CC BY
27
УДК 637.5.03:577.15 Табл. 2. Ил. 2. Библ. 6
НОВЫЕ ПОДХОДЫ К ВЫБОРУ ПЕПТИДАЗ СЕМЕЙСТВ М9 И М4 ДЛЯ ФЕРМЕНТАТИВНОЙ ОБРАБОТКИ МЯСНОГО И КОЛЛАГЕНСОДЕРЖАЩЕГО СЫРЬЯ
Минаев М.Ю., канд. техн. наук, Еремцова А.А.
ФГБНУ «ВНИИМП им. В.М. Горбатова»
NEW ASPECTS OF THE CHOICE OF PEPTIDASES FAMILIES M4 AND M9 FOR THE ENZYMATIC TREATMENT OF RAW MEAT AND COLLAGEN-RICH RAW MEAT
Minaev M.Y., Eremtsova A.A.
The Gorbatov's All-Russian Meat Research Institute
Ключевые слова:
мясное сырье, коллагенсодержащее сырье, пептидазы семейства М4, пептидазы семейства М9
Реферат.
В данной статье рассмотрены новые подходы к выбору протеолитических ферментов для ферментативной обработки мясного и коллагенсодержащего сырья с целью его умягчения. Проанализированы принципы и особенности действия пептидаз разных семейств в отношении молекулы коллагена, подробно рассмотрены семейства пептидаз М9 и М4. На основе изученных свойств были предложены варианты использования данных ферментов в обработке мясного и коллагенсодержащего сырья.
В формировании пищевых качеств мяса нежность и сочность занимают далеко не последнее место. Нежность мяса, как известно, определяют структурные особенности мышечной ткани (актиново-миозиновый эффект), соединительной ткани (фоновый эффект) и жировой ткани (наличие мраморности). Актино-во-миозиновый эффект связан с длиной саркомера и диаметром мышечного волокна, фоновый эффект - с общим количеством и распределением соединительной ткани между мышечными волокнами [4, 5].
Мясо - в основном мышечный белок. Мышцы представляют собой пучки белковых волокон, которые собраны в блоки, окруженные соединительной тканью. Соединительная ткань тоже содержит структурные белки, в частности коллаген и эластин. Мясо можно сделать более мягким, предварительно расщепив некоторые из белков соединительной ткани и некоторые из мышечных волокон [3].
Другими словами, учитывая структурные особенности, влияющие на нежность мяса, стоит искать комплексный подход воздействия, как на мышечную, так и на соединительную ткань.
Keywords:
raw meat, collagen-rich raw meat, peptidase family M4, peptidase family M9
Summary.
This article discusses new aspects in the choice of proteolytic enzymes for the fermentation of collagen-rich raw meat and to increase its tenderness. We have analyzed the principles and characterize actions of different peptidase families against the collagen molecules, peptidase family M9 and M4 are described in detail. Based on the investigated properties of the selected proteases, we were offered the options of using these enzymes in the processing of meat and collagen-rich raw material.
Поиск новых методов повышения нежности и сочности мяса является актуальным и необходимым для создания продуктов, удовлетворяющих по вкусовым характеристикам потребности потребителя.
В настоящее время для умягчения мясного сырья перед реализацией или производства мясопродуктов зачастую применяют механическое воздействие -массирование, которое, в первую очередь, используется для интенсификации процессов распределения рассола. Основное воздействие при такой обработке приходится на мышечную часть куска, при этом происходит разрыхление поверхности, разрыв мышечных волокон и выход миофибриллярных белков [2].
Альтернативой механической обработки является ферментативная обработка мясного сырья. Имеется много научных публикаций по применению ферментных препаратов животного, растительного, микробного происхождения для умягчения мясного сырья [1]. Однако возникает ряд трудностей внедрения их в технологический процесс.
Основным критерием применения таких ферментов в пищевой промышленности должно быть
соответствие требованиям безопасности - рекомендации GRAS (Generally Recognized As Safe). Перечень GRAS - ферментов представлен в основном протеаза-ми растительного происхождения (бромелаин, фицин, папаин), которые крайне дороги в производстве, из-за чего не находят широкого применения.
Кроме этого оптимумы действия используемых ферментов должны коррелировать с основными технологическими параметрами мясного производства (рН и температура мяса при выдержке в посоле и термообработке, концентрация ферментных препаратов, вводимых в продукт, продолжительность обработки ферментами, присутствие активаторов и ингибиторов используемых ферментов). Изменение даже одного из параметров может повлиять на эффективность используемых ферментов и в корне изменить желаемый результат, сделав мясо еще более жестким.
Более того важную роль играет специфичность действия ферментных препаратов. Так как мясное сырье является поликомпонентным объектом, соотношение мышечной и соединительной тканей в котором нестабильно и зависит от вида мяса, физиологических и анатомических особенностей животного, от которого оно было получено, возникает необходимость использования ферментов разнонаправленного действия в зависимости от целевого субстрата мясного сырья, будь то мышечная или соединительная ткани.
Зачастую применяемые в технологии мяса проте-азы главным образом оказывают действие на белки мышечной ткани, а не на белки соединительной. Это можно объяснить общими правилами действия ферментов на субстрат. Как известно, растворимость в воде субстратов и их площадь соприкосновения с ферментом напрямую связана со скоростью ферментации - чем больше площадь соприкосновения, тем быстрее
Рисунок 1. Зависимость скорости реакции от площади соприкосновения фермента и субстрата.
а) Зависимость скорости реакции от концентрации субстрата;
б) Зависимость скорости реакции от концентрации фермента.
А так как мясо представлено в основном мышечной тканью, состав которой богат растворимыми глобулярными белками, действие на них протеаз будет первоочередным.
Учитывая вышеизложенное, делаем вывод, что при выборе протеаз и оценки их действия на сырье, следует обращать внимание на оптимум действия ферментов, природу их активаторов и ингибиторов, а
также специфичность действия к пептидным связям при гидролизе животных белков.
Коллаген - основной компонент соединительной ткани, нерастворимый белок и самый распространённый протеин в организме млекопитающих, составляет от 25 до 35% протеинов общего количества. Это фибриллярный белок, обеспечивающий прочность и эластичность соединительной ткани. При этом он является трудноусвояемым белком и одним из факторов, влияющих на жесткость мяса. Аминокислотный состав коллагена представлен в таблице 1.
Таблица 1.
Аминокислотный состав коллагена
Аминокислота Содержание аминокислоты в коллагене, %
Глицин 33,50
Пролин 11,82
Аланин 10,93
Гидроксипролин 9,21
Глутаминовая кислота 7,19
Аспартовая кислота 4,90
Аргинин 4,45
Серин 3,87
Лейцин 2,66
Лизин 2,60
Валин 2,02
Треонин 1,87
Изолейцин 1,36
Фенилаланин 1,31
Гидроксилизин 0,76
Метионин 0,61
Тирозин 0,52
Гистидин 0,42
Теоретически, в природе существует огромное количество протеаз, способных действовать в отношении молекулы коллагена, и это не только широко известные пептидазы. В таблице 2 приведена специфичность протеаз в отношении аминокислот, составляющих основу коллагеновой цепи.
Пептидазы, проявляющие наибольшую специфику именно в данном участке (той или иной аминокислоте). Строго-специфичные ферменты выделены красным цветом [6].
Как видно из таблицы, протеазы, способные расщеплять описанные субстраты, относятся к разным кланам и семействам (сериновые, цистеиновые, карбоксильные, металлопротеазы) соответственно имеют разное эволюционное становление, разные ингибиторы и активаторы и оптимальные условия действия.
Так, ингибиторами сериновых протеаз, к которым относятся животные - пепсин и химотрипсин, микробные - субтилизины АВ и ВР, могут выступать внуктриклеточные ферменты мяса. Цистеиновые -папаин, бромелаин, фицин - чувствительны к окислителям, карбоксильные (пепсин) подавляются природными ингибиторами типа пепстатина, кроме того
основное их действие направлено на фенилаланин и тирозин, аминокислоты, содержание которых в коллагене незначительное. В этом отношении оптимальные
Таблица 2.
Действие пептидаз на основные аминокислоты коллагена
ферменты по количеству ингибиторов - металлопро-теазы, подавление которых происходит преимущественно только в присутствии EDTA и EGTA.
Делаем вывод, что действие протеаз на единичные аминокислоты коллагена (даже если эти аминокислоты составляют его основу), либо на последовательности аминокислот, характерные не только для коллагена, но и ряда других белков, нельзя считать истинным коллагенолитическим действием. Другими словами, такие протеазы могут интенсивно катализировать гидролиз целого ряда белков (в том числе белков мышечной ткани) - обладать общим протеолитическим действием, но при этом слабо воздействовать на белки соединительной ткани.
Как известно, специфичной последовательностью коллагеновой нити является «G-X-Y», где «G» - глицин, «X» - зачастую пролин; «Y» - гидроксипролин, либо одна из гидрофобных кислот. Именно по связи «G-Pro» (глицин-пролин) режут только металло-протеазы семейства М9 - типичными продуцентами которых являются Clostridium histolyticum и Vibrio alginolyticus. При этом последовательность «G-Pro» (глицин-пролин) не свойственна другим белкам, в т. ч. миозину, и встречается гораздо реже, поэтому в результате действия на «мультибелковый» субстрат, будет наблюдаться направленное действие на коллаген и второстепенное на мышечную ткань.
В коллагеновой цепи 1 типа встречаются единичные вставки Leu (лейцина) - 2,66%. А это именно та кислота, по которой режут пептидазы семейства термолизина (М4-пептидазы). Теоретически, как и многие другие пептидазы, они способны действовать в отношении молекулы коллагена. Однако будут обладать низкой специфичностью по отношению к молекуле коллагена из-за низкой встречаемости ключевой аминокислоты.
Проанализировав возможные сайты гидролиза пептидаз семейства М9 и М4, было отмечено, что пептидазы семейства М4 способны активно расщеплять белки мышечной ткани с глубиной гидролиза вплоть до низкомолекулярных пептидов (рисунок 2).
При этом пептидазы семейства М9 гидролизовать белки мышечной ткани не будут из-за отсутствия сайтов узнавания. Противоположную картину наблюдаем при анализе действия данных протеаз на цепь коллагена: в данном случае специфичными по отношению к последовательностям коллагена выступают исключительно пептидазы семейства М9. Из-за частой встречаемости последовательности «G-Pro» (глицин-пролин) в молекуле коллагена и особенности действия протеаз семейства М9 именно в этом участке, в результате гидролиза могут получаться относительно низкомолекулярные гидролизаты коллагена.
Был сделан вывод, что данные свойства ферментов могли бы найти широкое применение в мясном производстве, как в умягчении мясного, так и колла-генсодержащего сырья. Так, пептидазы семейства М9, способные действовать исключительно в отношении молекулы коллагена целесообразно применять для
Субстрат Характеристики*
(аминокислота Пептидазы
коллагена, по которой режет пептидаза) (согласно международной классификации*) Клан Семейство
type 4 prepilin peptidase 1 (A24.001) AD A24
coxsackievirus-type picornain 3C (C03.011) PA C3
ubiquitinyl hydrolase-L3 (С12.003) CA C12
ubiquitin-specific peptidase 5 (С19.001) CA C19
ubiquitin-specific peptidase 4 (C19.010) CA C19
ubiquitin-specific peptidase 7 (C19.016) CA C19
usp1 (C19.022) CA C19
Gly (Глицин) bacteriocin-processing peptidase (C39.001) CA C39
SENP1 peptidase (C48.002) CE C48
SENP6 peptidase (C48.004) CE C48
SENP2 peptidase (C48.007) CE C48
SENP5 peptidase (C48.008) CE C48
autophagin-1 (C54.003) CA CS4
sortase A (Staphylococcus-type) (C60.001) CL C60
otubain-1 (C65.001) CA C6S
bacterial collagenase H (M09.003) MA M9
Staphylolysin (M23.002) MO M24
renin (A01.007) AA A1
equine infectious anaemia virus AA A2
retropepsin (A02.004)
sortase A (Staphylococcus-type) (C60.001) CL C60
equine infectious anaemia virus retropepsin (A002.004) AA A2
bacterial collagenase H (M09.003) MA M9
Pro Xaa-Pro dipeptidase (bacteria-type) (M24.003) MG M24
(Пролин) aminopeptidase P2 (M24.005) MG M24
aminopeptidase P1 (M24.009) MG M24
aminopeptidase P (Streptomyces-type) (M24.033) MG M24
Zmpl peptidase (Clostridium difficile-type) (M34.002) MA M34
poliovirus capsid VP0-type self-cleaving protein (N08.001) NA N8
prolyl tripeptidyl peptidase (S09.017) SC S9
Xaa-Pro dipeptidylpeptidase (S09.073) SC S9
Ala ^ланин) LmaCP1 carboxypeptidase (Leishmania major) and similar (M 32.005) MA M32
cytomegalovirus assemblin (S21.002) SH S21
thermolysin MA M4
candidapepsin SAP6 (A01.064) A1 A
Glu gpr peptidase (A25.001) A2S -
(Глутамино-вая кислота) prohead peptidase gp175 (Pseudomonas aeruginosa phage phiKZ) (S80.001) S80 -
Leu (Лейцин) thermolysin MA M4
*Данные международной базы данных нентидаз Merops (https://merops.sanger.ac.uk/).
1 mssdqemavf geaaPylrks ekerieaqnk E' daktsvfv adPkesfvka tvqsreggkv
61 takteaBT^tv tvkedqvfj nPPkfdkied mammthlhe| vlynlkery aajmiytysg
121 1 fovt.vnPyk F' ■■ y ri aev v tayrgkkrqe aPPjfei (fsisd nayqfiriltdr fcnqsilitge
181 sBHaktvntk rViqyfatia vtgekkkeeP tsgkrnqgtle dqiisanjil ea±gnaktv_L
241 ndnssrfgkf irihfgttgk lasadietyl leksrvtfql kaersyhify qimsnkkPel
301 iemllittnP ydyayvsqge itvPsiddqe slmatdsaie ilgftsderv siykltgavm
361 hyqnlkfkqk qreeqaePdg tovadkaayl q^Qnsadllk alcyPrvkvq nofvtkqqtv
421 eqvynav^^l akavydkrnjJJ tjittvaiiinqql dtkqPrqyfi gvldiagfei fdfnsleqlc
481 inftneklqq ffnhhmfvle qeeykkegie Wefidfgmdl aacleliekj . gifsileee
541 cmfrkatdms fknklyeqhl gksnnfqkPk [kgkaeahf slihyagtvd ynitgj|ldkii
601 kd@ netvv§ JJyqknsvktl allf :дРзад eacggPkkgg kkkgosfqtv salfrenlnk
661 lmtnlrsthP hivrciiPne tktP^§inehe ivlhqirci:0 Jlegiricrk gtPsriiyad
721 fkqrykvlna saiPegqfid skkaseklla sidvdhtqyk fghtkvffka gHlglleemr
781 deklaqlitr tqarcrg^Qa rveyqkmver resifciqyn vrafmnvkhW Pgmklyfkik
841 J lksaetek emanmkeefe ktkeelakse akrkeleekm vtltqekndl qlqvqseada
401 ] ada.eercdj |ikt£k i.q.lea kikevterae deeeina^elt akkrkJedeo selk-kdiddl
9 61 eltlakveke kha.tenkvkn 1 teemaHide tiakltkekk alqeahqqtl ddlqaeedkv
1021 ntltkaktkl eqqvddlegs leqekklrmd lerakrkleg dlklaqestm diendkqqld
1081 eklkkkefem snlqskiede qalamqlqkk ikelqariee leeeieaera srakaekqrs
1141 disrel ее is ei Leeaq^Bt saqiemnkkr eae.i; qkmr rd 1еен1. Lqhea taaalrkkha
1201 dsvaelgeqi dnlqrvkqkl ekeksemkme iddlasnmet vskakgnlek rncraledqls
1261 elktkedeqq rlindlttqr arlqtesgef srqldekdal vsqlsrgkqa ftqqieelkr
1321 qleeeikaks alahal
myosin heavy chain 2x [Bos taurus\
Рисунок 2. Возможные сайты гидролиза белка мышечной ткани (тяжелая цепь миозина) пептидазами семейства М4 и М9
a, f, m, l, i , v - аминокислоты узнавания для пептидаз семейства М4 Fl, gl, ga- высокоспецифичные сайты гидролиза для пептидаз семейства М4 P - низкоспецифичные сайты гидролиза для пептидаз семейства М4 gP - высокоспецифичные сайты гидролиза для пептидаз семейства М9
умягчения мясного сырья, основу которого составляет мышечный белок, при этом действие будет направленно исключительно на прослойки соединительной ткани, не гидролизуя при этом мышечную.
В обработке же коллагенсодержащего сырья, в частности коллагенсодержащих субпродуктов, основу которых составляет нативный коллаген, специфичность фермента не является критичным фактором. Здесь важно частичное умягчение сырья перед термообработкой. Пептидазы семейства термолизина, имеющие хорошую общую протеолитическую активность, могли бы умягчать нативный коллаген.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ:
1. Антипова Л.В., Подвигина Ю.Н., Косенко И.С. Применение ферментативных препаратов в технологии производства мясных изделий // Фундаментальные исследования. - 2008. - № 6. - С. 134-135
2. Патракова И.С., Потипаева Н.Н., Технология производства цельномышечных продуктов с высоким уровнем экономической эффективности // Мясной ряд. - 2013. - № 1.
3. Тейлор Д., Грин Н., Стаут У., Биология в 3-х томах, под ред. Р.Сопера - 3 изд. -. М.: Мир, 2004, с. 89
4. Chris R. Calkins, Ph.D. and Gary Sullivan, University of Nebraska «Adding Enzymes to Improve Beef Tenderness» Beef Facts Product Enhancement, 2007
5. Foegeding, E.A. and D.K. Larick. 1986. Tenderization of beef with bacterial collagenase. Meat Sci. 18: 201-214
6. https://merops.sanger.ac.uk/ (база данных Merops)
Кроме этого, большое значение имеет глубина гидролиза белков - от получения водорастворимой фракции белка, до полипептидов и аминокислот, поэтому отмеченные свойства описанных пептидаз можно использовать и для управления гидролиза белков в зависимости от поставленной цели и изначально заданной длины получаемых гидролизатов.^
© КОНТАКТЫ:
Минаев Михаил Юрьевич a mminaev@inbox.ru
Еремцова Анжелика Александровна a aeremtsova@gmail.com
REFERENCES:
1. Antipova LV, Podvigina YN, Kosenko I.S. The use of enzyme preparations in the production of meat products technology // Basic Research. - 2008. - № 6. - S. 134-135
2. Patrakova IS, Potipaeva NN, production technology whole-muscle products with a high level of economic efficiency // Meat series. - 2013. - № 1
3. D. Taylor, N. Green, William Stout, Biology 3 vols, ed. R.Sop-era - 3rd ed. - M .: Mir, 2004, p.. 89;
4. Chris R. Calkins, Ph.D. and Gary Sullivan, University of Nebraska «Adding Enzymes to Improve Beef Tenderness» Beef Facts Product Enhancement, 2007
5. Foegeding, E.A. and D.K. Larick. 1986. Tenderization of beef with bacterial collagenase. Meat Sci. 18: 201-214
6. https://merops.sanger.ac.uk/ (Merops database)
