CC BY
29
Оригинальные статьи
85
цитотоксические аналоги цифетрилииа
(сообщение i)
в.н. Осипов, л.П. Сушинина, С.в. Устинкина, л.и. Смирнова, З.С. Шпрах
ФГБУ«Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина» Минздрава России; Россия, 115478 Москва, Каширское шоссе, 24
Контакты: Василий Николаевич Осипов ovn65@yandex.ru
Введение. Препарат цифетрилин, аналог гипоталамического гормона соматостатина, разработан в ФГБУ «Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина» Минздрава России. В основу настоящей работы положена идея об использовании цифетрилина в качестве специфического носителя цитотоксических групп.
Цель исследования — синтез цитотоксических аналогов цифетрилина с целью изучения влияния наличия цитотоксических фрагментов на его противоопухолевую активность.
Результаты. Классическими методами пептидной химии синтезированы 5новых аналогов цифетрилина, модифицированных цитотоксическими агентами. Соединения получены присоединением к цифетрилину по N-группе цистеина или по N-группе лизина хлорфенацила или гидролизованного цифелина (цитотоксического препарата). Очистку полученных пептидов проводили с помощью колоночной хроматографии на силикагеле. Чистота соединений подтверждена элементным анализом, тонкослойной хроматографией, углом оптического вращения и данными высокоэффективной жидкостной хроматографии. Проведены предварительные исследования их противоопухолевой активности на перевиваемых опухолях мышей — аденокар-циномемолочной железы Ca755и меланоме В16.
Заключение. Синтезированы новые пептиды — аналоги цифетрилина, содержащие цитотоксические фрагменты, подтверждены их строение и чистота.
Ключевые слова: аналог соматостатина, противоопухолевая активность, синтетический пептид
DOI: 10.17650/1726-9784-2016-15-4-85-88
CYPHETRYLIN CYTOTOxIC ANALOGuES (REPORT I)
V.N. Osipov, L.P. Sushinina, S. V. Ustinkina, L.I. Smirnova, Z.S. Shprakh
N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center at the Ministry of Health of Russia; 24 Kashyrskoe Sh., Moscow, 115478, Russia
Background. The drug cyphetrylin, hypothalamic hormone somatostatin analogue, was developed in N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center at the Ministry of Health of Russia. The basis of this work is the idea of using cyphetrylin as a specific carrier of cytotoxic groups.
Objective. Synthesis of cytotoxic cyphetrylin analogues in order to study the effect of the presence of cytotoxic agents on its antitumor activity. Results. The classical methods of peptide chemistry were used for 5 the new cyphetrylin analogues synthesis. The compounds have been obtained by the addition to the cyphetrylin Na-group of the cysteine or lysine Ne-group chlorophenacyl or hydrolyzed cyphelin (cytotoxic agent). Purification of the peptides was performed by column chromatography on silica gel. The purity of the obtained compounds was confirmed by elemental analysis, TLC, optical rotation angle data and HPLC. Preliminary studies of anti-tumor activity were performed in mice transplanted tumors: adenocarcinoma Ca755 breast and melanoma B16.
Conclusions. New peptides — analogues cyphetrylin containing cytotoxic fragment have been synthesized, their structure and purity have been confirmed.
Key words: somatostatin analogue, antitumor activity, synthetic peptide
Введение
Препарат цифетрилин, аналог гипоталамического гормона соматостатина, разработан в ФГБУ «Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина» Минздрава России [1].
Механизм противоопухолевой активности цифетри-лина и других аналогов соматостатина определяется
2 возможными путями реализации их ингибирующе-го действия — прямого и опосредованного. Прямой цитотоксический эффект обусловлен связыванием этих соединений с рецепторами к соматостатину на поверхности опухолевых клеток. Опосредованный анти-пролиферативный эффект соматостатина обусловлен торможением секреции ряда гормонов и факторов
4'2016 том 15 I VOL. 15
РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ I RUSSIAN JOURNAL OF BiOTHERAPY
роста опухолей (инсулиноподобного фактора роста, гастрина, глюкагона, вазоактивного интестинально-го пептида, инсулина, холецистокинина, мотилина, серотонина и др.) [2, 3].
Синтезирован большой ряд аналогов соматоста-тина, и показана их противоопухолевая активность [2, 4-9].
В основу настоящей работы положена идея об использовании цифетрилина в качестве специфического носителя цитотоксических групп с целью возможного увеличения прямого цитотоксического эффекта. В литературе имеются сведения о подобных исследованиях, направленных на поиск потенциальных противоопухолевых соединений в ряду цитоток-сических аналогов гипоталамических гормонов. Адресная доставка цитотоксических агентов к опухолям с помощью специфических носителей в некоторых случаях приводила к положительным результатам [10, 11].
Цифетрилин, аналог гипоталамического гормона соматостатина, представляет собой защищенный по функциональным группам пентапептид (метиловый эфир №-трет-бутилоксикарбонил^-тетрагидропи-ранил^-цистеинил^-фенилаланил^-трипто-фил-№-карбобензокси^-лизил^-треонина).
В статье представлен синтез 5 цитотоксических производных цифетрилина. Метиловый эфир №-п-ди-(2-хлорэтил)-аминофенилацетил^-тетрагидро -пиранил-цистеинилфенилаланил^-триптофил-№-карбобензокси-лизилтреонина (ClPhe-Cys (Thp)-Phe-D-Trp-Lys(Z)-Thr-OMe) (1) и метиловый эфир №-ацетил-п-ди-(2-хлорэтил)аминофенилала-нилвалил^-тетрагидропиранил-цистеинил-фенила-ланил^-триптофил-№-карбобензокси-лизилтрео-нина (AcSarVal-Cys(Thp)-Phe-D-Trp-Lys (Z)-Thr-OMe) (2) получены присоединением к цифетрилину по №-аминогруппе цистеина цитотоксических фрагментов: п-ди-(2-хлорэтил)-амино-фенилуксусной кислоты (QPhe, хлорфенацила) и №-ацетил-п-ди-(2-хлорэтил)-аминофенилаланилвалина (AcSar\&l, гидро-лизованного цифелина) соответственно. Метиловый эфир №-трет-бутил-оксикарбонил^-тетрагидропи-ранил-цистеинилфенилаланил-D -триптофил-№-п-ди-(2-хлорэтил)-аминофенилацетил-лизилтреонина (Boc-Cys (Thp)-Phe-D-Trp-Lys(aPhe)-Thr-OMe) (3) и метиловый эфир №-трет-бутилоксикарбонил^-тетрагидропиранил-цистеинилфенилаланил^-триптофил-№-(№-ацетил-п-ди-(2-хлорэтил)-аминофенилаланилвалил)лизилтреонина (Boc-Cys (Thp)-Phe-D-Trp-Lys (AcSarVal)-Thr-OMe) (4) получены присоединением к цифетрилину по №-группе лизина хлорфенацила и гидролизованного цифели-на соответственно. Тетрапептид — метиловый эфир №-трет-бутилоксикарбонилфенил-аланил^-триптофил-№-(№-ацетил-п-ди-(2-хлорэтил)-
аминофенилаланилвалил)-лизилтреонина (Вос-Phe-D-Trp-Lys (AcSarVal)-Thr-OMe) (5) представляет собой промежуточный цитотоксический аналог в синтезе пентапептида 4.
Материалы и методы
Синтез осуществляли классическими методами пептидной химии. При реализации намеченной схемы синтеза реакции конденсации проводили в условиях, сводящих к минимуму возможность рацемизации отдельных аминокислот. При синтезе фрагментов использовали методы смешанных ангидридов и активированных эфиров.
Выбор защитных групп определяли требованием сведения к минимуму нежелательных побочных реакций при удалении №-защитных группировок на промежуточных стадиях синтеза.
Для защиты а-аминогрупп на всех стадиях синтеза применяли трет-бутилоксикарбонильную группу (Boc). Карбоксильную группу С-концевого аминокислотного остатка треонина защищали этерификацией (метиловый эфир). Для защиты реакционноспособ-ной группы лизина в боковой цепи использовали бензилоксикарбонильную защиту (Z), для защиты боковой группы цистеина применяли тетрагидропи-ранильную защиту (Thp).
Удельное вращение измеряли на поляриметре Unipol L (Германия). Для очистки защищенного пентапептида 1 использовали колоночную хроматографию на силикагеле Kiselgel 40/63 (Merck, Германия). Для тонкослойной хроматографии применяли пластинки Sorbfil ПТСХ-АФ-А-УФ (Россия) с тонким слоем силикагеля, в качестве растворителя использовали хлороформ и метанол в соотношении 9:1. Вещества обнаруживали на хроматограммах при обработке парами йода, а также при проявлении 0,5 % раствором нингидрина в этаноле. Чистоту полученных соединений и содержание примесей определяли методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) на хроматографе Shimadzu. Колонка Reprosil-Pur Basic C18, 5 мкм, 250 х 4,6 мм. Условия: линейный градиент AB — 5 % B (0 мин) — 100 % B (20 мин). A — 0,01 % трифторуксусная кислота в воде, B — 0,01 % трифторуксусная кислота в ацето-нитриле.
Противоопухолевую активность цитотоксиче-ских аналогов цифетрилина исследовали на перевиваемых штаммах опухолей мышей.
Результаты и обсуждение
Синтез цитотоксических аналогов цифетрилина 1 и 2 осуществляли по схеме 1 (рис. 1).
Для получения цифетрилина (соединение 13) синтез осуществляли постепенным наращиванием пептидной цепи, начиная с С-концевой аминокислоты
Оригинальные статьи 87
треонина [7]. После снятия трет-бутилоксикарбо-нилной защитной группы с №-цистеина трифтор-уксусной кислотой соединение 14 конденсировали методом активированных эфиров с п-ди-(2-хлор-этил) аминофенилуксусной кислотой. В результате хроматографической очистки получали соединение 1. C50H74N8O,,SCL Вычислено, %: Cl 6,04; S 2,72. Найдено, %: Cl 5,02; S 2,74; Rf 0,70 (хлороформ: метанол — 0:1); [a]D—20° (С = 1, диметилформамид); содержание основного вещества — 07,0 % (ВЭЖХ).
Соединение 2 получали конденсацией соединения 14 с №-ацетил-п-ди-(2-хлорэтил)-аминофенил-аланилвалином, полученным щелочным гидролизом цифелина. C67H88N10O13SCl2. Вычислено, %: Cl 5,28; S 2,38. Найдено, %: Cl 5,44; S 2,65; Rf 0,51 (хлороформ: метанол — 0:1); [a]D —7° (С = 1, диметилсульфоксид); содержание основного вещества — 06,0 % (ВЭЖХ).
Синтез цитотоксических аналогов цифетрилина 3 и 4 осуществляли по схеме 2 (рис. 2).
Соединение 4: C64H01N10O13SCl2. Вычислено, %: Cl 5,41; S 2,44. Найдено, %: Cl 5,4; S 2,55; Rf 0,48 (хлороформ: метанол — 0:1); [a]D+12° (С = 1, диме-тилформамид).
В ходе синтеза был выделен цитотоксический тетрапептид Boc-Phe-D-Trp-Lys (Ac-Sar-Val)-Thr-OMe 5. C56H77N0O11Cl2. Вычислено, %: Cl 6,32. Найдено, %: Cl 6,08, %; Rf 0,40 (хлороформ: метанол - 0:1); [a]D -5° (С = 1, диметилформамид).
Синтезированные цитотоксические аналоги цифе-трилина (соединения 1-4) и промежуточный цитоток-сический тетрапептид 5 исследовали на противоопухолевую активность в лаборатории экспериментальной химиотерапии.
При предварительном изучении противоопухолевой активности синтезированных аналогов цифе-трилина на перевиваемых опухолях мышей (адено-карциноме молочной железы Са755 и меланоме В16) соединения, содержащие цитотоксические группы по №-группе цистеина (соединения 1 и 2), не проявили активности. Соединения с цитотоксической группой по №-группе лизина 3, 4 и 5 проявили статистически значимый противоопухолевый эффект, что позволяет продолжить их изучение. Результаты изучения противоопухолевой активности цитотоксических аналогов цифетрилина и анализ полученных данных будут представлены в следующем сообщении.
Cys
Phe
D-Trp
Lys
Thr
Boc
Boc H
Х1 Х2
OMe Thp
OMe Boc Thp OH Boc
Thp
OH (12) H Thp
Thp
Thp
Boc Boc
OH H
Boc Boc
OH H
Z
OH
i/ Z
Z
/
OMe OMe (6)
OMe (7) OMe (8)
OMe (9)
OMe (10)
OMe (11) OMe (13) OMe (14) OMe (1), (2)
Хх - хлорфенацил
Х2 - гидролизованный цифелин
рис. 1. Синтез цитотоксических аналогов цифетрилина 1 и 2
H
Z
H
Z
H
Z
Н
Z
Z
Z
Z
4'2016 ТОМ 15 I VOL. 15
РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ I RUSSIAN JOURNAL OF BIOTHERAPY
Cys
Phe
D-Trp
Lys
Thr
Thp
Boc
Boc
Boc
OH (12) H Thp
Х1 - хлорфенацил
Z.
H /
Xl, X2* /
Xl, X2* /
/ Xl, X2*
Х2 - гидролизованный цифелин
OMe (10)
OMe (15) OMe (16), (5)
OMe (17), (18) OMe (3), (4)
Рис. 2. Синтез цитотоксических аналогов цифетрилина 3 и 4
Заключение
Классическими методами пептидной химии синтезированы 5 новых аналогов цифетрилина, модифицированных цитотоксическими агентами. Соединения получены присоединением хлорфенацила или гидро-лизованного цифелина к цифетрилину по №-группе цистеина (соединения 1, 2) и по №-группе лизина (соединения 3, 4 и соединение 5, тетрапептид, содержащий гидролизованный цифелин по №-группе лизина).
Очистку полученных пептидов проводили с помощью колоночной хроматографии на силикагеле.
Проведено предварительное исследование противоопухолевой активности полученных соединений на перевиваемых опухолях мышей (аденокарциноме молочной железы Са755 и меланоме В16). Результаты исследования позволяют продолжить изучение соединений с цитотоксической группой по №-группе лизина (соединения 3, 4 и тетрапептид 5).
Z
ЛИТЕРАТУРА / REFERENCES
1. Смирнова Л.И., Устинкина С.В., Смирнова А.П. и др. Средство, обладающее противоопухолевым действием. Патент
РФ № 2254139.
2. Schally A.V., Comary-Schally A.M., Nagy A. et al. Hypotalamic hormones and cancer. Front Neuroendocrinal 2001;22:248-91. DOI: 10.1006/frne. 2001.0217. PMID: 11587553.
3. Susini C., Buscail L. Rationale for the use of somatostatin analogs as antitumor agents. Annals of Oncology 2006;17(12):1733-42. DOI: 10.1093/annonc/mdl105.
PMID: 16801334.
4. Балаев А.Н., Осипов В.Н., Хачатрян Д.С. Синтетические пептидные аналоги соматостатина: стратегии синтеза и перспективы поиска новых противоопухолевых препаратов. Химико-фармацевтический журнал 2015;49(6):3-9.
5. Балаев А.Н., Осипов В.Н., Федоров В.Е. и др. Синтез и изучение
цитотоксической активности аналогов гипоталамического гормона соматостатина. Российский биотерапевтический журнал 2012;11(4):47-53.
6. Балаев А.Н., Осипов В.Н., Федоров В.Е. и др. Влияние синтетических пептидных агонистов соматостатина на рост перевиваемых опухолей мышей. Российский биотерапевтический журнал 2013;12(3):57-60.
7. Кубасова И.Ю., Борисова Л.М., Киселева М.П. и др. Поиск потенциальных противоопухолевых соединений среди аналогов гипоталамического гормона соматостатина. Российский биотерапевтический журнал 2006;3:123-
7.
8. Шпрах З.С., Ярцева И.В., Игнатьева Е.В. и др. Синтез и химико-фармацевтические характеристики аналога соматостатина, обладающего противоопухолевой активностью. Химико-фармацевтический журнал 2014;48(3):19-22.
9. Smirnova L.I., Smirnova A. P., Ustinkina S.V. et al. Synthesis and antitumor activity of modified somatostatin analogues. Flegel M., Fridkin M., Gilon C., Slaninona J. (Ed.) Peptides 2004 Proceedings of the Third International and Twenty-Eighth European
Peptide Symposium, September 5-10. Prague, Czech Republic, 2004. P. 946-947.
10. Смирнова Л.И., Смирнова З.С., Устинкина С.В. Синтез и противоопухолевая активность гормона гипоталамуса меланостатина и его аналогов. Экспериментальная онкология на рубеже веков. Под ред. М.И. Давыдова, А.Ю. Барышникова. М., 2003. С. 261-280.
11. Nagy A., Schally A.V. Targeting cytotoxic conjugates of somatostatin, luteinizing hormone-releasing hormone and bombensin to cancer expressing their receptors:
a "smarter" chemotherapy. Current Pharmaceutical Design 2005;11(9):1167-80. PMID: 15853664.
