CC BY
64
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ СИНТЕЗ И ИЗУЧЕНИЕ ЦИТОТОКСИЧЕСКОЙ... 47
УДК 577.175.322:616-006-092.4
А.Н. Балаев1, В.Н. Осипов2, В.Е. Фёдоров1, М.А. Барышникова2, Л.И. Смирнова2,
А.П. Смирнова2, Л.П. Сушинина2, С.В. Устинкина
СИНТЕЗ И ИЗУЧЕНИЕ ЦИТОТОКСИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ
АНАЛОГОВ ГИПОТАЛАМИЧЕСКОГО ГОРМОНА СОМАТОСТАТИНА
1ЗАО «Фарм-Синтез», Москва
2ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина» РАМН, Москва
Контактная информация:
Осипов Василий Николаевич, старший научный сотрудник лаборатории химического синтеза НИИ экспериментальной диагностики и терапии опухолей адрес: 115478, Москва, Каширское ш., 24; тел. +7(916)412-61-43 e-mail: ovn@front.ru
Статья поступила 30.09.2012, принята к печати 31.10.2012.
Резюме
Синтезированы аналоги соматостатина и изучена их цитотоксическая активность в сравнении с сандо-статином и октреотидом на клеточных линиях, экспрессирующих рецепторы соматостатина: карциномы простаты человека LNCap, LNCap-LN3, LNCap-clon FGC и нейробластома человека SH-SY5Y.
Ключевые слова: аналоги соматостатина, сандостатин, октреотид, цитотоксическая активность.
A.N. Balaev1, V.N. Osipov2, V.E. Fedorov1, M.A. BaryshnikovA2,
L.I. Smirnova2, A.P. Smirnova2, L.P. Sushinina2, S.V. Ustinkina SYNTHESIS AND CYTOTOXIC ACTIVITY
FOR HYPOTHALAMIC HORMONE SOMATOSTATINE ANALOGS
1CJSC «PHARM-SINTEZ», MOSCOW
2FSBI «N.N. Blokhin RG.RC» RAMS, Moscow
Abstract
Some somatostatine analogs were synthesized and tested for cytotoxic activity in comparison with sandostatine and octreotide in cell cultures, expressing somatostatine receptors: human prostate carcinoma cell line LNCap, LNCap-LN3, LNCap-clon FGC and human neuroblastoma cell line SH-SY5Y.
Key words: somatostatine analogs, sandostatine, octreotide, cytotoxic activity.
Введение
В свете современных представлений о значении гормонов в развитии гормонозависимых опухолей повышенный интерес вызывает поиск принципиально новых противоопухолевых веществ среди пептидных гормонов гипоталамуса. Особое внимание привлекает гипоталамический гормон соматостатин, который угнетает выделение гормона роста, пролактина, инсулина, глюкагона, гормонов поджелудочной железы и желудочнокишечного тракта, стимулирующих пролиферативные процессы в клетке [6]. Механизм ингибирования секреторных и пролиферативных процессов соматостатина и его аналогов реализуется через специфические рецепторы, которые широко представлены в клетках тканей-мишеней: в ЦНС (гипоталамус, гипофиз, спинной мозг), желудочно-кишечном тракте (преимущественно в поджелудочной железе, желудке, верхних отделах тонкой кишки) и МЛР [3; 4; 8].
Актуальность разработки определяется тем, что число больных с гормонозависимыми опухолями постоянно растет, а эффективность существующих препаратов при лечении эндокринных опухолей составляет всего от 15 до 20%. Поэтому необходим поиск принципиально новых противоопухолевых соединений. В работе приведены данные по синтезу и изучению с помощью МТТ-теста на клеточных линиях, экспрессирующих рецепторы со-матостатина, 4 аналогов соматостатина (ПГ-7, ПГ -
46-М, ПГ-46-Д, ПГ-114) в сравнении с октреотидом и сандостатином.
МТТ-тест, предложенный Т. Мосманном [5], основан на восстановлении желтой соли тетразолия (3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилте1разолия бромид, МТТ) митохондриальными и цитоплазматическими дегидрогеназами живых метаболически-актив-ных клеток с образованием голубых кристаллов фор-мазана. Количество полученного в результате этой реакции формазана зависит от числа клеток и их жизнеспособности и определяется фотометрически. Цито-токсический эффект характеризует ИК50 - концентрация вещества, вызывающая гибель 50 % клеток.
Материалы и методы
Октреотид (5) чистотой 99,5%+ предоставлен ЗАО «Фарм-Синтез» (Москва).
Сандостатин (6) чистотой 98%+ фирмы Novartis Pharmaceuticals (Швейцария) использовали без дополнительный очистки.
Аналитическую ВЭЖХ проводили на хроматографе фирмы Shimadzu. Колонка: Grom-Sil 12J ODS-4HE, 5дт, 250^4,6 mm. Условия: градиент 20%B (0 мин) 60%B (10 мин) 70%B (15 мин) 70%B (30 мин). A -фосфатный буфер pH 3 (20,4 г KH2PO4 растворяли в 3 л дистиллированной воды и доводили pH до 3 добавлением концентрированной фосфорной кислоты), B - ацетонитрил.
Спектры ESI-MS регистрировали на приборе Agilent LC/MS 1200 при ионизации пробы электрораспылением в режиме регистрации положительных ионов. Пробы готовили в системе ацетонитрил/вода 1/1, концентрация 2 мг/мл. Условия анализа: поток 1 мл/мин, давление на нибулайзере 20 psi, температура 360 °С, скорость потока осушающего газа 9 л/мин, напряжение 3500 В, целевая масса от 100 до 2000.
Тонкослойная хроматография проводилась на пластинках с алюминиевой подложкой Merk Silica gel 60 F254, проявление раствором нингидрина.
Удельное вращение синтезированных аналогов соматостатина измеряли на приборе «Unipol L».
Исследование in vitro проводили на клеточных линиях, экспрессирующих рецепторы сомато-статина: карциномы простаты человека LNCap, LNCap-LN3, LNCap-clon FGC и нейробластома человека SH-SY5Y.
Клеточные линии культивировали в среде RPMI-1640, содержащей 10 % ТЭС, 10мМ HEPES (Sigma, США), 2мМ L-глутамина (Sigma, США), 40 нг/мл гентамицина (ICN, США), 0,1% 1000х раствора аминокислот и 0,1% 1000х раствора витаминов (ПанЭко, Россия), при 37 °С в атмосфере 5% СО2. Клетки поддерживали в логарифмической фазе роста постоянным пересевом культуры через 3-4 дня. Для открепления клеток с пластика использовали раствор Версена.
Клетки отмывались чистой бессывороточной средой RPMI-1640 и пересаживались в 96-лу-ночные плоскодонные планшеты по 4*103 клеток в 180 мкл полной среды RPMI-1640 на лунку. Через сутки в лунки с клетками добавляли по 20 мкл водного раствора ПГ-46-М, ПГ-46-Д, ПГ-114, октрео-тид, сандостатин в различных концентрациях. Для ПГ-7 клетки пересаживали в 96-луночные планшеты в 198 мкл среды, а сам препарат добавляли через сутки в количестве 2 мкл раствора в диметилсуль-фоксиде в различных концентрациях.
Планшеты с клетками помещали в инкубатор при 37 °С, 5% СО2. В качестве контроля использовали лунки с клетками, в которые добавляли 20 мкл воды или 2 мкл диметилсульфоксида. Через 24 или 72 ч в каждую лунку вносили по 20 мкл раствора МТТ [3-(4,5-диметилтиазолин-2)-2,5 дифенилтетра-золия бромид] (маточный раствор 5мг/мл), и инкубировали 4 ч при 37 °С в 5%-ном ^^инкубаторе. После образования формазана планшеты с клетками центрифугировали, надосадочную жидкость аккуратно удаляли. Осадок растворяли, добавляя в лунки по 150 мкл ДМСО. Планшеты помещали на 5-7 минут в термостат при температуре 37 °С. Далее, планшеты встряхивали на шейкере, после чего интенсивность окрашивания среды измеряли на фотометрическом анализаторе иммуноферментных реакций «АИФР-01 Униплан» (ЗАО «Пикон») при Х=530 нм. Величина поглощения прямо пропорциональна числу живых клеток.
Выживаемость клеток рассчитывалась по формуле:
в
ОПКО =----------X100%, где
ОПкк
ОПКО - оптическая плотность клеток в опыте;
ОПкк - оптическая плотность контрольных клеток;
В - выживаемость.
Все эксперименты повторяли не менее 3 раз.
Результаты и обсуждение
Синтез
Синтез ПГ-7 (1, Boc-Cys(Thrp)-Phe-D-Trp-Lys(e-Z)-Thr-OMe) и ПГ-46-М (2, H-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-OMe) осуществляли классическими методами пептидной химии по разработанным в ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина» РаМн методикам [2; 7].
При реализации намеченной схемы синтеза реакции конденсации проводили в условиях, сводящих возможность рацемизации отдельных аминокислот к минимуму. При синтезе фрагментов использовали метод смешанных ангидридов.
Выбор защитных групп определялся требованием сведения к минимуму нежелательных побочных реакций при удалении №-защитных группировок на промежуточных стадиях синтеза.
Для защиты а-аминогрупп на всех стадиях синтеза применяли трет-бутилоксикарбонильную группу (Boc). Карбоксильную группу С-концевого аминокислотного остатка треонина защищали эте-рификацией (метиловый эфир). Для защиты реакционноспособной группы лизина в боковой цепи использовали бензилоксикарбонильную защиту (Z), для защиты боковой группы цистеина использовали тетрагидропиранильную защиту (Thp).
Пептиды ПГ-46-Д (3, H-Cys(Acm)-Phe-D-Trp-Lys-Thr-OMe диацетат) и ПГ-114 (4, H-Cys-Phe-D-Trp-Lys-ThrOMe, (1^1')-дисульфид тетраацетат) получены по схеме (см. рис. 1).
Реакция H-Phe-D-Trp-Lys(e-Boc)-Thr-OMe (7), ключевого тетрапептида используемого в синтезе аналогов соматостатина [1], c Boc-Cys(Acm)-OPfp в диметилформамиде в присутствии имидазола в качестве катализатора приводит к защищённому пентапептиду 9. Дебокирование 9 трифторуксусной кислотой и последующая хроматографическая очистка даёт целевой пептид 3. Одновременное снятие защиты Acm и сшивание по меркаптогруппе цис-теина с использованием иода в метаноле приводит ко второму целевому пептиду 4.
Boc-Cys(Acm)-Phe-D-Trp-Lys(s-Boc)-ThrOMe (9)
В 20 мл диметилформамида последовательно растворяют 1,38 г (3,01 ммоль) 8, 1,74 г (2,50 ммоль) 7 и 0,1 г имидазола. Перемешивают реакционную массу при 21-23 °C в течении 12 ч. Проверяют по ТСХ завершение реакции (отсутствие 7) и добавляют 88 мг (1 ммоль) ^^-диметилэтилендиамина. Перемешивают реакционную массу ещё 1 ч при комнатной температуре и выливают в 50 мл воды. Экстрагируют 2 раза по 50 мл этилацетата. Объединённый этилацетатный слой последовательно промывают: 2 раза по 20 мл воды и затем 20 мл насыщенного водного раствора хлористого натрия. Сушат сульфатом натрия.
Отгоняют растворители в вакууме на роторном испарителе (45 °C, 12 мм рт.ст.). Остаток растирают с 50 мл петролейного эфира, фильтруют, промывают на фильтре 20 мл диэтилового эфира и сушат на воздухе до постоянного веса. Получают 2,31 г (95,3%) белого аморфного порошка 9. Содержание основного вещества 87,4 % (ВЭЖХ). ТСХ: этилаце-тат/MeOH 9/1. Rf(7)=0,16, Rf(9)=0,84. ESMS, m/z (I%): 869,3 [M-Boc+H]+ (4,7), 969,3 [M+H]+ (32,9), 991,2 [M+Na]+ (24,8).
H-Cys(Acm)-Phe-D-Trp-Lys-ThrOMe диацетат (3, ПГ-46-Д)
В 5 мл сухого хлористого метилена суспендируют 1,5 г (1,55 ммоль) 9. К полученной суспензии при перемешивании последовательно добавляют 0,5 мл 2-меркаптоэтанола, 0,5 мл анизола и 0,4 мл тиоанизола.
O
HN^ 'Ph
Nh
+ AcNHCH
COOPfp
'COOBu-t
8
N-
COOBu-t
7
H
OH
O HN
.COOBu-t
COOBu-t
O^N^r^ H OH
O u nh2 u
J>hO O
O
NH
COOMe
3
o^n^N^
H OH
O H nh2
Ph
NH
COOMe
4
O^N^i^ H OH
Рис. 1. Схема получения ПГ-46-Д (3, H-Cys(Acm)-Phe-D-Trp-Lys-Thr-OMe диацетат) и ПГ-114 (4, H-Cys-Phe-D-Trp-Lys-ThrOMe, (1^1')-дисульфид тетраацетат).
Охлаждают до 0 °С и при этой температуре приливают 7 мл трифторуксусной кислоты. Перемешивают реакционную массу 20 мин при 0 °С и затем 40 мин при комнатной температуре. Снова охлаждают до 0 °С, добавляют 30 мл диэтилового эфира, перемешивают 20 мин. Фильтруют выпавший трифторацетат дебокированного пептида. Промывают его на фильтре 2 раза 10 мл диэтилового эфира и сушат на воздухе до постоянного веса. Получают 1,48 г (95,8%) белого аморфного порошка бис-трифторацетата 3. Содержание основного вещества 84,9 % (ВЭЖХ). ТСХ: MeOH/AcOH/H2O 6/1/1. Rf(9)=0,98, Rf(3)=0,74. 200 мг полученного сырца хроматографически очищают на колонке 250*50 мм (сорбент VYDAK С18 120A 10 мкм, производитель Grace), переводят бис-трифторацетат в диацетат с использованием ионообменной смолы DOWEX 1X4-50 и лиофилизуют. Выделяют 141 мг белого объёмного диацетата 3. Содержание основного вещества 98,7 % (ВЭЖХ). ESMS, m/z (I%): 385,2 [M+2H]2+ (100), 769,1 [M+H]+ (7,1).
H-Cys-Phe-D-Trp-Lys-ThrOMe, (1^-Г)-дисульфид тетраацетат (4, ПГ-114)
Растворяют 800 мг (с содержанием основного вещества 84,9 %, 0,68 ммоль) сырца 3 в 80 мл 90% водного метилового спирта. При энергичном перемешивании и температуре 15 °С одноразово приливают раствор 1,08 г (4,26 ммоль) иода в 50 мл 90% водного метилового спирта. Перемешивают реакционную массу 1 ч. Проверяют по ТСХ завершение реакции (отсутствие 3). Охлаждают реакционную массу до 0 °С и при этой температуре при-
капывают 1 н водный раствор сульфита натрия до полного исчезновения окраски иода. Подщелачивают до pH 7,5-8,5 1н водным раствором бикарбоната натрия. Выпавший осадок сырца 4 фильтруют, промывают на фильтре 20 мл ледяной воды и затем 20 мл петролейного эфира. Полученный 4 хроматографически очищают на колонке 250*50 мм (сорбент VYDAK C18 120 A 10мкм производитель Grace), переводят в тетраацетат с использованием ионообменной смолы DOWEX 1X4-50 и лиофилизуют. Выделяют 338 мг (60,8%) белого объёмного тетраацетата 4. Содержание основного вещества 98,4% (ВЭЖХ). ТСХ: MeOH/AcOH/H2O 6/1/1. Rf(3)=0,74, Rf(4)=0,24. ESMS, m/z (I%): 465,3 [M+3H]3+ (100), 697,1 [M+H]+ (2,1).
Цитотоксическая активность
Для соединения ПГ-7 максимальная цитоток-сическая активность на всех 4 клеточных линий выявлена в наибольшей из исследуемых концентраций (5*10-4 Моль/л) при инкубации в течение 72 ч (рис. 2). Лучший результат получен на линии LNCap-LN3. Ингибирующие концентрации, вызывающие гибель 50 % клеток (ИК50), приведены в табл. Максимальная цитотоксическая активность соединения ПГ-46-М выявлена при инкубации в течение 72 ч также на всех 4 клеточных линиях (рис. 3). На линиях клеток LNCap и LNCap-clon FGC максимальная цитотоксическая активность обнаружена в концентрации 1*103 Моль/л, на LNCap-LN3 и SH-SY5Y - 5*10-4 Моль/л. ИК50 (см. ibid.).
2
50 ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ СИНТЕЗ И ИЗУЧЕНИЕ ЦИтТОКСИЧЕСКОЙ...
А
-24 ч -72 ч
Концентрация, Моль/л
В
120
100
80
60
40
20
0
-24 ч -72 ч
5x10-8 1x10-7 5x10-7 1x10-6 5x10-6 1x10-5 5x10-5 1x10-4 5x10-4 Концентрация, Моль/л
Г
Рис. 2. Цитотоксическая активность ПГ -7 на линиях клеток:
А: ЬЫСар;
Б: ЬЫСар-ЬШ;
В: ЬЫСар-с1оп ЕОС;
Г: 8И-8У5У.
Б
А Б
В
Г
Рис. 3. Цитотоксическая активность ПГ -46-М на линиях клеток:
А: ЬЫСар;
Б: ЬЫСар-ЬШ;
В: ЬЫСар-с1оп ЕОС;
Г: 8И-8У5У.
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ СИНТЕЗ И ИЗУЧЕНИЕ ЦИТОТОКСИЧЕСКОЙ... 51
А
Б
В
Г
Рис. 4. Цитотоксическая активность ПГ-46-Д на линиях клеток:
А: ЬЫСар;
Б: ЬЫСар-ЬШ;
В: ЬЫСар-с1оп ЕОС;
Г: 8И-8У5У.
А
120 100 ¡5 80
0
1 60 СО
I 40
Л
ш
20
0
5x10-8 1x10-7 5x10-7 1x10-6 5x10-6 1x10-5 5x10-5 1x10-4 5x10-4 Концентрация, Моль/л
Б
В
Г
Рис. 5. Цитотоксическая активность ПГ -114 на линиях клеток:
А: ЬЫСар;
Б: ЬЫСар-ЬШ;
В: ЬЫСар-с1оп ЕОС;
Г: 8И-8У5У.
52 ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ СИНТЕЗ И ИЗУЧЕНИЕ ЦИТОТОКСИЧЕСКОЙ...
А
120
100
80
60
40
20
0
-24 ч -72 ч
1x10-10 1x10-9 5x10-9 1x10-8 5x10-8 1x10-7 5x10-7 1x10-6 5x10-6 Концентрация, Моль/л
Б
В
Г
Рис. 6. Цитотоксическая активность сандостатина на линиях клеток:
А: ЬЫСар;
Б: ЬЫСар-ЬШ;
В: ЬЫСар-с1оп ЕОС;
Г: 8И-8У5У.
А
Ь ^ 1 ^
О
-*-24 ч -■—72 ч
О
£ 40 ■ л ш
0 -
5x10-8 1x10-7 5x10-7 1x10-6 5x10-6 1x10-5 5x10-5 1x10-4 5x10-4 Концентрация, Моль/л
о -А-24 ч -■—72 ч
со
£ 40 ■ л ш
0 -
5x10-8 1x10-7 5x10-7 1x10-6 5x10-6 1x10-5 5x10-5 1x10-4 5x10-4 Концентрация, Моль/л
Б
В Г
Рис. 7. Цитотоксическая активность октреотида на линиях клеток:
А: ЫЧСар;
Б: ЫЧСар-ЬШ;
В: Ы\ТСар-с1оп БвС;
Г: 8И-8У5У.
Таблица
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ СИНТЕЗ И ИЗУЧЕНИЕ ЦИТОТОКСИЧЕСКОЙ... 63
ИК50 после инкубации клеточных линий с соединениями ПГ-7, ПГ-46-М, ПГ-46-Д в течение 24 и 72 ч, Моль/л
Соединение Клеточные линии и время инкубации
LNCap LNCap-LN3 LNCap-clon FGC SH-SY5Y
24 ч 72 ч 24 ч 72 ч 24 ч 72 ч 24 ч 72 ч
ПГ-7 - 7,5*10° - 7*10-6 - 5*10° - -
ПГ-46-М 7,5 х10-4 4х10-4 7,5 *10-4 4*10-4 5*10-4 4*10-4 3*10-4 3*10-4
ПГ-46-Д - 5*10-4 9*10-4 5*10-4 7,5 *10-4 6*10-4 5*10-4 5*10-4
Для соединения ПГ-46-Д наибольшая цито-токсическая активность выявлена при инкубации в течение 72 ч с самой высокой концентрацией препарата 9*10-4 моль/л (рис. 4). ИК50 (см. ibid.).
Цитотоксическая активность соединения ПГ-114 в исследуемых дозах оказалась слабой. Максимальная цитотоксическая активность обнаружена при инкубации в течение 72 ч в самой высокой из исследуемых концентраций 5*10-4 моль/л (рис. 5). ИК50 ни на одной из клеточных линий не достигнута. Для сандостатина и октреотида в исследованных концентрациях цитотоксическая активность не была выявлена (рис. 6 и 7).
Выводы
В результате проделанной работы показано, что сандостатин, октреотид и ПГ-114 в исследованных концентрациях не показали цитотоксической активности на линиях клеток ЬМСар, ЬМСар-ЬШ, ЬМСар-с1оп БвС и 8И-8У5У. Положительные результаты были отмечены для пептидов ПГ-7, ПГ-46-М и ПГ-46-Д на всех исследованных линиях клеток, лучший результат показал ПГ-7 на линии клеток ЬйСар-ЬШ при инкубации 72 ч - ингибирующая концентрация, вызывающая гибель 50 % клеток, - 7*і0-6.
Литература
1. Балаев А.Н., Осипов В.Н, Охманович К.А. и др. Получение H-Phe-D-Trp-Lys(e-Boc)-Thr-OMe - тетра-пептидного фрагмента синтеза аналогов соматостатина // Российский биотерапевтический журнал. -2011. - Т. 10, № 4. - С. 43-5.
2. Кубасова И.Ю., Борисова Л.М., Киселева М.П. и др. Поиск потенциальных противоопухолевых соединений среди аналогов гипоталамического гормона соматостатина // Российский биотерапевтиче-ский журнал. - 2006. - Т. 5, № 3. - С. 123-7.
3. Райхлин Н.Т., Смирнова Е.А., Делекторская В.В. Рецепторы соматостатина и его аналоги в диагностике и лечении опухолей человека // Вопросы онкологии. - 2010. - Т. 56, № 1. - С. 7-13.
4. Buscail L., Vernejoul F., Faure P. Regulation of cell proliferation by somatostatin // Ann Endocrinol. -2002. - 63(2 Pt 3). - 2S13-8.
5. Mossman T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays // J. Immunol. Meth. - 1983. - 65. - P. 55-63.
6. Schally A.V., Comaru-Schally A.M., Nagy A. et. al. Hypothalamic hormones and cancer // Front. Neuroen-docrinol. - 2001. - 22. - P. 248-91.
7. Smirnova L.I., Smirnova A.P., Ustinkina S.V. et al. // Journal of Peptide Science 3rd International and 28th
European Peptide Symposium, September 5-10, Prague, Czech Rebublic (2004), P. 261.
8. Weckbecker G., Lewis I., Albert R. et al. Opportunities in somatostatin research: biological, chemical and
therapeutic aspects // Nature Rev. Drug Discovery. - 2003. - 2. - P. 999-1017.
