 1Н, 8СН:ЫН), 5.72 (а, 1Н, ЫНСООВи-!), 7.07 (Ьг s, 1Н, АсЫН), 7.15 (а, 1Н, СОЫН). Спектр ЯМР 13С (СБС13, §, м.д.): 171.65, 171.43, 155.82, 80.25, 67.62, 63.10, 55.76, 54.23, 40.98, 33.71, 28.17 (3С), 22.88, 20.04.
НСу$(Лсш)-Ткг01 гидрохлорид (1)
В колбе с внешним охлаждением и механической мешалкой при перемешивании растворяют 685 г (1.8 моль) 7 в 1.8 л диоксана. После полного растворения охлаждают раствор до 10°С и приливают 1 л 24 %-ного раствора хлороводорода в ди-оксане. Через 30 мин отогревают реакционную массу до комнатной температуры и перемешивают в течении 2 ч. Выпавший порошок растирают и фильтруют на фильтре Шотта, после чего промывают последовательно 3 раза по 900 мл диоксана и 3 раза по 500 мл гексана. Полученное вещество растворяют в 2 л метилового спирта и высаживают
Результаты
Разработанная схема синтеза 1 включает 5 стадий:
3 л серного эфира. Снова фильтруют и промывают на фильтре 500 мл серного эфира.
Отфильтрованный продукт растворяют при нагревании (50 °C) в 900 мл 95 %-ного этилового спирта и оставляют кристаллизоваться при 5°C в течение 10-12 ч. Фильтруют продукт, промывают на фильтре 2 раза по 200 мл изопропилового спирта и сушат сначала на воздухе, а затем в вакууме (1015 мм рт. ст.) при 40 °C до постоянного веса.
Получают 376 г (66.1%) белого мелкокристаллического порошка 1.
Содержание основного вещества 95.1% (ВЭЖХ). [а]в25=+23.13 (4% р-р, метанол); ESMS, m/z (I%): 281.0 [M+H]+ (69.7), 318.3 [M+K]+ (9.8), 559.4 [2M+H]+ (100), 581.2 [2M+Na]+ (7.3). Спектр ЯМР 1H (d6-DMSO, 5, м.д.): 1.04 (d, 3H, СНз), 1.75 (s, 3H, CH3), 2.87-2.93 (m, 1H, SCH), 3.04-3.10 (m, 1H, SCH), 3.31-3.36 (m, 1H, SCH), 3.42-3.48 (m, 1H, SCH), 3.60-3.66 (m, 1H, CH), 3.84-3.90 (m, 1H, CH), 4.09-4.16 (bs, 1H, CH), 4.21-4.34 (m, 2H, CH2OH), 4.52 (s, 2H, 2OH), 8.25 (d, 1H, CHNH), 8.37 (s, 3H, NH3), 8.88 (t, 1H, CHNH). ESMS, m/z (I%): 280.1 [M+H]+ (100), 302.1 [M+Na]+ (20.5), 559.3 [2M+H]+ (12.6), 581.2 [2M+Na]+ (9.0). Спектр ЯМР 13C (D2O, 5, м.д.): 173.82, 167.89, 65.59, 60.52, 56.36, 51.93, 40.02, 30.81, 21.57, 18.54.
HCysOH 2
AcNHCH2OH
HCl, H2O
HCys(Acm)OH 3
Boc2O
NaOH, H2O
BocCys(Acm)OH 4
HThrOMe HCl 5
HCl, диоксан
1 - BocCys(Acm)ThrOl
7
NaBH4, EtOH
NMM, HOBt, DCC, CH2Cl2
BocCys(Acm)ThrOMe 6
Стандартная процедура постановки ацетамидоме-тильной защиты на цистеин (2) предполагает конденсацию Ы-(гидроксиметил)ацетамида и 2 в триф-торуксусной кислоте в течении 2 ч [4]. С точки зрения полупромышленного производства использование трифторуксусной кислоты не является рациональным из-за её токсичности и относительно высокой стоимости. После подбора условий проведения процесса оказалось, что получение HCys(Acm)OH (3) с выходом 71,1 % можно проводить в растворе соляной кислоты с рН=1. Последующее введение Вос-группы в соединение 3 в водно-щелочном растворе (рН=10) даёт N,8-защищённый цистеин (4) с выходом 94,4 %. В случае использования в качестве растворителя диоксана выход 4 составляет 96 % [7]. Таким образом, замена диоксана водой лишь незначительно сказывается на выходе 4, но позволяет исключить пожароопасный растворитель.
Конденсация 4 и гидрохлорида метилового эфира треонина (5) в присутствии Ы-гидрокси-
№ 2/том 13/2014
бензотриазола (НОВ!) и дициклогексилкарбодии-мида (БСС) в хлористом метилене приводит к за-щищённому дипептиду (6) с выходом 73,1 %. Для регенерации используемого НОВ! реакционную массу до выделения 6 промывают 10% раствором карбоната натрия. Водный слой отделяют и после его подкисления до рН=3 выпадает НОВ!, его промывают водой, сушат и повторно используют на этой стадии. Коэффициент регенерации НОВ! составляет 82,3 %.
Восстановление 6 проводят в этиловом спирте при 0 °С с использованием боргидрида натрия. Последующее удаление Вос-группы в соединении 7 диоксановым раствором хлороводорода даёт целевой продукт 1.
Дополнительная кристаллизация из этилового спирта позволяет получать 1 с чистой более 95 %. Снятие Вос-группы выполненное с использованием трифторуксусной кислоты в хлористом метилене [6] даёт менее чистый продукт и более трудоёмко.
РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ
ф
оригинальные статьи
полупромышленный метод синтеза ...
Выводы
В результате проделанной работы разработан новый улучшенный метод синтеза 7-8 фрагмента Октреотида. Предложенный способ позволяет
получать целевой дипептид с чистотой >95% в полупромышленном масштабе, является более экономичным и безопасным и предусматривает регенерацию используемого в процессе синтеза НОВ!
Литература
1. Балаев А.Н., Осипов В.Н., Охманович К.А. и др. Новый жидкофазный метод синтеза октреотида. // Хим. фарм. журн. - 2013. - Т. 47, № 7. - С. 38-40.
2. Chen F., Li F., Du Y. et al. Preparation and experimental study of 111In-pentetreotide. // Zhonghua Heyixue Zazhi. - 1999. - 19(3). - P. 149-51.
3. Guggenberg E., Mikolajczak R., Janota B. et al. Radiopharmaceutical development of a freeze-dried kit formulation for the preparation of [99mTc-EDDA-HYNIC-DPhe1,Tyr3]-Octreotide, a Somatostatin analog for tumor diagnosis // J. Pharm. Sci. - 2004. - 93(10). - P. 2497-506.
4. Kemp D.S., Fotouhi N., Boyd J.G. et al. Practical preparation and deblocking conditions for N-a-(2-(p-biphenylyl)-2-propyloxycarbonyl)-amino acid (Na-Bpoc-Xxx-OH) derivatives // Int. J. Pept. Prot. Res. -1988. - 31(4). - P. 359-72.
5. Kleemann A., Engel J., Kutscher B., Reichert D. Pharmaceutical Substances: Synthesis, Patents, Applications (5th ed.). - Germany. Thieme. - 2009. - P. 994-6.
6. Syngh K.K.L., Mukarram S.M.J., Ashok D.A. et al. Processes for the preparation of octreotide. - PCT Int. Appl. (2007), WO 2007110765.
7. Taylor U.F. Synthesis of a pentapeptide sequence related to both the basic pancreatic trypsin inhibitor (BPTI) and the enkephalins. - Univ. Houston., Dissertation - 1979. - P. 122.
№ 2/tom 13/2014
РОССИИСКИИ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИИ ЖУРНАЛ
