Научная статья на тему 'Получение H-Phe-D-Trp-Lys(e-BOC)-Thr-OMe - тетрапептидного фрагмента синтеза аналогов соматостатина'

Получение H-Phe-D-Trp-Lys(e-BOC)-Thr-OMe - тетрапептидного фрагмента синтеза аналогов соматостатина Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

CC BY
192
75
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.
Ключевые слова
ИНТЕРМЕДИАТ ДЛЯ АНАЛОГОВ СОМАТОСТАТИНА / ОКТРЕОТИД / ЦИФЕТРЕЛИН / INTERMEDIATE FOR SOMATOSTATINE ANALOGS / OKTREOTIDE / CIFETRELINE

Аннотация научной статьи по фундаментальной медицине, автор научной работы — Балаев А. Н., Осипов Василий Николаевич, Охманович К. А., Фёдоров В. Е., Решетников Е. В.

Разработан новый простой, эффективный и легко масштабируемый метод получения H-Phe-D-Trp-Lys(e-Boc)-Thr-OMe ключевого тетрапептидного фрагмента синтеза аналогов соматостатина.

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Похожие темы научных работ по фундаментальной медицине , автор научной работы — Балаев А. Н., Осипов Василий Николаевич, Охманович К. А., Фёдоров В. Е., Решетников Е. В.

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

PREPARATION H-PHE-D-TRP-LYS(s-BOC)-THR-OME - TETRAPEPTIDE INTERMEDIATE FOR SOMATOSTATINE ANALOGS SYNTHESIS1CJSC «Pharm-Sintez»

Effective and large scale method for preparation H-Phe-D-Trp-Lys(e-Boc)-Thr-OMe key tetrapeptide intermediate for somatostatine analogs synthesis was developed.

Текст научной работы на тему «Получение H-Phe-D-Trp-Lys(e-BOC)-Thr-OMe - тетрапептидного фрагмента синтеза аналогов соматостатина»



ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ ПОЛУЧЕНИЕH-PHE-D-TRP-LYS(e-BOC)-THR-OME... 43

УДК 615.012:577.175.3

А.Н. Балаев1, В.Н. Осипов2, КА. Охманович1, В.Е. Фёдоров1, Е.В. Решетников1 ПОЛУЧЕНИЕ H-PHE-D-TRP-LYS(e-BOC)-THR-OME

- ТЕТРАПЕПТИДНОГО ФРАГМЕНТА СИНТЕЗА АНАЛОГОВ СОМАТОСТАТИНА

1ЗАО «Фарм-Синтез», Москва 2РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН, Москва

Контактная информация:

Осипов Василий Николаевич, старший научный сотрудник НИИ ЭДиТО адрес: 115478, Москва, Каширское ш., 24; тел: +7(495)324-19-09 e-mail: ovn@front.ru

Статья поступила: 19.04.2011; принята к печати 25.10.2011

Резюме

Разработан новый простой, эффективный и легко масштабируемый метод получения H-Phe-D-Trp-Lys(e-Boc)-Thr-OMe - ключевого тетрапептидного фрагмента синтеза аналогов соматостатина.

Ключевые слова: интермедиат для аналогов соматостатина, октреотид, цифетрелин.

A.N. Balaev,1 V.N. Osipov2, K.A. Okhmanovich1, V.E. Fedorov1, E.V. Reshetnikov1 PREPARATION H-PHE-D-TRP-LYS(e-BOC)-THR-OME

- TETRAPEPTIDE INTERMEDIATE FOR SOMATOSTATINE ANALOGS SYNTHESIS

1CJSC «Pharm-Sintez», Moscow

2N.N. Blokhin Russian Canser Reseach Center of RAMS, Moscow Abstract

Effective and large scale method for preparation H-Phe-D-Trp-Lys(e-Boc)-Thr-OMe - key tetrapeptide intermediate for somatostatine analogs synthesis was developed.

Key words: intermediate for somatostatine analogs, oktreotide, cifetreline.

Введение

Способность Соматостатин - пептидный гормон, состоящий из 14 аминокислотных остатков:

А1а-С1у-Су8-Ьу8-А8п-РИе-РИе-Тгр-Ьу8-ТИг-РИе-ТИг-8ег-Су8

Соматостатин угнетает секрецию гормона роста, пролактина, тиреотропного гормона гипофизом, инсулина и глюкагона в поджелудочной железе, а также секрецию гастрина и секретина в желудочно-кишечном тракте, то есть, гормонов, стимулирующих пролиферацию опухолевых клеток. В связи с этим соматостатин является весьма перспективным при лечении опухолевых заболеваний и акромегалии. Однако широкий спектр физиологической активности и кратковременность биологического действия препятствует его использованию в медицине. Представляет интерес получение аналогов соматостатина, обладающих большей избирательностью и продолжительностью действия. Наиболее распространен и известен Октреотид (Сандостатин), который является синтетическим аналогом соматостатина со сходными с ним фармакологическими эффектами и значительно большей продолжительностью действия:

Б-РЬе-Су8-РЬе-Б-Тгр-Ьу8-ТЬг-Су8-ТЬг01

Он подавляет патологически повышенную секрецию гормона роста, пептидных гормонов и серотонина, продуцируемых в гастроэнтеропан-

креатической эндокринной системе, при этом его применение не сопровождается гиперсекрецией гормонов по механизму отрицательной обратной связи.

В настоящее время Октреотид нашел широкое применение при лечении острого панкреатита, профилактике и лечении осложнений после операций на поджелудочной железе, в терапии акромегалии, а также как средство патогенетической терапии при опухолях, активно экспрессирующих рецепторы к соматостатину.

Исследования последних лет показали, что и более короткие пептиды могут обладать сопоставимым с Октреотидом физиологическим действием. Так, ряд новых производных пентапептида, Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-OMe, синтезированных в РОНЦ им. Н.Н. Блохина, при сравнительных исследованиях на животных совместно с Сандостатином обладали равной с ним противоопухолевой активностью [1]. Один из них отобран в эксперименте для продвижения на клинические испытания [2].

Целью настоящей работы является разработка простого и масштабируемого способа получения H-Phe-D-Trp-Lys(e-Boc)-Thr-OMe, используемого

для получения пептидов - синтетических аналогов соматостатина.

Материалы и методы

Аналитическую ВЭЖХ проводили на хроматографе фирмы Shimadzu. Колонка: Grom-Sil 12J ODS-4HE, 5дт, 250-4,6 mm. Условия: A - вода + фосфатный буфер pH 3, B - ацетонитрил, градиент 20 % B (0 мин) 60 % B (10 мин) 70 % B (15 мин) 70 % B (30 мин). ТСХ проводили на пластинах Merck TLC Silica gel 60 F254, проявление нингидрином.

44 ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ ПОЛУЧЕНИЕН-РНЕ-П-тР-ЬУЗ(е-ВОС)Тт-ОМЕ...

Гидрохлорид метилового эфира Ь-треонина [3], №-трет-бутоксикарбонил-Ь-лизин [6], Р-комп-лекс [4] и Ы-бензилоксикарбонил-Ь-фенилаланил-О-триптофан [5] получены известными методами.

Z-Phe-D-Trp-OPfp (II)

Растворяют 35 г (72 ммоль) 7-РИе-О-Тгр-ОН в смеси 20 мл диметилформамида и 170 мл диокса-на. При перемешивании присыпают 70 г (92 ммоль) Р-комплекса. Перемешивают 3 ч при комнатной температуре. Отфильтровывают выпавшую дицик-логексилмочевину, промывают смесью 50 мл диок-сана и 5 мл диметилформамида. В фильтрат добавляют 400 мл гексана и оставляют на ночь при 5 °С. Фильтруют выпавший продукт и промывают его на фильтре смесью 100 мл гексана. Осадок сушат на воздухе до постоянного веса. Получают 39 г (83 %) белого кристаллического продукта. ТСХ:

СНСУМеОН/АсОН 9/1/0,1; К^(И)=0,89.

Z-Phe-D-Trp-Lys(E-Boc)-OH (III)

К суспензии 50 г (76,7 ммоль) 7-РИе-О-Тгр-ОР1р в 300 мл диоксана при перемешивании (температура 24-25 °С) прикапывают в течение 3 мин раствор Н-Ьуз(е-Вос)ОН (приготовленный растворением 20 г (81,2 ммоль) 95 %-ого Н-Ьуз(е-Вос)-ОН и 1 г имидазола в 80 мл 1 N водного раствора гидроксида натрия). Реакционную массу перемешивают в течение 1,5-2 ч. Прозрачный раствор промывают в делительной воронке 2 раза по 300 мл гексаном, разбавляют 350 мл воды и затем 200 мл гексана. Выпавшую натриевую соль трипептида отфильтровывают, перемешивают с 50 мл 5 %-ого водного раствора лимонной кислоты и отфильтровывают осадок. Промывают 500 мл воды и сушат на воздухе до постоянного веса. Получают 44 г (80,3 %) белого аморфного продукта III. ТСХ: СНСУМеОН/АсОН 9/1/0,1; К^(Ш)=0,71. Содержание основного вещества 94,3 % (ВЭЖХ).

Z-Phe-D-Trp-Lys(£-Boc)-Thr-OMe (IV)

Растворяют последовательно в 100 мл диметилформамида 25 г (35 ммоль) 7-РЬе-О-Тгр-Ьуз(е-Вос)ОН, 5,8 г (38 ммоль) НОВ! моногидрата, 6,3 г (37 ммоль) Н-ТИг-ОМе • НС1 и 4 г (40 ммоль) три-этиламина. Охлаждают смесь до 0-5 °С и при этой температуре и перемешивании прикапывают в течении 5 мин раствор 7,5 г (37 ммоль) дициклогек-силкарбодиимида в 25 мл диметилформамида.

Реакционную массу перемешивают при этой же температуре 1 ч, снимают охлаждение и оставляют при комнатной температуре на 12 ч (контроль по ТСХ). Выпавшие кристаллы мочевины отфильтровывают, промывают 20 мл диметилформамида и тщательно отжимают.

Фильтрат разбавляют водой до 1 л и оставляют на 30 мин. Воду сливают с выпавшего густого масла и промывают его взбалтыванием с 200 мл воды. Растворяют масло в 500 мл хлороформа и полученный раствор последовательно промывают 2 раза 700 мл насыщенного водного раствора бикарбоната натрия, 1000 мл 5 %-ого водного раствора лимонной кислоты и затем 1000 мл воды.

Органический слой сушат сульфатом натрия, отгоняют растворитель на роторном испарителе (<40 °С), полученное вязкое масло затирают с 200 мл петролейного эфира.

Осадок отфильтровывают и промывают на фильтре 100 мл петролейного эфира. Осадок сушат на воздухе до постоянного веса. Получают 27,3 г (94,1 %) белого мелкого порошка IV. ТСХ: СНС1з/МеОН/АсОН 9/1/0,1; №(^=0,76. Содержание основного вещества 94,5 % (ВЭЖХ).

Н-Р1іе-0-Тгр-Ьу5(є-Вос)-ТЬг-ОМе (V)

Растворяют в 370 мл метанола 37 г (44,6 ммоль) 7-РЬе-0-Тгр-Ьуз(є-Вос)-ТЬг-ОМе и в полученный раствор добавляют 0,3 г 20 %-ной водной пасты гидрооксида палладия.

При интенсивном перемешивании и комнатной температуре пропускают водород (5-8 ч, контроль по ТСХ). Отфильтровывают палладий, отгоняют метанол на роторном испарителе (<40 °С), к остатку добавляют 50 мл серного эфира, перемешивают и добавляют 200 мл петролейного эфира.

Выпавший осадок фильтруют, промывают на фильтре 50 мл петролейного эфира и сушат на воздухе до постоянной массы.

Получают 27,4 г (88,3 %) светло-серого мелкокристаллического порошка.ТСХ: СНС13/МеОН/ АсОн 9/1/0,1; К1^)=0,18. Содержание основного вещества 96,9 % (ВЭЖХ).

Результаты и обсуждение

В результате проведённых экспериментов разработан и оптимизирован метод получения тетрапептида (V). Схема синтеза включает 4 стадии:

2-РИе-О-Тгр-ОН I Н-РЬе-О-Тгр-Ьуз(е-Вос)-ТИг-ОМе

V

На первой стадии из Ы-бензилоксикарбонил-Ь-фенилаланил-О-триптофана (I) получают пен-тафторфениловый эфир (II). В качестве реагента используют аддукт пентафторфенола и пентафтор-фенилового эфира дициклогексилизомочевины (Р-комплекс). Как показано в [4], его использование позволяет получать пентафторфениловые эфиры пептидов в очень мягких условиях без рацемизации исходного пептида. Реакцию проводят при комнат-

------»- 2-РИе-О-Тгр-Ьуз(е-Вос)-ОН

III

V

------ 2-РЬе-О-Тгр-Ьуз(е-Вос)-ТИг-ОМе

IV

ной температуре в смеси растворителей диметил-формамид-диоксан. Полученный II высаживают из реакционной массы гексаном. Взаимодействие II с Ы-трет-бутоксикарбонил-Ь-лизином в водно-

диоксановом растворе в присутствии гидроксида натрия приводит к образованию натриевой соли трипептида (III), которую переводят в свободную кислоту III обработкой 5 %-ным водным раствором лимонной кислоты.

2-Рпе-0-Тгр-ОРір

II

ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ ПОЛУЧЕНИЕH-PHE-D-TRP-LYS(e-BOC)-THR-OME... 45

Конденсацией III с метиловым эфиром Ь-треонина (карбодиимидный метод с использованием гидроксибензотриазола (НОВ^) в диметилформами-де при 0-5°С получают тетрапептид (IV). Необходимо отметить, что в этой схеме треонин используется без защиты гидроксильной группы боковой цепи, что не мешает дальнейшему синтезу цифетрели-на и октреотида.

Целевое соединение V получают гидрированием IV водородом на палладиевом катализаторе. В качестве катализатора гидрирования использовали свежеприготовленную 20 %-ную водную пасту гидроокиси палладия. Гидрирование проводили при комнатной температуре с использованием метилового спирта в качестве растворителя.

Литература

Разработанный способ синтеза V позволяет получать целевое соединение (и промежуточные пептиды) с высоким выходом и чистотой 96-98 % без использования хроматографической очистки.

Выводы

В результате проделанной работы разработан и внедрен в производство новый способ получения тетрапептида Н-РЬе-0-Тгр-Ьу8(е-Вос)-ТЬг-ОМе как ключевого фрагмента синтеза аналогов соматостатина. Предложенный способ отличается простотой, минимальным количеством стадий и позволяет получать целевой тетрапептид в полупромышленном масштабе.

1. Смирнова Л И, Устинкина С.В., Смирнова А.П. и др. Средство, обладающее противоопухолевым действием. Патент РФ RU2254139. 20.06.2005. Бюл. №17.

2. Смирнова А.П., Сушилина Л.П., Устинкина С.В. и др. Синтез и противоопухолевая активность ци-фетрелина при пероральном введении // Российский биотерапевтический журнал. - 2009. - Т. 8, № 2.

- С. 18.

3. Gu K., Bi L, Zhao M et. al. Toward the development of chemoprevention agents. Part 1: Design, synthesis, and anti-inflammatory activities of a new class of 2,5-disubstituted-dioxacycloalkanes // Bioorg. Med. Chem. - 2007. - 15(14). - P. 4775-99.

4. Kovacs J, Kisfaludy L., Ceprini M.Q. On the Optical Purity of Peptide Active Esters Prepared by N,N'-Dicyclohexylcarbodiimide and «Complexes» of N,N'-Dicyclohexylcarbodiimide-Pentachlorophenol and N,N'-Dicyclohexylcarbodiimide-Pentafluorophenol // J. Am. Chem. Soc. - 1967. - 89(1). - P. 183-4.

5. Nicolaides E.D., De Wald H.A., Westland R.D. et. al. Potential antiviral agents. Carbobenzoxy di- and tripeptides active against measles and herpes viruses // J. Med. Chem. - 1968. - 11(1). - P. 74-9.

6. Wiejak S., MasiukiewiczE., Rzeszotarska B. A Large Scale Synthesis of Mono- and Di-urethane Derivatives of Lysine // Chem. Pharm. Bull. - 1999. - 47(10). - P. 1489-90.

НАУЧНЫЕ ЖУРНАЛЫ РОНЦ ИМ. Н.Н. БЛОХИНА РАМН

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.