Разработка жидкофазного метода синтеза трипторелина на основе полупродуктов производства бусерелина Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»



ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ РАЗРАБОТКА ЖИДКОФАЗНОГО МЕТОДА... 55

УДК 615.357.012:577.112.6.08 А.Н. Балаев1, В.Н. Осипов2, К.А. Охманович1, В.Е. Фёдоров1 РАЗРАБОТКА ЖИДКОФАЗНОГО МЕТОДА СИНТЕЗА ТРИПТОРЕЛИНА НА ОСНОВЕ ПОЛУПРОДУКТОВ ПРОИЗВОДСТВА БУСЕРЕЛИНА :ЗАО «Фарм-Синтез», Москва 2ФБГУ «РОНЦ им. Н.Н Блохина» РАМН, Москва Контактная информация Осипов Василий Николаевич, старший научный сотрудник лаборатории химического синтеза НИИ экспериментальной диагностики и терапии опухолей адрес: 115478, Москва, Каширское шоссе, 24; тел. +7(916)412-61-43 e-mail: [email protected] Статья поступила 30.04.2013, принята к печати 01.11.2013. Резюме Разработан новый эффективный жидкофазный метод синтеза агониста гонадотропин-рилизинг гормона трипторелина на основе полупродуктов действующего производства бусерелина. Предложенный способ синтеза позволяет организовать совместный процесс производства двух препаратов с использованием в их синтезе одинаковых пептидных блоков. Ключевые слова: агонисты гонадотропина, бусерелин, трипторелин, синтез.

A.N. Balaev1, V.N. Osipov2, K.A. Okhmanovich1, V.E. Fedorov1 DEVELOPMENT OF LIQUID-PHASE METHOD FOR TRIPTORELIN SYNTHESIS BASED ON BUSERELIN PRODUCTION 1CJSC «PHARM-SINTEZ», Moscow 2N.N. Blokhin «RCRC» RAMS, Moscow Abstract A new effective liquid-phase method for preparation of triptorelin (agonist of gonadotropin-releasing hormone) was developed. This method based on buserelin production and allows the collaborative process of producing two products using the same peptide blocks. Key words: gonadotropin agonists, buserelin, triptorelin, synthesis. Введение Бусерелин [4] отличается заменой 6 аминокислоты (Gly) на защищённую (D-Ser(tert-Bu), а 10 Гипоталамические рилизинг-факторы - эн- (Gly) на остаток этиламина: догенные пептидные соединения, оказывающие pyroGlu1-His2-Trp3-Ser4-Tyr5-D-Ser6(tert-Bu)-Leu7-Arg8-Pro9-N10HEt [1] влияние на высвобождение гипофизом гонадотроп- ных гормонов. В трипторелине [2] заменена только 6 ами- В настоящее время в медицинских целях ис- нокислота - Gly на D-Trp: пользуют не природные рилизинг-факторы (из гипоталамуса животных), а их синтетические аналоги pyroGlu1-His2-Trp3-Ser4-Tyr5-D-Trp6-Leu7-Arg8-Pro9-Gly10NH2 [2] - пептиды с частично изменённой последовательностью аминокислот в пептидной цепочке природ- Следует отметить, что результатами такой ного гормона. замены аминокислотных остатков в молекуле при- Природный гонадотропин-рилизинг гормон родного гормона являются более выраженное срод-(ГнРГ, гонадорелин, гонадолиберин) представляет ство к рецепторам ГнРГ и более продолжительный собой пептид, состоящий из 10 аминокислот (дека- период полураспада, поэтому аналоги имеют более пептид): сильное и продолжительное действие, чем природный ГнРГ. Так, активность трипторелина превыша-pyroGlu1-His2-Trp3-Ser4-Tyr5-Gly6-Leu7-Arg8-Pro9-Gly10NH2 ет активность эндогенного ГнРГ в 36 раз, бусерелина - в 50 раз [3]. Установлено, что аминокислоты в положениях При этом их период полураспада в организ-2 и3 ответственны за биологическую активность. ме 90-120 мин, что намного превышает значение Аминокислоты в положениях 1; 6 и 10 имеют струк- для природного гормона. Оба препарата использу-турную конфигурацию, необходимую для связывания ют при лечении гормонозависимых опухолей: с рецепторами клеток гипофиза. Замещение амино- предстательной железы, молочной железы; эндо-кислот в положениях 6 и 10 позволило создать синте- метриозе; фиброме матки. тические агонисты ГнРГ [3]. Целью настоящей работы является разработ- В мировой клинической практике известно ка нового жидкофазного способа получения трип-более 12 лекарственных препаратов - синтетических торелина на основе действующего производства аналогов ГнРГ. В России в качестве противоопухо- бусерелина (ЗАО «Фарм-Синтез») с использовани-левых средств зарегистрированы 4 препарата из этой ем одинаковых пептидных блоков для наиболее группы: гозерелин, лейпрорелин, трипторелин и бу- эффективного совместного получения целевых серелин. препаратов.

№ 4/том 12/2013 РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ

Материалы и методы

Аналитическую ВЭЖХ проводили на хроматографе фирмы Shimadzu (Япония). Колонка: Grom-Sil 12J ODS-4HE, 5|im, 250-4,6 mm.

Условия:

A - вода + фосфатный буфер pH 3,

B - ацетонитрил, градиент 20 % B (0 мин) 60 % B (10 мин) 70 % B (15 мин) 70 %

B (30 мин).

ТСХ проводили на пластинах Merck TLC Silica gel 60 F254, проявление - нингидрином. Спектры ЯМР получены на приборе Bruker AM-360 (рабочая частота 360,13 МГц). В качестве растворителя применяли CDCl3, DMSO-d6. Угол удельного вращения измеряли на автоматическом поляриметре "OTAGO" AP-300. Пептидные блоки 3; 6; 12 и 15 использовали с действующего производства бу-серелина. Boc-D-TrpOPfp получен по стандартной методике [1].

Boc-Pro-GlyOMe (17)

К раствору 86,1 г (0,4 моль) 3 и 40,4 г (0,4 моль) N-метилморфолина в 430 мл диметилформа-мида при -25°C прикапывают 54,6 г (0,4 моль) изо-бутилхлорформиата. Выдерживают реакционную массу 15 мин, добавляют 40,4 г (0,4 моль) N-метилморфолина и затем присыпают 49,8 г (0,4 моль) 16. Перемешивают реакционную массу 2 часа при -25°C, затем 10 ч при +5°C.

Реакционную массу выливают в 2 л насыщенного водного раствора NaCl, нейтрализуют NaHCO3 до pH 7,5-8 и экстрагируют 2 раза по 700 мл этилацетата. Объединённые органические слои последовательно промывают: 100 мл насыщенного раствора NaHCO3, 100 мл 10% водного раствора лимонной кислоты и 100 мл насыщенного раствора NaCl. Отгоняют растворитель в вакууме, остаток растирают с 150 мл петролейного эфира, фильтруют и сушат на воздухе. Получают 93,4 г (81,5%) белого кристаллического 17. Содержание основного вещества 97,2% (ВЭЖХ). ТСХ: хлороформ/метиловый спирт/AcOH 15/1/0,1. Rf(3)=0,35, Rf(17)=0,81. [a]D24=-18,09 (2% р-р, метиловый спирт). Т.пл. 77-78°C.

Спектр ЯМР 1H (CDCl3, 5, м.д.): 1,44 (s, 9H, 3CH3), 1,80-1,92 (m, 2H, y-H[Pro]), 2,41-2,54 (m, 2H, P-H[Pro]), 3,14-3,21 (m, 2H, 5-H[Pro]), 3,61 (s, 3H, COOCH3), 3,80-3,84 (m, 1H, a-H[Pro]), 3,95 (d, 2H, CH^Gly]), 5,63 (bs, 1H, NH).

Boc-Pro-GlyNH2 (18)

Через раствор 74,5 г (0,26 моль) 17 в 50 мл метилового спирта при 5°C барботируют аммиак до полного насыщения. Выдерживают при комнатной температуре 7-8 ч. Отгоняют метанол в вакууме, маслообразный остаток промывают 150 мл петро-лейного эфира, добавляют 200 мл диэтилового эфира и перемешивают до кристаллизации. Фильтруют, промывают 2 раза по 50 мл диэтилового эфира и сушат на воздухе. Получают 63,7 г (90,3%) 18. Содержание основного вещества 98,7% (ВЭЖХ). ТСХ: хлороформ/метиловый спирт/AcOH 15/1/0,1. Rf(17)=0,81, Rf(18)=0,32. [a]D26=-39,45 (2% р-р, метиловый спирт). Т.пл. 135-136°C. Спектр ЯМР :H (CDCl3, 5, м.д.): 1,42 (s, 9H, 3CH3), 1,79-2,02 (m, 2H, Y-H[Pro]), 2,05-2,17 (m, 2H, P-H[Pro]), 3,34-3,52 (m, 2H, 5-H[Pro]), 3,74-4,08 (m, 2H, CH2[Gly]), 4,21 (t, 1H, a-H[Pro]), 5,83 (bs, 1H, NH) , 7,01 (bs, 1H, NH^ , 7,33 (bs, 1H, NH2).

H-Pro-GlyNH2 гидрохлорид (19)

К суспензии 42,3 г (0,156 моль) 18 в 100 мл диоксана при интенсивном перемешивании приливают 130 мл охлаждённого до 5°С 12 %-ного раствора хлороводорода в диоксане. Перемешивают реакционную массу 2 ч при комнатной температуре. Отфильтровывают осадок, промывают 2 раза по 150 мл диэтилового эфира и сушат в вакууме. Получают 31,9 г (98,4%) белого порошка 19.

Содержание основного вещества 97,2% (ВЭЖХ). ТСХ: хлороформ/метиловый спирт/AcOH 1/1/0,1. Rf(18)=0,85, Rf(19)=0,18. [а]„27=-30,32 (5% р-р, метиловый спирт). Спектр ЯМР H (d6-DMSO, 5, м.д.): 1,78-1,92 (m, 2H+1H, y-H[Pro]+ß-H[Pro]), 2,15-2,36 (m, 1H, ß-H[Pro]), 3,09-3,24 (m, 2H, 5-H[Pro]), 3,63-3,77 (m, 2H, CH^Gly]), 4,13-4,31 (m, 1H, a-H[Pro]), 8,87 (bs, 1H, CONH), 8,49+10,34 (2bs, 2H, CONH2). ESMS, m/z (I%): 172,0 [M+H]+ (100), 343,0 [2M+H]+ (62,5).

Boc-Leu-Arg-Pro-GlyNH2 гидрохлорид (20)

К раствору 84,8 г (0,2 моль) 6, 45,7 г (0,22 моль) 19 и 33,7 г (0,22 моль) моногидрата N-гидроксибензотриазола в 800 мл диметилформами-да добавляют при комнатной температуре и перемешивании 50,5 г (0,5 моль) N-метилморфолина. Затем при 0-+5°С прикапывают раствор 49,5 г (0,24 моль) дициклогексилкарбодиимида в 200 мл диме-тилформамида. Перемешивают 1 час при +5°С и затем 12 ч при комнатной температуре. Отфильтровывают осадок, разбавляют реакционную массу 3 л воды, насыщают NaCl и экстрагируют 3 л бутило -вого спирта. Органическую фазу упаривают в вакууме. Остаток затирают с 500 мл диэтилового эфира, фильтруют, промывают на фильтре 2 раза по 400 мл диэтилового эфира и сушат в вакууме. Получают 104,2 г (90,3%) белого аморфного порошка 20. Содержание основного вещества 89,4% (ВЭЖХ). ТСХ: хлороформ/метиловый спирт/AcOH 1/1/0.1. Rf(19)=0,19, Rf(6)=0,54, Rf(20)=0,59. ESMS, m/z (I%): 541,3 [M+H]+ (100), 1081,2 [2M+H]+ (0,3).

H-Leu-Arg-Pro-GlyNH2 дигидрохлорид (21)

К суспензии 100 г (0,173 моль) 20 в 200 мл диоксана при 10-12°C и интенсивном перемешивании приливают 350 мл 17% раствора хлороводорода в диоксане. Нагревают до комнатной температуры, после чего перемешивают ещё 2 ч. Осадок фильтруют, промывают на фильтре 200 мл диэти-лового эфира и сушат в вакууме. Неочищенный 21 растворяют в 200 мл метилового спирта и высаживают 2 л ацетона. Фильтруют выпавший продукт, промывают на фильтре 300 мл ацетона и сушат в вакууме (40-45°C, 2 мм рт. ст.). Получают 67,9 г (76,4%) белого аморфного порошка 21. Содержание основного вещества 90,7% (ВЭЖХ). ТСХ: хлороформ/метиловый спирт/AcOH 1/1/0,1. Rf(20)=0,57, Rf(21)=0,11. ESMS, m/z (I%): 441,2 [M+H]+ (100).

Boc-D-Trp-Leu-Arg-Pro-GlyNH2 гидрохлорид (23)

К раствору 26,7 г (0,052 моль) 21 и 11,5 г (0,114 моль) N-метилморфолина в 210 мл диметил-формамида при 5°C и перемешивании небольшими порциями присыпают 27 г (0,057 моль) 22 и затем 0,5 г имидазола. Перемешивают реакционную массу 1 ч при 5-10°C и затем 5 ч при комнатной температуре . Реакционную массу выливают в 1 л воды, экстрагируют 2 раза по 300 мл этилацетата, водный слой насыщают NaCl и экстрагируют 300 мл бутилового спирта. Бутиловый спирт отгоняют в вакууме. Остаток затирают с 300 мл этилацетата. Фильт-

ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ РАЗРАБОТКА ЖИДКОФАЗНОГО МЕТОДА... 1 57

руют продукт, промывают его 150 мл этилацетата и сушат на воздухе. Получают 31,4 г (79,1%) белого аморфного порошка 23. Содержание основного вещества 86,8% (ВЭЖХ). ТСХ: хлороформ/метиловый спирт/ЛсОИ 1/1/0,1. Rf(21)=0,04, Rf(22)=0,90, Rf(23)=0,42. ESMS, m/z (I%): 727,3 [M+H]+ (100).

H-D-Trp-Leu-Arg-Pro-GlyNH2 бис-трифторацетат (24)

К суспензии 16,2 г (0,021 моль) 23 в 80 мл хлористого метилена, 3 мл анизола и 3 мл 2-меркаптоэтанола при 0°С и при перемешивании приливают 80 мл трифторуксусной кислоты. Перемешивают реакционную массу 2 ч при температуре 0-. Выливают реакционную массу в 200 мл диэти-лового эфира, выпавший осадок 24 отфильтровывают, промывают его 2 раза по 100 мл диэтилового эфира и сушат в вакууме. Получают 15,5 г (85,4%) белого гигроскопичного порошка 24. Содержание основного вещества 95,6% (ВЭЖХ). ТСХ: хлороформ/метиловый спирт/ЛсОИ 1/1/0,1. Rf(23)=0,42, Rf(24)=0,11. ESMS, m/z (I%): 627,6 [M+H]+ (100).

Z-Ser-Tyr-D-Trp-Leu-Arg-Pro-GlyNH2 трифторацетат (25)

К раствору 16 г (0,0187 моль) 24, 8,3 г (0,0206 моль) 12, 3,5 г (0,0229 моль) моногидрата N-гидроксибензотриазола и 4 г (0,0395 моль) N-метилморфолина в 100 мл диметилформамида при 0°С прикапывают раствор 4,7 г (0,0228 моль) ди-циклогексил-карбодиимида в 20 мл диметилфор-мамида. Перемешивают реакционную массу 2 ч при 0°С и затем 18 ч при +22-24°С. Отфильтровывают осадок, разбавляют реакционную массу 300 мл воды и экстрагируют фильтрат 4 раза по 150 мл этилацетата. Водный слой экстрагируют 400 мл бутилового спирта. Бутанольный экстракт последовательно промывают 100 мл воды, 150 мл насыщенного водного раствора NaHCO3 и снова 100 мл воды. Отгоняют в вакууме бутанол. Маслянистый остаток затирают 2 раза по 200 мл этилацетата, отфильтровывают продукт и сушат его в вакууме. Получают 17,3 г (82,2%) белого гигроскопичного порошка 70. Содержание основного вещества 84,8% (ВЭЖХ). ТСХ: хлороформ/метиловый спирт/ЛсОИ 2/1/0,1. Rf(24)=0,17, Rf(12)=0,74, Rf(25)=0,62. ESMS, m/z (I%): 506,5 [M+2H]2+ (100), 517,3 [M+H+Na]2+ (2,7) , 517,3 [M+H]+ (5,6).

H-Ser-Tyr-D-Trp-Leu-Arg-Pro-GlyNH2 трифторацетат (26)

В 230 мл метилового спирта растворяют 15 г (0,013 моль) 25, добавляют 0,5 г 20%-ной водной пасты гидрооксида палладия. При перемешивании и температуре +22-24°С барботируют водород в течение 7 ч. Разбавляют реакционную массу 300 мл воды, перемешивают 30 мин и фильтруют. Фильтрат промывают 300 мл этилацетата, к водному слою добавляют ещё 250 мл воды и экстрагируют его 2 раза по 150 мл бутилового спирта. Органический слой упаривают в вакууме. Остаток затирают в этилацетате (3 раза по 150 мл), фильтруют и сушат его в вакууме. Получают 12 г (90,8%) серого аморфного порошка 26. Содержание основного вещества 82,5% (ВЭЖХ). ТСХ: хлороформ/метиловый спирт/AcOH 1/1/0,1. Rf(25)=0,78, Rf(26)=0,21. ESMS, m/z (I%): 439,5 [M+2H]2+ (100), 877,5 [M+H]+ (5,4).

Трипторелин ацетат (2)

К раствору 17,1 г (0,017 моль) 26, 10,5 г (0,021 моль) 15, 3,8 г (0,025 моль) моногидрата N-гидроксибензотриазола и 2,85 г (0,028 моль) N-

метилморфолина в 100 мл диметилформамида при комнатной температуре в течение 4 ч при перемешивании прикапывают раствор 4,3 г (0,021 моль) дициклогексилкарбодиимида в 100 мл диметилфор-мамида. Перемешивают реакционную массу в течение 12 ч (20°С). Отфильтровывают осадок и упаривают фильтрат в вакууме. Оставшееся масло растворяют в 400 мл воды, добавляют 5 мл уксусной кислоты, фильтруют и хроматографически очищают. Содержание 2 в жидкой фазе 11,7 г (ВЭЖХ).

Препаративную ВЭЖХ проводили на хроматографе фирмы Shimadzu. Насос ВЭЖХ Shimadzu LC-8A, расход до 150 мл в минуту. Спектрофото-метрический детектор Shimadzu SPD-20A, колонка 250*50 mm, сорбент VYDAK С18 120Л 10мкм производитель Grace.

Буферные растворы: A - 4,67% изопропило-вого спирта, 0,1% лимонной кислоты, концентрированный водный раствор аммиака до pH 6; B -35% изопропилового спирта, 0,1% лимонной кислоты, концентрированный водный раствор аммиака до pH 6. Условия градиента: 0 мин - 0% B, 100 мин - 0% B, 250 мин - 15% B, 290 мин - 30% B.

Выделенные целевые фракции наносят на колонку, промывают раствором ацетата аммония (2 г/л), затем водным раствором, содержащим 3% изопропилового спирта и 0,3% уксусной кислоты, и затем смывают ацетат 2 с колонки 30% водным изопропиловым спиртом, содержащим 0,1% уксусной кислоты. Упаривают раствор ацетата 2 до 1/3 объёма в вакууме на роторном испарителе (<40°С) и лиофилизуют. Получают 10,3 г белого, объёмного, аморфного порошка ацетата 2. Содержание основного вещества 98,4% (ВЭЖХ). [a]D26= -71,95 (1% р-р, уксусная кислота); ESMS, m/z (I%): 656,6 [M+2H] (100), 1311,4 [M+H]+ (0,2).

Результаты и обсуждение

Действующее производство бусерелина (ЗАО "Фарм-Синтез") реализовано по схеме:

H ^ BocProNHEt -;

4

HLeuArgProNHEt *2HCl -

- HProNHEt*HCl

5

BocLeuArgOH'HCl 6

- BocLeuArgProNHEt'HCl 7

- Z-D-Ser(tert-Bu)OH 9

Z-D-Ser(tert-Bu)LeuArgProNHEt*HCl -10

ZSerTyrOH

HSerTyr-D-Ser(tert-Bu)LeuArgProNHEt*HCl -14

- H-D-Ser(tert-Bu)LeuArgProNHEt*HCl 11

- ZSerTyr-D-Ser(tert-Bu)LeuArgProNHEt*HCl 13

pyroGluHisTrpOH 15

В целях расширения ассортимента выпускаемых отечественных фармацевтических субстанций было решено отработать схему синтеза трипторелина с учётом готовых полупродуктов используемых в производстве бусерелина.

Анализ нескольких возможных схем синтеза и промежуточные эксперименты показали, что вещества 3; 6; 12 и 15 (на обеих схемах выделены в рамке) могут быть использованы в совместном производстве.

Разработанная схема синтеза включает 10 стадий и позволяет получать трипторелин с минимальными затратами:

3

8

12

"it

HGlyOMe*HCl I 16

BocLeuArgOH*HCl

BocProGlyOMe ■ 17

- BocProGlyNH,-»- HProGlyNH2*HCl

18 19 I

HLeuArgProGlyNH2*2HCl ■ 21

BocLeuArgProGlyNH2*HCl 20

-Boc-D-TrpOPfp

22

Boc-D-TrpLeuArgProGlyNH2*HCl —— H-D-TrpLeuArgProGlyNH2 *2CF3COOH

ZSerTyrOH -

HSerTyr-D-TrpLeuArgProGlyNH2*CF3COOH -— ZSerTyr-D-TrpLeuArgProGlyNH2*CF3COOH

26 I I-1 25

-\ pyroGluHisTrpOH

Конденсация защищённого пролина (3) и метилового эфира глицина (16) с использованием изобутилхлорформиата даёт защищённый дипептид (17). При последующем амонолизе раствором аммиака в метаноле и дебокированием раствором хлороводорода в диоксане образуется дипептид (19). Дальнейшая конденсация 19 и 6 с использованием карбодиимидного метода (ИОЫ, дициклогек-силкарбодиимид) диметилформамиде при 0-5°С приводит к тетрапептиду (20).

Дебокирование 20 (раствор хлороводорода в диоксане) и реакция образующегося 21 с пентофтор-фениловом эфиром защищённого Б-триптофана даёт 23. Использование на этой стадии каталитического количества имидазола позволяет существенно уменьшить время реакции и повысить чистоту 23. Снятие защитной группы с 23 проводят с использованием триф-торуксусной кислоты. Конденсацией образующегося 24 и ¿-защищённого дипептида 12 (ИОБ^ дициклогексил-карбодиимид) получают гептапептид 25. Сырец трипто-релина (2) получают по реакции деблокированного 26 (полученного гидрированием 25 водородом в присутствии гидрооксида палладия) и трипептида 15. Очистку сырца 2 и замену противоиона трифторацетата на ацетат выполняют с использованием препаративной ВЭЖХ.

Выводы

В результате проделанной работы разработан новый способ получения трипторелина на базе действующего производства бусерелина. Предложенный способ позволяет получать целевой продукт с чистотой >98%, легко масштабируемый, и на его основе может быть организовано совместное производство двух фармацевтических субстанций.

6

23

24

12

15

2

Литература

1. Гершкович А.А., Киберев В.К. Синтезы пептидов. Реагенты и методы. Киев: Наукова думка, 1987. - С. 62-3.

2. Heyns Chris F. Triptorelin in the treatment of prostate cancer: clinical efficacy and tolerability // American Journal of Cancer - 2005. - 4(3). - P. 169-83.

3. Loumaye Ernest, Naor Zvi, Catt Kevin J. Binding affinity and biological activity of gonadotropin-releasing hormone agonists in isolated pituitary cells // Endocrinology. - 1982. - 111(3). - P. 730-6.

4. Mohr K. Buserelin // Deutsche Medizinische Wochenschrift. - 1994. - 119(14). - P. 523-4.

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ

ГнРГ - гонадотропин-рилизинг гормон

НАУЧНЫЕ ЖУРНАЛЫ РОНЦ ИМ. H.H. БЛОХИНА РАМН