CC BY
42
УДК 637.5.039(045)
Получение рекомбинантной металлопротеазы для использования в мясной промышленности
М.Ю. Минаев, канд. техн. наук; А.А. Махова; В.А. Пчелкина, канд. техн. наук ФнЦ пищевых систем им. в.м. Горбатова ран, москва
Реферат
В статье рассматривается получение рекомбинантной протеазы, применение которой перспективно в пищевой промышленности для обработки мясного сырья с целью умягчения. Была создана «food-grade» конструкция на основе Pichia pastoris с высоким уровнем экспрессии в ней чужеродного гена пептидазы М9 Aeromonas salmonicida. Было проведено успешное клонирование гена пептидазы М9 длиной 2748 bp в вектор pPic9K. На электрофореграмме белков культуральной жидкости, полученной от рекомбинантых клонов Pichia pastoris со вставкой гена пептидазы М9 Aeromonas salmonicida, выделен целевой белок в 120 кДа. При посеве клонов Pichia pastoris на молочный агар наблюдали отсутствие общей протеолитиче-ской активности. В результате проведенных гистологических исследований обработанных образцов мясного сырья было установлено влияние полученной от рекомбинантных клонов культуральной жидкости на структуру соединительной ткани. В результате проведенной структурно-механической оценки установлено, что максимальное напряжение резания обработанных культуральной жидкостью образцов уменьшилось на 20,1% по сравнению с контролем. Полученный рекомбинант-ный фермент мог бы найти применение в пищевой промышленности для умягчения мясного сырья с высоким содержанием коллагена.
Ключевые слова
Aeromonas salmonicida; биомодификация; рекомбинантная протеаза; Pichia pastoris; семейство М9; умягчение мяса Цитирование
Минаев М. Ю., Махова А.А., Пчелкина В.А. (2019) Получение рекомбинантной металлопротеазы для использования в мясной промышленности // Пищевая промышленность. 2019. № 1. С. 64-68.
Production of recombinant metalloprotease of use for meat industry
M.Yu. Minaev, Candidate of Technical Sciences; A.A. Mahova; V.A. Pchelkina, Candidate of Technical Sciences Federal Research Center for Food Systems of RAS after Gorbatov, Moscow
Abstracts
Enzymatic modification of meat with a high content of connective tissue is an effective means, empowering its use in the technology of meat products. Microbial enzymes have been extensively investigated as meat tenderizers. Compliance with safety requirements in terms of forecasting the development of various risks is an essential for the use of these drugs in the food industry. The method of producing recombinant protease as a potential candidate for applications on meat tenderization was described in the article. A metalloprotease M9 gene was cloned from the Aeromonas salmonicida (2748 bp) and expressed in Pichia pastoris. The molecular mass of the recombinant protein was estimated to be 120 kDa by SDS-PAGE. The enzyme exhibited the specific substrate specificity to collagen and gelatin. It did not show any detectable activity towards casein. Histological analyses of the control and enzyme treated beef samples showed degradation intramuscular connective tissue, suggesting its effectiveness on meat tenderization. As a result of the shear force assessment it was established that the maximum cutting stress of samples treated with the culture liquid decreased by 20.1 % compared to the control. Thus, recombinant protease M9 may be a potential candidate for several industrial applications.
Key words
Aeromonas salmonicida; bio modification; meat tenderization; M9 family; recombinant protease; Pichia pastoris Citation
Minaev M.Yu., Mahova A.A.; Pchelkina V.A. (2019) Production of recombinant metalloprotease of use for meat industry // Food processing industry = Pisshevaya promyshlennost. 2019. № 1. P. 64-68.
Ферментная модификация мясного сырья с высоким содержанием соединительной ткани является перспективным направлением, позволяющим расширить возможности его использования в технологии мясопродуктов. Несмотря на имеющийся научный опыт обработки мясного сырья протеолитическими ферментами растительного, животного и микробного происхождения, подобные работы ведутся и в настоящее время. Так, например, для получения гидролизованных форм мясного сырья с высоким содержанием коллагена активно используются ферментные препараты щелочных протеаз Bacillus licheniformis и Acremonium chry-sogenum. Критериями выбора протеаз в таких случаях часто являются оптимумы действия используемых ферментов, которые должны коррелировать с основными технологическими параметрами мясного производства (рН, температура) [1].
необходимым условием применения ферментов микробного происхождения в пищевой промышленности является соответствие требованиям безопасности в части прогнозирования развития различных рисков. Европейское агентство по безопасности пищевых продуктов (EFSA) постоянно обновляет перечень микроорганизмов-продуцентов ферментов, имеющих статус «Квалифицирован предположительно как безопасный -Qualified Presumption of Safety (QPS)». При этом статус QPS обозначает факт того, что данный штамм прошел необходимую оценку его безопасности. К безусловно безопасным микроорганизмам относят многие молочнокислые бактерии (Lactococcus и Lactobacillus), бифидобак-терии, дрожжи [2].
Кроме этого, при обработке мясного сырья с высоким содержанием соединительной ткани стоит обращать внимание на специфичность действия используемых ферментов. Многие протеазы могут интенсивно катализировать гидролиз целого ряда белков (в том числе белков мышечной ткани) - обладать общим про-теолитическим действием, но при этом слабо воздействовать на белки соединительной ткани. Поэтому не каждая про-теаза, расщепляющая коллаген, может называться коллагеназой. Согласно современной классификации, представленной в базе данных MEROPS, ферменты подразделяются на кланы и семейства. Особый интерес для исследования колла-геназной активности представляет семейство металлопротеаз М9, типичными продуцентами которого являются патогенные микроорганизмы Clostridium histolyticum и Vibrio alginolyticus. Именно они спо-
собны воздействовать на связь «Gly-Pro» (глицин-пролин) - специфическую аминокислотную последовательность коллагена [3].
Аминокислотная последовательность, кодирующая пептидазы М9, несет специфический HEXXH - мотив -цинк-связывающую последовательность, в которой два гистидиновых цинковых лиганда хелатируют каталитический центр.
Аналогичный мотив HEYTH содержит пептидаза M9 Aeromonas salmonicida, по доменной организации схожая с пеп-тидазой Vibrio класса II. Пептидазы Vibrio класса II имеют цинк-связывающий HEYTH - мотив, не содержат C-концевой последовательности и не обладают способностью гидролизовать казеин. VMC-колагеназа Vibrio mimicus - представитель вибриозной пептидазы II класса подсемейства М9А, способная гидроли-зовать коллагены I, II, III типов, желатин, синтетические субстраты: Cbz-GPLGP, CbzGPGGPA [4].
Проблемой использования в качестве продуцентов специфичных пептидаз диких штаммов является выработка ими целого пула ферментов, близкой по молекулярной массе к искомому, что делает очистку и получение нужного фермента невозможным. За рубежом запатентована технология получения высокоочищен-ной коллагеназы Clostridium hystolyticum, которая составляет основу медицинского препарата для лечения контрактуры Дю-пюитрена [5]. Фермент отличается высокой степенью очистки, однако стоимость его получения делает невозможным применение данной технологии в пищевой промышленности.
Поэтому перспективным направлением в этой области является создание реком-бинантных протеаз. Для этого необходимо создавать генетическую конструкцию, состоящую из food-grade штамма хозяина-продуцента перспективных протеаз и секретируемого food-grade вектора со встроенным в него геном, кодирующим необходимую протеазу. При этом встраивание в ДНК реципиентной клетки чужеродного гена не должно быть сопряжено с наличием генетического риска получения штаммов с содержанием токсичных или аллергенных для человека белков или других опасных соединений; приобретением свойств патогенности и антибиотикорезистентности.
Основным инструментом пищевой биотехнологии для производства реком-бинантных ферментов становятся клетки дрожжей [6]. Множество протеаз было успешно экспрессировано в Pichia pasto-
ris, в зарубежных научных публикациях сообщается о получении рекомбинантно-го химозина буйвола для использования при производстве сыра моцарелла [7, 8]. Для применения в мясной промышленности, в частности, для умягчения мясного сырья была получена внеклеточная аспартатная протеаза из Rhizomucor miehei, экспрессируемая в Pichia pastoris, протеолитической активность которой составила 3480.4 U/mL [9].
Цель работы - создание food-grade конструкции на основе Pichia pastoris с высоким уровнем экспрессии в ней чужеродного гена пептидазы М9 Aero-monas salmonicida и оценка воздействия рекомбинантной пептидазы на мясное сырье.
Объекты исследований: ген пептидазы M9 (ASA_3723) Aeromonas salmonicida (штамм лабораторной коллекции, выделен с поверхности мясного сырья), векторная плазмида pPic9K (Invitrogen, USA), компетентные клетки E. eoli DH5 (Invitrogen, USA), компетентные клетки Pichia pastoris GS115 (Invitrogen, USA), культуральная жидкость (КЖ) от реком-бинантных клонов Pichia pastoris, образцы говяжьей голяшки.
Анализ нуклеотидной последовательности, кодирующей ген пепти-дазы Aeromonas salmonicida проводили с помощью базы данных NCBI (https: //www.ncbi.nlm.nih.gov).
Для анализа и сравнения нуклеотид-ных последовательностей использовали программу «BLAST», поиск гомологичных последовательностей осуществляли в базе данных GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/).
Биоинформационный анализ последовательностей кодирующих генов пеп-тидаз Aeromonas salmonicida, дизайн праймеров проводили с помощью программы OligoAnalyzer Tool (https: // eu.idtdna.com/ calc/analyzer).
ПЦР-амплификация ДНК
ПЦР проводили на приборе АНК-32 (Синтол, Россия) в реакционной смеси, содержащей HS-Fuzz буфер, dNTP, 5'- и 3' -концевые праймеры, ДНК, и HS-Fuzz ДНК-полимеразу (NEB, England).
Праймеры, используемые для получения гена протеазы Aeromonas salmonicida:
AACAATCTGGGTACAAGGT-форвард праймер;
TCAGTGGGAGGAGTCGTTG-реверс праймер.
Скрининг рекомбинантных клонов проводили с помощью ПЦР-метода с использованием стандартных праймеров для вектора pPic9K.
Препаративное выделение фрагмента ДНК
Для выделения и очистки целевых ПЦР-продуктов использовали набор для выделения ДНК из агарозного геля и реакционных смесей Cleanup Standart (Евроген, Россия). Выделение выполняли согласно протоколу производителя.
Безлигазное клонирование
Клонирование полученных ПЦР фрагментов в векторную плазмиду pPic9K проводили с использованием безли-газной системы для клонирования In - FusionTM CF Dry-Down PCR Cloning Kit фирмы (Clontech Laboratories Inc, USA).
Электопорация Pichia pastoris
Проводили электропорацию на элек-тропораторе при следующих параметрах: Woltage = 1500, Capasitance = 25, Resistance = 200.
Анализ рекомбинантных клонов Pichia pastoris на продукцию целевых белков
Каждый раз перед добавлением метанола отбирали пробы для электрофоре-тического анализа.
Электрофорез в полиакриламидном геле
Электрофорез выполнялся по стандартной методике (Laemmli, 1970). Для белкового электрофореза использовался 12% PAAG (полиакриламидный гель).
Клетки осаждали, удаляли супернатант в случае анализа внутриклеточных белков, ресуспендировали в воде и добавляли буфер для белкового электрофореза (Samples Buffer). Для белков жидкой фракции к аликвоте добавляли Samples Buffer. После прогревания на кипящей водяной бане в течение 5 мин наносили образец на SDS-PAAG. Использовали стандартные маркеры молекулярных весов.
Общую протеолитическую активность клонов Pichia pastoris определяли на молочном агаре: в чашках Петри с застывшей молочной средой (10%) вырезали лунки. В одну из лунок вносили 50 мкл опытного образца - культуральную жидкость ре-
комбинантной Pichia pastoris, в другую -50 мкл контрольного образца - раствор трипсина (2,5 мг / мл). Инкубирование проводили 24 ч при 23 °С. Протеолитическую активность определяли по появлению светлых зон вокруг лунок.
Гистологическая оценка мясного сырья, обработанного КЖ от клонов Pichia pastoris. Опытные образцы обрабатывали культуральной жидкостью путем шприцевания (Опыт № 1) и погружения (Опыт № 2), экспозиция -24 ч при 8 °С. Контрольный образец мяса обрабатывали физиологическим раствором. Далее все образцы фиксировали в 10 %-ном забуфе-ренном растворе формалина в течение 72 ч. Срезы толщиной 16 мкм изготавливали на криостате «MIKROM -HM525» (Thermo Scientific), монтировали на стекла Menzel-Glaser (Thermo Scientific) и окрашивали гематоксилином Эрлиха и 1 %-ным водно-спиртовым раствором эозина («БиоВитрум»), далее заключали в глицерин-желатин. Изучение гистологических препаратов осуществляли на световом микроскопе «Axiolmaiger A1» (Carl Zeiss, Германия) с применением компьютерной системы анализа изображений «AxioVision 4.7.1.0».
Структурно-механическую оценку мясного сырья, обработанного КЖ от клонов Pichia pastoris, проводили с помощью прибора Shimadzu AGS-X по стандартному методу Уорнера и Брацлера (Goodson et al. (2002). Опытные образцы обрабатывали культуральной жидкостью путем шприцевания (Опыт № 1) и погружения (Опыт № 2), экспозиция - 24 ч при 18 °С. Контрольный образец мяса обрабаты-
Рис. 2. Оценка протеолитической активности культуральной жидкости рекомбинантных клонов Pichia pastoris на молочном агаре; «К» - контроль - 0, 0025 % раствор трипсина, «О» - опыт -КЖ-Pichia pastoris
вали физиологическим раствором. После экспозиции часть образцов варили при 70 °С в течение 3 ч. В термически необработанных образцах определяли величину напряжения сдвига, в термически обработанных - величину напряжения среза. Величину напряжения сдвига и напряжения среза проводили в 4-х повторах.
Статистическую обработку числовых данных проводили с помощью программы StatPlus. Высчитывали среднее значение и среднее квадратичное отклонение (STD=V[(X (x-x)2)/n]) величин напряжения резания и напряжения сдвига образцов мясного сырья.
Биоинформационный анализ, оптимизация гена пептидазы M9 Aeromonas salmonicida (ASA_3723).
Генно-инженерные манипуляции часто связаны с использованием векторных систем E. coli; в данной работе был использован челночный вектор, способный реплицироваться как в бактериальных, так и в дрожжевых клетках. В качестве вектора для экспрессии в Pichia pastoris была использована плазмида pPic9K. Эта плазмида содержит репликон pBR322, позволяющий ей автономно реплицироваться в клетках E. coli. Благодаря этому первичный отбор рекомбинантных клонов производится в E. coli. В Pichia pastoris эта плазмида поддерживается за счет интеграции в хромосому. Экспрессия клонированных в этой плаз-миде генов находится под контролем AOXl-промотора, эффективно индуцируемого метанолом. Для обеспечения эффективной секреции продукта вектор содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую сигнальный пептид альфа фактора. Область HIS4 - селективный маркер для выделения рекомбинант-ных штамов Pichia pastoris. Полилинкер векторной молекулы содержит удобные сайты для клонирования.
Было проведено клонирование гена пептидазы М9 Aeromonas salmonicida в вектор pPic9K.
Анализ рекомбинантных клонов Pichia pastoris на продукцию целевого белка методом гель-электрофореза представлен на рис. 1.
На треке 2 видим слабовыраженные полосы на 120 кДа (предположительно целевой белок - коллагеназа), 100 кДа, 80 кДа, 40 кДа. Неяркая полоса на 120 кДа свидетельствуют о малом количестве целевого белка, нижние полосы - низкомолекулярные пептидные примеси, вероятно, продукты секреции клетки-хозяина.
Наработка малого количества белка может быть связана с длиной гена пеп-
1 у Ш 130 " -ж " 4
Рис. 1. Электрофореграмма культуральной жидкости
Результаты структурно-механической оценки образцов мяса
Параметр Образец Контроль Опыт №1 Опыт №2
Максимальное напряжение сдвига, Н/м2 Голяшка в сыром виде 690242,6x ± 2,31671b 413544,9 ± 1,18845 63 9077,86 ± 2,53349
Максимальное напряжение резания, Н/м2 Голяшка после термической обработки 184,97±2,9245 149,355±4,6533 145,175±2,06103
X - среднее значение; b - среднее квадратичное отклонение.
тидазы M9 Aeromonas salmonicida, которая составляет 2748 b. p. Это довольно крупный для генетических манипуляций фрагмент: его сложно безошибочно амплифицировать из ДНК хозяина, получить в больших количествах, очистить и удачно вставить в вектор.
Оценка общей протеолитической активности на молочном агаре. Проте-олитическую активность определяли по появлению светлых зон вокруг лунок. на рис. 2 видно, что вокруг лунки с контрольным образцом образовалась зона просветления в 9 мм. Вокруг лунки с опытным образцом не было зоны просветления, что могло свидетельствовать об отсутствии общей протеолитичсекой активности рекомбинантного фермента.
Результаты гистологического исследования образцов мяса представлены на рис. 3-5.
в контрольном образце мышечные волокна характеризовались спрямленной формой, хорошо выраженной поперечной исчерченностью и достаточно плотной компоновкой в пучке. Ядра овальной формы располагались непосредственно под сарколеммой волокна. Волнистые соединительнотканные прослойки пе-римизия плотно прилегали к пучкам мышечных волокон. Ядра в соединительнотканных прослойках отчетливо выявлялись на препарате (рис. 3).
В образце Опыт № 1 (рис. 4) изменения в структуре тканей преимущественно выявлялись в толще образца в местах непосредственного введения препарата.
Отмечено отслоение перимизия от мышечных пучков, его разрыхление. Также выявлена дезинтеграция коллагеновых фибрилл, их истончение и частичная фрагментация.
Изменения в структуре тканей образца Опыт № 2 по сравнению с контролем аналогичны изменениям в образце Опыт № 1, но более выражены в поверхностных слоях, где отметили некоторую гомогенизацию фибриллярных структур (рис. 5). В глубоких слоях, в основном, наблюдали разрыхление соединительнотканных прослоек.
Таким образом, в результате проведенных гистологических исследований установлено влияние полученной КЖ на структуру соединительной ткани мясного сырья, что в дальнейшем может быть использовано в мясной промышленности.
Результаты структурно-механи-ческой оценки образцов мяса, обработанных КЖ от клонов Pichia pastoris, представлены в таблице.
Максимальное напряжение сдвига при проколе термически необработанного образца Опыт № 1 на 40 % ниже контрольного образца. После термической обработки образца Опыт № 1, его максимальное напряжение резания стало на 19% ниже контрольного.
максимальное напряжение сдвига при проколе термически необработанного образца Опыт № 2 на 7,5 % ниже контрольного образца. После термической обработки образца Опыт № 2, его
максимальное напряжение резания стало на 21,2% ниже контрольного.
Во всех случаях Опыт № 1 и Опыт № 2 были мягче контрольного образца. Образец Опыт № 1 в сыром виде был заметно мягче контрольного образца и Опыта № 2. Однако после термической обработки средние значения величины напряжения резания опытных образцов были примерно одинаковы (149,355 H/ м2 и 145,175 H/м2).
В результате проведенной структурно-механической оценки установлено, что оба способа обработки мясного сырья рекомбинантным ферментом (как шприцевание, так и замачивание) подходят для его умягчения. В среднем максимальное напряжение резания термически обработанных опытных образцов уменьшилось на 20,1% по сравнению с контролем.
В статье Sun, Q., Chen, F описан способ получения рекомбинантной аспартатной протеазы из Rhizomucor miehei, экспрес-сируемой в Pichia pastoris, способной найти применение в умягчении мясного сырья [7]. Полученный фермент обладал высокой общей протеолитической активностью (3480.4 U/ mL). Было отмечено эффективное использование рекомби-нантной аспартатной протеазы в умягчении свинины, соединительной ткани в которой сравнительно мало. Можно предположить, что тендеризация мяса в этом случае достигается деградацией мышечных белков, а не белков соединительной ткани.
Проведено успешное клонирование последовательности гена пептидазы М9 Aeromonas salmonicida.
Созданный нами рекомбинант-ный штамм Pichia pastoris, продуцент рекомбинантной пептидазы м9 Aeromonas salmonicida, обладает ферментативной активностью в отношении коллагена, основного компонента соединительной ткани мяса. В результате проведенных гистологических исследований образцов мясного сырья установлено влияние полученной КЖ на структуру соединительной ткани. В результате проведенной структурно-механической оценки установлено, что максимальное напряжение резания обработанных КЖ образцов уменьшилось на 20,1 % по сравнению с контролем.
Данное свойство трансформанта наряду с его безопасностью может быть использовано для регистрации полученного фермента в пищевой промышленности в качестве умяг-чителя мясного сырья с высоким содержанием коллагена.
Планируется дальнейшая работа по биоинформационной оптимизации гена-вставки, подбору оптимальных условий культивирования и индукции рекомбинантных клонов с целью увеличения выхода реком-бинантного белка.
ЛИТЕРАТУРА
1.Титов, Е.И. О микроструктуре кол-лагенсодержащего сырья, модифицированного щелочными протеиназа-ми/Е.И. Титов [и др.] // Мясная индустрия. - 2017. - № 8. - С. 36-38.
2. Багрянцева, О. В. Шатров Г. Н. О необходимости внесения изменений в законодательство Евразийского Экономического Союза в области нормирования ферментных препаратов/О.В. Баггрянцева, Г.Н. Шатров. - Сборник научных трудов ГНУ ВНИИПБ «Перспективные ферментные препараты и биотехнологические процессы в технологиях продуктов питания и кормов», 2014. - 101-108 с.
3. Минаев, М. Ю. Новые подходы к выбору пептидаз семейств М9 и М4 для ферментативной обработки мясного и коллагенсодержащего сырья/ М. Ю. Минаев, А.А. Еремцова // Все о мясе. - 2016. - № 2. - С. 30-33.
4. Zhang, Y. Z. Diversity, structures, and collagen-degrading mechanisms of bacterial collagenolytic proteases/ Y.Z. Zhang [et al.]. - Applied and Environmental Microbiology, 2015. - 81 (18):6098-107. DOI: 10.1128/ AEM. 00883-15.
5. Brazzelli, M. Collagenase clostrid-ium histolyticum for the treatment of Dupuytren's contracture: systematic review and economic evaluation/M. Brazzelli [et al.] Health Technology Assessment, 2015. - 19 (90):1-202. DOI: 10.3310/hta19900.
6. Арыкбаева, А. Б. Дрожжи Sac-charomyces cerevisiae в генетической инженерии/А.Б. Арыкбаева. - Сборник «Альманах научных работ молодых ученых Университета ИТМО» в 5 т., 2016. -88-91 с.
7. Sun, Q. A novel aspartic protease from Rhizomucor miehei expressed in Pichia pastoris and its application on meat tenderization and preparation of turtle peptides/ Q. Sun [et al.]. -Food Chemistry. - 2017, DOI: 10.1016/j. foodchem. 2017.10.113.
8. Bekhit A. A. Exogenous proteases for meat tenderization/ A. A. Bekhit [et al.] Critical reviews in food science and nutrition, 2014. - 54 (8):1012-31. DOI: 10.1080/10408398.2011.623247.
9. Tyagi, A. Expression of buffalo chymosin in Pichia pastoris for application in mozzarella cheese/A. Tyagi [et al.] // LWT - Food Science and Technology, 2017. -DOI: 10.1016/j. lwt. 2017.06.033.
REFERENCES
1. Titov, E.I. O mikrostrukture kol-lagensoderzhashhego syr'ja, modificiro-vannogo shhelochnymi proteinaza-mi/E.I. Titov [i dr.] // Mjasnaja indus-trija. - 2017. - № 8. - S. 36-38.
2. Bagrjanceva, O. V. Shatrov G. N. O neobhodimosti vnesenija izmenenij v
zakonodatel'stvo Evrazijskogo Jekonomi-cheskogo Sojuza v oblasti normirovanija fermentnyh preparatov / 0. V. Baggr-janceva, G.N. Shatrov. - Sbornik nauch-nyh trudov GNU VNIIPB «Perspektivnye fermentnye preparaty i biotehnolog-icheskie processy v tehnologijah produk-tov pitanija i kormov», 2014. - 101108 s.
3. Minaev, M.Ju. Novye podhody k vy-boru peptidaz semejstv M9 i M4 dlja fer-mentativnoj obrabotki mjasnogo i kolla-gensoderzhashhego syrja/M.Ju. Minaev, A.A. Eremcova // Vse o mjase. - 2016. -№ 2. - S. 30-33.
4. Zhang, Y. Z. Diversity, structures, and collagen-degrading mechanisms of bacterial collagenolytic proteas-es/ Y. Z. Zhang [et al.]. - Applied and Environmental Microbiology, 2015. - 81 (18):6098-107. DOI: 10.1128/ AEM. 00883-15.
5. Brazzelli, M. Collagenase clostrid-ium histolyticum for the treatment of Dupuytren's contracture: systematic review and economic evaluation/M. Brazzelli [et al.] Health Technology Assessment, 2015. - 19 (90):1-202. DOI: 10.3310/hta19900.
6. Arykbaeva, A. B. Drozhzhi Saccha-romyces cerevisiae v geneticheskoj in-zhenerii/ A. B. Arykbaeva. - Sbornik «Al'manah nauchnyh rabot molodyh uchenyh Universiteta ITM0» v 5 t., 2016. - 88-91 s.
7. Sun, Q. A novel aspartic protease from Rhizomucor miehei expressed in Pi-chia pastoris and its application on meat tenderization and preparation of turtle peptides/Q. Sun [et al.]. - Food Chemistry. - 2017, DOI: 10.1016/j. foodchem. 2017.10.113.
8. Bekhit A.A. Exogenous proteases for meat tenderization/ A. A. Bekhit [et al.] Critical reviews in food science and nutrition, 2014. - 54 (8):1012-31. DOI: 10.1080/10408398.2011. 623247.
9. Tyagi, A. Expression of buffalo chy-mosin in Pichia pastoris for application in mozzarella cheese/A. Tyagi [et al.] // LWT - Food Science and Technology, 2017. - DOI: 10.1016/j. lwt. 2017.06.033.
Авторы
Минаев Михаил Юрьевич, канд. техн. наук,
Махова Анжелика Александровна,
Пчелкина Виктория Александровна, канд. техн. наук
Федеральный научный центр пищевых систем им. В.М. Горбатова РАН,
109316, Москва, ул. Талалихина, д. 26, mminaev@inbox.ru
Authors
Minaev Mihail Yur'evich, Candidate of Technical Sciences, Mahova Anzhelika Aleksandrovna,
Pchelkina Viktoriya Aleksandrovna, Candidate of Technical Sciences Federal Research Center for Food Systems of RAS after Gorbatov, 26, Tala-likhina str., Moscow, 109316, mminaev@inbox.ru
