Получение рекомбинантного конъюгата пероксидазы хрена с Fab-фрагментом антител с использованием экспрессионной системы Pichia pastoris Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

УДК 57.083.3; 577.112

Получение рекомбинантного конъюгата пероксидазы хрена с Fab-фрагментом антител с использованием экспрессионной системы Pichia pastoris

О. В. Колясников12#, В. Г. Григоренко2*#, А. М. Егоров2, S. Lange3, R. D. Schmid3

'Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, Специализированный

учебно-научный центр, кафедра химии, 121357, Москва, ул. Кременчугская, 11

2Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, химический факультет,

кафедра химической энзимологии, 119991, Москва, Ленинские горы, 1, стр. 3

institute of Technical Biochemistry, University of Stuttgart, Stuttgart, Allmandring, 31, Germany,

70569

*E-mail: [email protected] # Вклад авторов в публикацию равноценен.

Поступила в редакцию 05.05.2011 г.

РЕФЕРАТ Рекомбинантные иммуноконъюгаты ферментов-маркеров с антигенами или антителами обладают рядом преимуществ перед конъюгатами, полученными традиционными методами химического синтеза: они гомогенны по составу, имеют строго определенную стехиометрию и сохраняют функциональную активность как белка-маркера, так и антигена/антитела. На основе челночного вектора pPICZaB нам удалось впервые получить рекомбинантный конъюгат пероксидазы хрена (HRP) с Fаb-фрагментом антитела против атразина. Получена генетическая конструкция, которая позволяет изменять последовательность антительной части путем реклонирования вариабельных частей. Возможно также изменение ферментной части. Иммуноконъюгаты успешно экспрессированы в системе метилотрофных дрожжей РкЫа pаstoris. Наличие у иммуноконъюгатов активности - как ферментативной, так и антигенсвязывающей - подтверждено методом ИФА.

КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА пероксидаза хрена, антитела, рекомбинантные конъюгаты, экспрессия в системе Р. pas.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ЖР - пероксидаза хрена; ИФА - иммуноферментный анализ; БСА - бычий сывороточный альбумин; ПЦР - полимеразная цепная реакция; ТМВ - 3,3’,5,5’-тетраметилбензидин; АБТС -2,2’-азино-бис(3-этилбензотиазолино-6-сульфоновая кислота).

ВВЕДЕНИЕ

Разработка методов ИФА связана с необходимостью получения конъюгатов ферментов-маркеров, таких, как пероксидаза хрена (НИР, [КФ 1.11.1.7]), с антигенами или антителами, в которых антиген или антитело сохраняет иммунологическую активность и не происходит инактивации фермента. Однако все основные подходы, используемые для химического конъюгиро-вания белков и гаптенов, приводят к частичной инактивации ферментов и гетерогенности конъюгатов, что влияет на специфичность и чувствительность иммуноферментного анализа. Методами генной инженерии можно получать рекомбинантные конъюгаты белков с антигенами или антителами. Такие конъюгаты имеют ряд преимуществ - они гомогенны

по составу, имеют стехиометрию 1 : 1 и сохраняют функциональную активность как белка-маркера, так и антигена/антитела, а также воспроизводимость и относительную простоту получения. Рекомбинантные конъюгаты антител со щелочной фосфатазой [1-3], люциферазой [4] и пероксидазой Arthromyces ramosus [5] получены ранее.

Рекомбинантный конъюгат HRP с белком-переносчиком жирных кислот (FABP) [6], полученный нами ранее, экспрессировали в клетках Escherichia coli и использовали в качестве иммунотрейсера при проведении иммуноферментного анализа с целью ранней диагностики инфаркта миокарда.

Функциональная экспрессия рекомбинантного конъюгата HRP и фрагментов антител в E. coli сопря-

жена с рядом трудностей, поскольку в клетках E. coli отсутствует посттрансляционное гликозилирование белков, что приводит к низкой растворимости и агрегации получаемого белка. Эта проблема может быть решена сменой экспрессионной системы. Например, показано, что метилотрофные дрожжи Pichia pastoris более подходят для экспрессии антител, чем клетки E. coli [7, 8].

HRP [9] и фрагменты антител [10] - как в одноцепочечной форме scFv [11, 12], так и в форме Fab [13] - успешно экспрессировали в клетках P. pastoris по отдельности. Более того, с использованием этой экспрессионной системы созданы некоторые иммуноконъюгаты [14-16]. Показано также, что экспрессия генов в системе P. pastoris в секретируемой форме существенно упрощает масштабирование процесса для биотехнологических приложений [17].

Недавний прогресс в функциональной экспрессии HRP и антител в секретируемой форме открывает путь к созданию рекомбинантных конъюгатов HRP с антителами для использования в иммуноанализе. С целью изучения возможностей такого подхода мы впервые получили рекомбинантные конъюгаты HRP с Fab-фрагментами антител против атразина. В этих химерных белках пероксидазная часть объединена с N- и С-концевой частью тяжелой цепи антитела через короткую гибкую линкерную последовательность. Получены универсальные векторы для экспрессии конъюгатов HRP и вариабельных цепей Fab-фрагментов антител (простая замена вариабельной части тяжелой и легкой цепи любого другого антитела с помощью реклонирования по сайтам PstI/BstEII и BamHI/XhoI соответственно) в секре-тируемой форме в клетках P. pastoris. Получен функционально активный конъюгат HRP с Fab (атразин), обладающий антигенсвязывающими свойствами, аналогичными свойствам моноклональных антител, что подтверждено методом одностадийного конкурентного иммуноанализа атразина (IC50 ~ 3 нг/мл).

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Реагенты

Реагенты были приобретены у компаний «Sigma», «Fluka», «Difco» и использовались без дальнейшей очистки. Белковый электрофорез (SDS-PAGE) проводили по стандартной методике с использованием набора белков с низкой молекулярной массой (LMW, «Bio-Rad»). Препаративную работу с ДНК проводили с использованием наборов QIA prep Spin Miniprep Kit и QIAquick Gel extraction Kit («Qiagen», Германия). Использовали ферменты рестрикции и модификации ДНК фирм «New England Biolabs», «Boehringer-Mannheim», «GIBCO-BRL-Life technologies», «MBI».

Олигонуклеотиды для секвенирования и ПЦР заказывали в фирмах «ARK Scientific», «MWG Biotech» или «Interactiva» (Германия).

Обработка и представление результатов

Генно-инженерную часть работы планировали с помощью программы CloneManager (Scientific & Educational Software, Cary, США). Пространственные структуры иммуноконъюгатов были смоделированы и визуализированы в пакете программ InsightII («BioSym Inc.», США) на рабочей станции SGI R4400. Экспериментальные данные подготовлены к публикации с использованием программ, входящих в пакет OpenOffice.org (www.openoffice.org), а также GIMP (GNU Image Manipulation Program).

Микроорганизмы, среды, плазмиды и олигонуклеотиды

Штамм DH5a E. coli использовали для генетических манипуляций, для промежуточной продукции белка - E. coli BL21(DE3) pLysS («Novagen»). Клетки культивировали в среде LB (1% экстракт дрожжей, 1% пептон, 0.5% NaCl), дополненной 25 мг/л зеоцина («Invitrogen»).

Получение компетентных клеток. Клетки E. coli растили в течение ночи до OD600 0.4 - 0.6 в 50 мл среды LB и отделяли от культуральной среды центрифугированием (3500 об/мин, 4оС) в течение 10 мин. Осадок клеток ресуспендировали в буфере TSS (буфер на основе среды LBS, содержащий в 100 мл 10 г ПЭГ-6000, 5 мл DMSO и 0.6 г MgCl2; рН 6.5), выдерживали в течение 1 ч на льду, расфасовывали на аликвоты по 200 мкл и быстро замораживали при -80°С.

Рекомбинантные антитела и их конъюгаты с HRP экспрессировали с использованием P. pastoris X33 («Invitrogen») и челночного вектора pPICZaB («Invitrogen») для клонирования. Сайт NotI мы удаляли с использованием прямых и обратных праймеров (таблица). Для встраивания гена HRP за геном тяжелой цепи антитела и удаления сайтов рестрикции BspCI, ApaI, PstI, BstEII, BglII, XhoI, BamHI, SacI и PvuI использовали метод трехстадийной ПЦР с применением праймеров, также перечисленных в таблице.

Модификация ДНК и трансформация клеток

Для работы с ДНК использовали стандартные процедуры [18]. Клетки E. coli трансформировали, добавляя плазмиды или лигазную смесь к размороженным компетентным клеткам. Клетки P. pastoris трансформировали плазмидами, предварительно линеаризованными по сайту PmeI, методом электропорации.

Культивирование P. pastoris и секреция рекомбинантного конъюгата

Клетки P. pastoris наращивали в среде YPD (1% экстракт дрожжей, 2% пептон, 2% D-глюкоза). Целевой белок синтезировали в среде YP без глюкозы с использованием в качестве индуктора 0.5 об.% метанол. При трансформации клеток P. pastoris использовали среду YPDS (YPD, содержащая 1 М сорбита). Твердая среда содержала 1.5% бактоагара. Трансформанты выращивали в среде YPDS при 30°С и перемешивании (200 об/мин) до OD600 = 15 ед. Клетки центрифугировали при 3000 g и 4°С, промывали средой YP и доводили OD600 до 1. Индукцию проводили в течение 96 ч, добавляя 0.5 об. % метанола каждые 24 ч. Супернатант концентрировали ультрафильтрацией на мембране («Amicon», 10 кДа).

Синтез конъюгата бычьего сывороточного альбумина (БСА) с атразином

Смесь 1 мг производного атразина (4-хлор-6-(изопропиламино)-1,3,5-триазин-2-(6-амино-капроновой кислоты)) (~ 3.2 мкмоль), 1.7 мг N-гидроксисукцинимида (~15 мкмоль), 6.6 мг П,№-дициклогексилкарбодиимида (~ 30 мкмоль) в 130 мкл 1,4-диоксана перемешивали в течение 8 ч при комнатной температуре. Осадок отделяли центрифугированием на настольной центрифуге (12 000 об/мин, 30 с). Супернатант по каплям добавляли к раствору БСА (2 мг) в 3 мл 0.13 М NaHCO3. Реакционную смесь оставляли в темном месте на 3 ч. Продукт реакции наносили на колонку PD-10, предварительно уравновешенную фосфатно-солевой буферной смесью (PBS), pH 7.5. Собраны и проанализированы спектрофотометрически (при 220 и 260 нм) 16 фракций объемом по 0.5 мл. Фракции с наибольшим отношением OD220/260 объединяли и использовали в дальнейших опытах.

Определение активности рекомбинантного конъюгата методом иммуноферментного анализа

ИФА проводили с использованием планшетов («NUNC» MAXI-SORP) с предварительно сорбированным конъюгатом БСА-атразин (разведение 1 : 100) или БСА (10 мкг/мл) в 10 мМ карбонатном буфере, pH 9.0, при 4°С в течение ночи. Образцы супернатанта культуральной среды P. pastoris последовательно разводили в PBS, добавляли в лунки планшета и инкубировали при 37°С в течение 1 ч. Далее планшет промывали 3 раза PBS, содержащим 0.1% Твин-20 (PBS-Т), добавляли по 50 мкл субстратной смеси TMB (0.6 мг/мл TMB и 8 мМ H2O2 в 0.1 М ацетатном буфере, pH 5). Реакцию останавливали, добавляя 50 мкл 2 М H2SO4, оптическую плотность измеряли при 450 нм.

Конкурентный ИФА для определения атразина

150 мкл калибровочной пробы (0.1, 1.0, 10, 20, 50, 100, 500 нг/мл атразина в PBS-T) и 40 мкл раствора рекомбинантного конъюгата вносили в лунки планшета с предварительно сорбированным конъюгатом БСА-атразин и инкубировали при 37°С в течение 1 ч. Планшет промывали 3 раза PBS-T и добавляли по 50 мкл субстратной смеси TMB. Реакцию останавливали, добавляя 50 мкл 2 М H2SO4, оптическую плотность измеряли при 450 нм.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Рекомбинантные конъюгаты - это химерные белки, в которых объединены структурные части как фермента-маркера, так и антигена/антитела. Использование современных подходов практически решило проблему получения таких рекомбинантных ферментов, как щелочная фосфатаза, Р-галактозидаза, люцифераза, пероксидаза хрена, использующихся в качестве маркеров в методах ИФА. Однако получение рекомбинантных конъюгатов - задача довольно сложная, поскольку на сегодняшний день невозможно достоверно предсказать структуру получаемого конъюгата, поэтому возможна потеря функциональной активности как фермента-маркера, так и антигена из-за неправильного фолдинга двух составных частей химерного белка.

Ранее были получены рекомбинантные конъюгаты, в состав которых входят бактериальные ферменты - Р-галактозидаза и щелочная фосфатаза, легко экспрессируемые в растворимой форме в клетках E. coli, а также некоторые другие ферменты. Основная проблема, связанная с использованием Р-галактозидазы и щелочной фосфатазы в составе конъюгатов, - их тетрамерная и димерная структуры соответственно, что приводит к существенному увеличению аффинности конъюгата по сравнению со свободным антителом. Это особенно нежелательно при разработке конкурентных схем ИФА. В то же время пероксидаза хрена, один из наиболее широко применяемых в ИФА ферментов-маркеров, экспрессируется в клетках E. coli только в форме телец включения, что до недавнего времени затрудняло получение активного фермента.

Достигнутые за последние годы успехи в гетеро-логической экспрессии генов антител в клетках ме-тилотрофных дрожжей P. pastoris открывают перспективы использования этой системы для синтеза конъюгатов пероксидазы хрена с антителами в се-кретируемой растворимой и функционально активной форме.

BglII

BglII

Quick

Change

47

BglII

Рис. 1. Схема получения плазмиды pPIC-Fab.

BglII/BamHI

\7

BglII

PmeI

SfuI

SfuI

Bg|IIN

SacI PstI

BamHI

xhoI

BamHI

EcoRI

PvuI

PstI BstEII

CH

hs-ta9® EcoRI PvuI NotI

PvuI cl 5AOx 1

EcoRI4 , VL alpha xhoI

PstI

SacI SfuI

Дизайн экспрессионного вектора для получения рекомбинантного конъюгата HRP с Fab-фрагментом антител в Р. pastoris

Экспрессионная система для получения рекомбинантных конъюгатов HRP и Fab-фрагментов антител была разработана на основе вектора pPICZaB. Генетическую конструкцию поместили под контроль промотора AOX, содержащего сайт PmeI, для последующей линеаризации и рекомбинации в геном дрожжей. Вектор также содержит сигнальную последовательность а-фактора, необходимую для направленной секреции рекомбинантного белка в культуральную среду. Ген sh Ые обеспечивает устойчивость к зео-цину как клеток Е. соИ, так и Р. pastoris. Предусмотрена возможность введения гексагистидиновой последовательности на С-конце рекомбинантного белка для упрощения выделения и очистки продукта.

В качестве исходного материала были использованы ранее полученные плазмиды pPIC-VCL и pPIC-

VCH [19], содержащие соответствующие фрагменты вариабельных участков легкой и тяжелой цепей моноклонального антитела K4E7 против атразина [20] соответственно (рис. 1). Оба эти вектора содержали сайт МоН после клонированного гена.

Для создания универсальной конструкции мы планировали оставить в векторе только один сайт ЫоИ после гена тяжелой цепи антитела. Мы удалили сайт ЫоН из плазмиды pPIC-VCL с помощью ПЦР в формате QuickChаnge [21] с использованием специальной пары праймеров (таблица). Полученный таким способом вектор назвали pPIC-VCL dNot. Затем фрагмент BgШ/BamШ плазмиды рРІС^СН, содержащий ген тяжелой цепи, клонировали по сайту BgШ плазмиды pPIC-VCL dNot перед геном легкой цепи. Таким образом получили экспрессионный вектор рРІС^аЬ. Схема клонирования приведена на рис. 1.

Полученный универсальный вектор рРІС^аЬ содержит пары сайтов SacI/XhoI и PstI/BstEII для про-

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ Прямые ^) и обратные ^) праймеры, использованные для создания генетических конструкций методом ПЦР

Ген Удаляемый сайт рестрикции Праймер*

HRP NotI R 5'-CGATCGAGCC GCGATGGCCG CCAGC-3'

HRP NotI F 5'-GCTGGCGGCC ATCGCGGCTC GATCG-3'

Fab VCH R 5'-AGGCACAGCT ATAGGTACG-3'

Fab VCH F 5'-TGAGAACCTC CACCGCCGCA GTCGCGCGGT ACG-3'

HRP R 5'-GCGGCGGTGG AGGTTCTCAG TTAACGCCGA CTTTCTACG-3'

HRP PstI, BspCI R 5'-GACCGCATGA AGGCTGCTGT CG-3'

PstI, BspCI F 5'-ACAGCAGCCT TCATGCGGTC G-3'

BstEII, ApaI R 5'-ACTCTAGCCG GCGGTCCCTC-3'

BstEII, ApaI F 5'-GGACCGCCGG CTAGAGTGAC-3'

XhoI R 5'-GAACCGTTCG AGTGATCTAG-3'

XhoI F 5'-AGATCACTCG AACGGTTCAG-3'

SacI R 5'-GATCAGGAGC TGTTCTCATC-3'

SacI F 5'-AACAGCTCCT GATCAGATTG-3'

Fab VCL NotI R 5'-ATCGGTACCT CGATCGAGCC GCGATGG-3'

Fab VCL NotI F 5'-TGAAGTGGTA CGGCGATGC-3'

*Выделены измененные участки нуклеотидной последовательности.

стого клонирования генов тяжелой и легкой цепи, кодирует С-концевой гексагистидиновый фрагмент для упрощения очистки целевого белка металлохе-латной хроматографией, а также сайт NotI для клонирования белка-маркера (такого, как HRP, зеленого флуоресцентного белка (EGFP), люциферазы и др.) на С-конце тяжелой цепи антитела.

Параллельно создан вектор для экспрессии рекомбинантного конъюгата пероксидазы с Fab-фрагментами антител. Для удобства клонирования из исходного гена HRP [22], предварительно клонированного в соответствующем векторе pPIC, мы удалили сайты рестрикции PstI, BstEII, BglII, XhoI, SacI, PvuI, Apal, BamHI и BspCI с использованием ранее перечисленных праймеров (таблица). Одновременно перед геном HRP или после него клонировали фрагменты генов антител. Таким образом с помощью трехстадийной ПЦР получены две генетические конструкции, в которых ген HRP был соединен короткой гибкой линкерной последовательностью (Gly4Ser)3 с последовательностью, кодирующей N-концевую область вариабельной части тяжелой цепи Fab или С-концевую область константной части тяжелой цепи (рис. 2). Следует отметить, что тяжелая цепь была выбрана для клонирования гена маркерного белка, чтобы избежать образования нефункциональных димеров легкой цепи. Генетические конструкции клонировали в векторе pPIc-Fab по сайтам PmeI/BstEII и BstEII/NotI соответственно. Взаимное расположение генов в плазмидах pPIC-Ab-

НИР и рР1С-НИР-АЬ подтверждено рестрикционным анализом и секвенированием.

Экспрессия и очистка рекомбинантных конъюгатов Fab-HRP и HRP-Fab

Клетки Р. pastoris Х33 трансформировали плазмид-ными векторами рР1С-АЬ-НИР и рР1С-НИР-АЬ методом электропорации с эффективностью около 100 клонов на 10 мкг плазмидной ДНК. Экспрессию целевого белка отслеживали по увеличению пероксидаз-ной активности в супернатанте культуральной среды с выходом на плато на 5-й день культивирования. Проанализировано по 10 клонов с каждой конструкцией. Активность НИР в отношении субстрата ТМВ отмечена только у трех клонов из 20 - двух (1.1, 1.2), соответствующих рР1С-АЬ-НИР, и одного (8), соответствующего рР1С-НИР-АЬ, - эти клоны были отобраны для дальнейшего рассмотрения.

Как показано с помощью SDS-PAGE-электро-фореза (данные не представлены) рекомбинантным конъюгатам НИР^СН и VCH-HRP соответствуют размытые полосы, расположенные ниже полосы 100 кДа. Эта размытость полос связана с микрогетерогенностью конъюгатов, обусловленной избыточным гликозилированием, характерным для Р. pas, что коррелирует с нашими и опубликованными данными об экспрессии гена HRP [9]. Мы наблюдали также существенно больший избыток молекул легкой цепи (полоса в районе 25 кДа), чем при экспрессии Fab-фрагмента [19].

BstEII

NotI

PmeI

SfuI

PstI BstEII Рис. 2 Схемы

'VH CH

HRP

his-tag '5AOX1

BglII

PmeI

alpha HRP

BglII

VH CH'

PmeI

PvuI

XhoI'^ alpha

PSacI

клонирования гена HRP в плазмидный вектор рР1С-Fab. Пространственные модели рекомбинантных конъюгатов Fab-HRP и HRP-Fab приведены на левой и правой панели соответственно.

Неожиданным оказалось, что рекомбинантные конъюгаты не проявляли ферментативной активности по отношению к другому субстрату перокси-дазы - АБТС, в отличие от TMB. Известно, что сайт связывания АБТС находится в гидрофобной области на поверхности HRP - в так называемой зоне «Phe patch» [23]. Эта область заметно удалена от активного центра HRP, и можно предположить, что связывание субстрата с ней затруднено по стерическим причинам - вследствие избыточного гликозилирования либо присутствия Fab-фрагмента антитела. Более вероятно первое предположение, так как тот же эффект наблюдается при обоих положениях тяжелой цепи антитела относительно HRP. Более того, сходный эффект мы наблюдали ранее при экспрессии гена HRP в P. pastoris (данные не опубликованы).

Общий выход рекомбинантных конъюгатов составил около 3-10 мг на 1 л культурального супернатанта P. pastoris. Относительно низкий выход секретируемых конъюгатов коррелирует с выходом при экспрессии одного гена HRP. Мы полагаем, что один из факторов, негативно влияющих на выход

секретируемого продукта - избыточное гликозилиро-вание пероксидазной части конъюгата, характерное для клеток Р. pastoris. Для проверки этой гипотезы целесообразным может быть удаление всех сайтов П-гликозилирования в НИР либо замена НИР другим репортерным белком, например EGFP.

Характеристика рекомбинантных конъюгатов методом ИФА

Для подтверждения антигенсвязывающей активности рекомбинантных конъюгатов мы выбрали схему непрямого конкурентного одностадийного ИФА (рис. 3), проводимого на планшетах с иммобилизованным конъюгатом атразина с БСА. Предварительно было изучено связывание рекомбинантных конъюгатов с атразином (рис. 4). Полученные данные подтверждают наличие как каталитической, так и антительной активности у всех трех вариантов. Однако низкая активность у образца НИР^аЬ (клон 8) в сравнении с С-концевым конъюгатом Fab-НИР (клоны 1.1 и 1.2) может свидетельствовать о том, что взаимное пространственное расположение двух

[«•Г

S

Г

PBS-T

V

Рекомбинантный Свободный

конъюгат атразин

Fab-HRP

TMB

Измерение

TMB

H2O2

Измерение

Химический

конъюгат

БСА-атразин

Рис. 3. Схема ИФА для определения атразина.

составных частей химерного белка в этом случае приводит к снижению каталитической активности пероксидазы. Образцы рекомбинантных конъюгатов Fab-HRP (клоны 1.1 и 1.2) обладают сходными характеристиками, и в дальнейшем для определения атразина методом ИФА использовали образец 1.1. Типичный градуировочный график (рис. 5) позволяет определять концентрацию атразина в широком диапазоне - от 0.1 до 50 нг/мл, коэффициент вариации не превышает 8%. 1С50 составляет 3 нг/мл, что хорошо согласуется с результатами определения атразина в двухстадийном ИФА с использованием рекомбинантных Fab-фрагментов того же антитела K411B [19], а также с данными по одноцепочечному миниантителу (scFv), полученному ранее в E. coli [24]. В то же время у исходного моноклонального антитела значение 1С50 составило 0.2 нг/мл [19]. Как и в большинстве подобных случаев, отличие на порядок величины 1С50 от рекомбинантных антител, вероятнее всего, связано с бивалентностью исходного моноклонального антитела.

Таким образом, полученные в настоящей работе рекомбинантные конъюгаты пероксидазы с Fab-фрагментами антитела против атразина обладают функциональной активностью и могут использоваться для определения атразина методом ИФА.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Впервые показана возможность получения рекомбинантного функционально-активного конъюгата HRP в качестве фермента-маркера с Fab-фрагментами антитела против атразина. В представленной работе получены рекомбинантные конъюгаты, в которых Fab-фрагмент антитела соединен как с N-, так и с С-концом фермента-маркера. Оба эти варианта обладают иммунологической и каталитической активностью.

Разведение иммуноконъюгата, п

Рис. 4. Титрование рекомбинантных конъюгатов:

1 - клон Fab-HRP 1.1; 2 - клон Fab-HRP 1.2; 3 - клон ^Р-=аЬ 8.

Концентрация атразина, нг/мл

Рис. 5. Градуировочная кривая для определения атразина методом ИФА с использованием рекомбинантного конъюгата (клон Fab-HRP 1.1).

Функциональная секреция рекомбинантных конъюгатов HRP с Fab-фрагментами антител открывает путь к их широкому применению в ИФА. Полученные нами результаты могут быть использованы для разработки высокочувствительных иммунобиосенсоров нового поколения, основанных на технологии рекомбинантных ДНК. •

Исследование частично финансировалось Германским федеральным министерством науки и технологии (BMBF, грант J№ 0311574).

H2O2

450

А

450

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Rau D., Kramer K., Hock B. // J. Immunoassay Immunochem. 2002. V. 23. № 2. Р 129-143.

2. Tachibana H., Takekoshi M., Cheng X.J., Nakata Y., Takeuchi Т., Ihara S. // Clin. Diagn. Lab. Immunol. 2004. V. 11. № 1.

Р 216-218.

3. Mousli M., Turki I., Kharmachi H., Saadi M., Dellagi K. // J. Virol. Meth. 2007. V. 146. №1-2. Р 246-256.

4. Patel K.G., Ng PP, Kuo C.C., Levy S., Levy R., Swartz J.R.

// Biochem. Biophys. Res. Commun. 2009. V. 390. № 3. Р 971-976.

5. Joosten V., Roelofs M.S., van den Dries N., Goosen Т., Verrips C.T., van den Hondel C.A., Lokman B.C. // J. Biotechnol. 2005. V. 120. № 4. Р 347-359.

6. Grigorenko V., Andreeva I., Borchers T., Spener F., Egorov A. // Anal. Chem. 2001. V. 73. № 6. Р 1134-1139.

7. Robin S., Petrov K., Dintinger T., Kujumdzieva A., Tellier C., Dion M. // Mol. Immunol. 2003. V. 39. № 12. Р 729-738.

8. Cupit P.M., Whyte J.A., Porter A.J., Browne M.J., Holmes S.D., Harris W.J., Cunningham C. // Lett. Appl. Microbiol. 1999.

V. 29. № 5. Р 273-277.

9. Morawski B., Lin Z., Cirino P., Joo H., Bandara G., Arnold F.H. // Protein Eng. 2000. V. 13. № 5. Р 377-384.

10. Pennell C.A., Eldin P. // Res. Immunol. 1998. V. 149. № 6.

Р 599-603.

11. Fischer R., Drossard J., Emans N., Commandeur U., Hellwig S. // Biotechnol. Appl. Biochem. 1999. V. 30. Pt 2. Р 117-112.

12. Freyre F.M., Vazquez J.E., Ayala M., Canaan-Haden L., Bell H., Rodriguez I., Gonzalez A., Cintado A., Gavilondo J.V. // J. Biotechnol. 2000. V. 76. № 2-3. Р 157-163.

13. Takahashi K., Yuuki T., Takai T., Ra C., Okumura K., Yokota T., Okumura Y. // Biosci. Biotechnol. Biochem. 2000. V. 64.

№ 10. P. 2138-2144.

14. Andrade E.V., Albuquerque F.C., Moraes L.M., Brigido M.M., Santos-Silva M.A. // J. Biochem. (Tokyo). 2000. V. 128. № 6.

P 891-895.

15. Luo D., Geng M., Schultes B., Ma J., Xu D.Z., Hamza N., Qi W., Noujaim A.A., Madiyalakan R. // J. Biotechnol. 1998. V. 65. № 2-3. P 225-228.

16. Powers D.B., Amersdorfer P., Poul M., Nielsen U.B., Shalaby M.R., Adams G.P, Weiner L.M., Marks J.D. // J. Immunol. Meth. 2001. V. 251. № 1-2. P 123-135.

17. Hellwig S., Emde F., Raven N.P., Henke M., van der Logt P, Fischer R. // Biotechnol. Bioeng. 2001. V. 74. № 4. P. 344-352.

18. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. Molecular Cloning:

A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor, N.Y.; Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989.

19. Lange S., Schmitt J., Schmid R.D. // J. Immunol. Meth. 2001. V. 255. P 103-114.

20. Giersch T. // J. Agric. Food Chem. 1993. V. 41. № 6. P 1006-1011.

21. Braman J., Papworth C., Greener A. // Methods Mol. Biol. 1996. V. 57. P. 31-44.

22. Grigorenko V., Chubar T., Kapeliuch Yu., Borchers T., Spener F., Egorov A. // Biocatal. Biotransform. 1999. V. 17.

P. 359-397.

23. Ferrari R.P, Traversa S., de Gioia L., Fantucci P, Suriano G., Ghibaudi E.M. // J. Biol. Inorg. Chem. 1999. V. 4. № 1. P 12-20.

24. Kramer K., Hock B. // Food Agric. Immunol. 1996. V. 8. P 97-109.