CC BY
124. Зуева Л.П., Яфаев Р.Х. Эпидемиология. СПб, Фолиант, 2005.
5. Истомин А.В. Региональный мониторинг природно-очаговых инфекций. Псковский регионологический журнал. 2006, 1: 122-135.
6. Коломинов С.И. Эпизоотологические и экологические аспекты распространения и прогнозирования заболеваемости в природных очагах геморрагической лихорадки с почечным синдромом. Автореф. дис. канд. мед. наук. Нижний Новгород, 2012.
7. Малхазова С.М., Семенов В.Ю., Шартова Н.В. и др. Здоровье населения Московской области: медико-географические аспекты. М., ГЕОС, 2010.
8. Медико-географический атлас Смоленской области. Евдокимов С.П., Каманин Е.И., Малхазова С. М. (ред.). Смоленск, 2012.
9. Медико-экологический атлас Воронежской области. Куролап С.А. и др. (ред.). Воронеж, Истоки, 2010.
10. Природноочаговые болезни: медико-географический атлас России. Ватлина ТВ., Котова Т.В., Малхазова С.М. и др. (ред.). М., Географический фак. МГУ им. М.В. Ломоносова, 2017.
11.Трифонова Т.А., Марцев А.А. Оценка и прогнозирование эпидемиологической обстановки по иксодовому клещевому боррелиозу во Владимирской области. Журн. мик-робиол. 2016, 1: 58-62.
Поступила 01.03.18
Контактная информация: Марцев Антон Андреевич, к.б.н.,
600000, Владимир, ул. Горького, 87
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2018
И.В.Яковлева1, Е.А.Курбатова1 , Э.А.Ахматова2, Е.В.Сухова 2, Д.В.Яшунский2, Ю.Е.Цветков2, Н.Э.Нифантьев2, В.В.Свиридов1
ПОЛУЧЕНИЕ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ К ТЕТРАСАХАРИДУ -СИНТЕТИЧЕСКОМУ АНАЛОГУ КАПСУЛЬНОГО ПОЛИСАХАРИДА STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE СЕРОТИПА 14 И ИХ ИММУНОХИМИ-ЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА
'НИИ вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова, 2Институт биоорганической химии им. Н.Д.Зелинского, Москва
Цель. Получение моноклональных антител (МкАт) к синтетическому тетрасахариду — повторяющемуся звену капсульного полисахарида (КП) Streptococcus pneumoniae серо-типа 14 и их иммунохимическая характеристика. Материалы и методы. Для получения гибридомы, продуцирующей МкАт, мышей иммунизировали синтетическим тетрасаха-ридом, конъюгированным с бычьим сывороточным альбумином (БСА) с последующей гибридизацией В-лимфоцитов с клетками мышиной миеломы. Антитела получали in vitro и in vivo. Иммунохимическую характеристику МкАт к тетрасахариду проводили в реакции иммунопреципитации и с помощью различных вариантов постановки ИФА. Результаты. Впервые получена мышиная гибридома, продуцирующая IgM к тетрасахариду. Титр IgM к тетрасахариду в супернатантах клонов и в асцитической жидкости мышей в ИФА, выявленных с помощью биотинилированого тетрасахарида и синтетического КП, адсорбированных на твердой фазе, был выше по сравнению с использованием твердофазного бактериального КП. В реакции ингибирования ИФА МкАт распознавали соответствующие углеводные эпитопы растворенного в жидкой фазе бактериального КП S. pneumoniae серотипа 14 лучше, чем лиганд тетрасахарида и синтетический КП. Заключение. Для выявления МкАт к тетрасахариду в ИФА в качестве твердофазных антигенов предпочительно использовать синтетические аналоги КП. Полученные МкАт к тетрасахариду могут быть использованы для определения представленности протек-тивного тетрасахаридного эпитопа в КП при разработке пневмококковых вакцин.
Журн. микробиол., 2018, № 5, С. 26—31
Ключевые слова: моноклональные антитела, изотип, синтетический тетрасахарид, Streptococcus pneumoniae серотипа 14, капсульный полисахарид
I.V.Yakovleva1, E.A.Kurbatova1, E.A.Akhmatova2, E.V.Sukhova2, D.V.Yashunsky2, Yu.E.Tsvetkov2, NE.Nifantiev2, V.V.Sviridov1
THE PRODUCTION OF MONOCLONAL ANTIBODIES TO TETRASACCHA-RIDE - SYNTHETIC ANALOGUE OF THE CAPSULAR POLYSACCHARIDE OF STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE OF SEROTYPE 14 AND THEIR IMMUNOCHEMICAL CHARACTERIZATION
'Mechnikov Reseach Institute of Vaccines and Sera, 2Zelinsky Institute of Organic Chemistry, Moscow, Russia
Aim. Production of monoclonal antibodies (mAb) to synthetic tetrasaccharide — repeating unit of the capsular polysaccharide (CP) of Streptococcus pneumoniae serotype 14 and their immunochemical characterization. Materials and methods. In order to generate the hybridoma producing mAb, mice were immunized with synthetic tetrasaccharide conjugated with bovine serum albumin (BSA) with following hybridization of B lymphocytes with mouse myeloma cells. Antibodies were obtained in vitro and in vivo. Immunochemical characterization of mAb to tetrasaccharide was carried out using a variety of ELISA options. Results. For the first time obtained mouse hybridoma, producing IgM to tetrasacchride. The IgM titer of anti-tetrasac-charide antibodies in supernatants of clones and in the ascitic fluid of mice in ELISA detected by biotinylated tetrasaccharide and synthetic CP adsorbed on the solid phase was higher compared to the use of bacterial CP as well cover antigen. In the reaction of inhibition of the ELISA, the mAb recognized the corresponding carbohydrate epitopes of the bacterial CP of S. pneumoniae serotype 14 dissolved in the liquid phase better than tetrasaccharide ligand and synthetic CP. Conclusion. To detect mAb to tetrasaccharide in ELISA preferably to use synthetic analogues of the CP as solid phase antigens. The obtained mAb to tetrasaccharide can be used to determine the representation of the protective tetrasaccharide epitope of CP in the development of pneumococ-cal vaccines.
Zh. Mikrobiol. (Moscow), 2018, No. 5, P. 26—31
Key words: monoclonal antibody, isotype, synthetic tetrasaccharide, Streptococcus pneumoniae serotype 14, capsular polysaccharide
ВВЕДЕНИЕ
Пневмококки являются причиной тяжелых инвазивных и неинвазивных заболеваний у детей и взрослыхю. Бактериальная клетка пневмококка окружена полисаха-ридной капсулой. Капсула пневмококка содержит уникальные углеводные повторяющиеся структуры, определяющие серотиповую принадлежность S. pneumoniae. По химической структуре капсульного полисахарида (КП) насчитывают более 90 серотипов S. pneumoniae, примерно 20 из которых имеют наибольшее клиническое значение [5]. Антитела к КП распознают углеводные структуры капсулы пневмококка, что приводит к опсонизации бактерий и защите от пневмококковой инфекции [15]. Получение специфичных и высокоаффинных антител к КП S. pneumoniae, предназначенных для серотиповой идентификации пневмококка и серологических методов исследований в лабораторных условиях, осложняется трудностью выделения и очистки КП от тейхое-вых кислот, липопротеинов, белков наружной мембраны, нуклеиновых кислот и других антигенов микробной клетки и не позволяет охарактеризовать распознаваемые антителами отдельные углеводные эпитопы. Перечисленные недостатки устранимы при использовании синтетических олигосахаридов с известной химической структурой [2]. Современные методы химического синтеза позволяют получить олигосаха-риды различной длины и пространственной ориентации, обладающие способностью индуцировать образование антител, способных распознавать единичные антигенные детерминанты, и точно идентифицировать соответствующие углеводные эпитопы микроорганизма [13]. Синтетические олигосахариды могут быть использованы для получения МкАт [9], направленных к строго определенным углеводным макромолекулам капсулы пневмококка.
S. pneumoniae серотипа 14 относится к немногочисленным серотипам пневмококка, наиболее часто вызывающим заболевания у детей [5, 10]. КП S. pneumoniae серотипа 14 состоит из тетрасахаридных повторяющихся звеньев [2]. В ранее проведенных исследованиях показано, что синтетический тетрасахарид S. pneumoniae серотипа 14, конъюгированный с белком-носителем, индуцировал образование опсонизирующих антител, обладающих протективными свойствами, и обладал преимуществом по сравнению с олигосахаридами другой химической структуры [2, 12, 14].
В настощяем исследовании для получения МкАт мы использовали конъюгированный с БСА тетрасахарид — синтетический аналог повторяющегося звена КП S. pneumoniae серотипа 14.
Цель работы — получение МкАт к синтетическому тетрасахариду — повторяющемуся звену капсульного полисахарида S.pneumoniae серотипа 14 и их иммунохи-мическая характеристика.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В работе использован спейсированный синтетический тетрасахарид (ß—D— Gal—(1^4)—ß—D—Glc—(1^6)—[ß—D—Gal—(1^4)]—ß—D—GlcNAc); а также биомолекулярные системы [7, 8] на его основе — конъюгаты с биотином и c БСА [4]. В соответствии с данными MALDI-TOF анализа БСА-гликоконъюгат содержал в среднем 11 тетрасахаридных лигандов, соединенных с БСА цепью, что было эквивалентно 10% углевода.
Синтетический КП S. pneumoniae серотипа 14, полученный с помощью реакции поликонденсации, представлял собой полимер, состоящий примерно из 10 повторяющихся тетрасахаридных звеньев [11].
Бактериальный КП получен из среды культивирования штамма S. pneumoniae серотипа 14 [1]. Присутствие КП в препарате подтверждено методом ЯМР-спек-троскопии. Препараты высокоочищенных КП были предоставлены д.м.н. проф. Н.Е. Ястребовой (НИИВС им И.И.Мечникова).
Гибридома получена в результате слияния спленоцитов мыши BALB/c, 2-кратно иммунизированной неогликоконъюгатом дозой 10 мкг по углеводу, с клетками мышиной миеломы. Процедуру гибридизации проводили на 3 день после второй иммунизации. Выделение иммунных спленоцитов, слияние, культивирование культур, клонирование и селекцию технологичных клонов проводили по принятому протоколу. В результате проведенных экспериментов отобрана и клонирована гибридома 3G12. Дальнейшие эксперименты проводились с участием трех клонов-продуцентов этой культуры: 3G12/B10, 3G12/D4 и 3G12/G11. Наработку антител проводили in vitro и in vivo. Гамма-глобулиновую фракцию белков, содержащих МкАт заданной специфичности, получали из среды культивирования клонов-продуцентов при 50% насыщении раствором сульфата аммония [3].
Изотип МкАт определяли методом встречной радиальной иммунодиффузии с антиизотипическими сыворотками (IgM, IgG, IgG1, IgG2a, IgGb, IgG3) в геле по Оухтерлони с использованием препаратов у-глобулиновых фракций среды культивирования клонов-продуцентов.
Определение титра антител в супернатанте клонов и в асцитической жидкости мышей проводили с помощью ИФА при использовании в качестве твердофазных антигенов биотинилированного тетрасахарида, адсорбированного на покрытых стрептавиди-ном плашетах Pierce (Termo Scientific, США), а также синтетического и бактериального КП, адсорбированных на плашетах (Biomedicals, Россия) [6]. В качестве вторичных антител использовали конъюгированные с пероксидазой анти-мышиные IgM (Thermo Fisher Scientific, США). Оптическую плотность (ОП) продуктов реакции определяли на ИФА-ридере (iMark, Япония) при длине волны 450 нм. Точкой отсечения отрицательных результатов считали ОП450 < 0,2.
Блокирование связывания МкАт с КП, адсорбированным на твердой фазе, проводили в реакции ингибирования ИФА при использовании в качестве ингибиторов спейсированного тетрасахарида, синтетического и бактериального КП.
Статистическую обработку данных проводили методом Манна-Уитни для независимых выборок при использовании программного обеспечения STATISTICA 10. Данные представлены средним значением ± стандартное отклонение (M ± SD). Статистически достоверными считали различия при p < 0,05.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Изотип антител к тетрасахариду определяли методом встречной радиальной иммунодиффузии в геле по Оухтерлони. Для этого использовали выделенные из среды культивирования препараты у-глобулиновых фракций, содержащие МкАт, и антиизотипические сыворотки мыши: IgG и IgM, а также IgG1, IgG2а, IgG2b и IgG3 мыши. Все три клона продуцировали антитела M класса.
Таким образом, в результате эксперимента получено три клона-продуцента IgM-МкАт к тетрасахариду.
В супернатантах клонов биотинилированный тетрасахарид и синтетический КП выявляли IgM к тетрасахариду (рис.1А). Различий между уровнем МкАт, подуцире-мых всеми тремя клонами, не выявлено. При использовании бактериального КП в качестве твердофазного антигена уровень IgM был ниже, чем при использовании синетических аналогов КП (р < 0,05).
Аналогичные результаты получены при исследовании асцитической жидкости мышей (рис. 1Б). Различий между уровнем IgM к синтетическим аналогам КП не выявлено, тогда как уровень антител к бактериальноми КП был существенно ниже (р < 0,05).
Исследование конкурентного взаимодействия полученных МкАт с иммобилизованным на твердой фазе синтетическим КП и находящимися в растворе тетра-сахаридом и синтетическим и бактериальным КП показало, что наиболее активно МкАт связывали бактериальный КП, IC50 = 0,1 мкг/лунка (рис. 2).
В результате исследования получены IgM-МкАт к тетрасахариду — синтетическому аналогу повторяющегося звена КП S. pneumoniae серотипа 14, способные распознавать соответствующие углеводные эпитопы не только синтетических аналогов КП, но и бактериального КП S. pneumoniae серотипа 14.
В настоящем исследовании впервые получены МкАт к синтетическому тетрасахариду — повторяющемуся звену КП S.pneumoniae серотипа 14, относящиеся к IgM изотипу. В ранее проведенных исследованиях показано, что тетрасахарид указанной структуры, конъюгированный с БСА, адсорбированный на гидроксиде алюминия, обладает наиболее высокой способностью стимулировать выработку опсонизирующих антител и высокой протективной активностью в опытах на животных [12, 14].
В реакции иммунодиффузии с антиизотипическими сыворотками подтверждена принадлежность полученных МкАт к IgM изотипу. При использовании в качестве
8 7
? 6 о>
о 5 2 4
s 2 Н 1 О
йМ
ВЮ D4 G11 Клоны В10 D4
■ тетра-биотин □ синКП ^ бакКП
G11 Клоны
Рис. 1. ТИтр антител в супернатантах гибридных клонов в асцитической жидкости мышей в ИФА.
А — супернатант; Б — асцитическая жидкость; * p < 0,05.
твердофазных антигенов синтетических аналогов КП МкАт хорошо распознавали представленные в них тетрасахаридные структуры. Меньшая способность МкАт связывать бактериальный КП, адсорбированный на твердой фазе, вероятно, обусловлена конформационными изменениями молекулы КП S. pneumoniae серотипа 14 при его иммобилизации на твердой фазе, что частично ограничивает доступ к его эпитопам для МкАт. Важно, что в растворе, как это показано нами в реакции ингибирования ИФА, МкАт лучше распознавали соответствующие эпитопы бактериального КП, чем его синтетических аналогов.
Таким образом, для выявления МкАт к тетрасахариду в ИФА в качестве твердофазных антигенов предпочительно использовать синтетические аналоги КП. Полученные МкАт к тетрасахариду могут быть использованы для опредения представленности протективного тетрасахаридного эпитопа в КП этого серотипа пневмококка при разработке пневмококковых вакцин.
Работа выполнена при финансовой поддержке гранта РНФ 14-50-00126.
Л ИТЕРАТУРА
1. Ванеева Н.П., Ястребова Н.Е. Специфический иммунный ответ к отдельным капсуль-ным полисахаридам Streptococcus pneumoniae у здоровых доноров и лиц, вакцинированных пневмококковыми вакцинами. Журн. микробиол. 2015, 5: 20-26.
2. Генинг М.Л., Курбатова Е.А., Цветков Ю.Е., Нифантьев Н.Э. Разработка подходов к созданию углеводной конъюгированной вакцины третьего поколения против Streptococcus pneumoniae: поиск оптимальных олигосахаридных лигандов. Усп. хим. 2015, 84: 1100-1113.
3. Методические рекомендации по получению гибридом-продуцентов моноклональных антител к бактериальным антигенам. Утверждены 29.11. 85 г. МЗ СССР.
4. Сухова Е.В., Яшунский Д.В., Цветков Ю.Е. и др. Синтез олигосахаридных фрагментов капсульного полисахарида Streptococcus pneumoniae тип 14 и их неогликоконъ-югатов с бычьим сывороточным альбумином. Известия АН. Серия химическая. 2014, 2: 511-521.
5. Харит С.М. Пневмококковые вакцины. В кн.: Вакцины и вакцинация: национальное руководство. Под ред. В.В.Зверева, Б.Ф.Семенова, Р.М.Хаитова. М., ГОЭТАР-Медиа, 2011.
6. Akhmatova N.K., Kurbatova E.A., Akhmatov E.A. et al. The effect of a BSA conjugate of a synthetic hexasaccharide related to the fragment of capsular polysaccharide of Streptococcus pneumoniae type 14 on the activation of innate and adaptive immune responses. Front. Immunol. 2016, 7: 1-11.
7. Ananikov V.P., Eremin D.B., Yakukhnov S.A. et al. Organic and hybrid systems: from science to practice. Mendeleev Commun. 2017, 27: 425-438.
8. Ananikov V.P., Galkin K.I., Egorov M.P. et al. Challenges in the development of organic and hybrid molecular systems. Mendeleev Commun. 2016, 26: 365-374.
9. Broecker F., Anish C., Seeberger P.H. Generation of monoclonal antibodies against defined oligosaccharide antigens. Methods Mol. Biol. 2015, 1331: 57-80.
10.Jansen W.T., Snippe H. Short-chain oligosaccharide protein conjugates as experimental pneumococcal vaccines. Indian J. Med. Res. 2004, 119 (Suppl): 7-12.
0 0,1 1,0 10 Ингибирующая концентрация, мкг/лунка - тетрасахарид --о- - синтКП --□-- бакКП
Рис. 2. Способность МкАт к тетрасахариду связывать лиганд тетрасахарида, синтетический и бактериальный КП в реакции ингибирования ИФА.
В качестве твердофазного антигена использован синтетический КП. 1С50 — 50% ингибирующая концентрация.
11.Kochetkov N.K., Nifant'ev N.E., Backinowsky L.V. Synthesis of the capsular polysaccharide of Streptococcus pneumoniae type14. Tetrahedron. 1987, 43 (13): 3109-3121.
12.Kurbatova E.A., Akhmatova N.K., Akhmatova E.A. et al. Neoglycoconjugate of tetrasaccharide representing one repeating unit of the Streptococcus pneumoniae type 14 capsular polysaccharide induces the production of opsonizing IgG1 antibodies and possesses the highest protective activity as compared to hexa- and octasaccharide conjugates. Front. Immunol. 2017, 8: 1-13.
13.Reimer K.B., Gidney M.A., Bundle D.R., Pinto B.M. Immunochemical characterization of polyclonal and monoclonal Streptococcus group A antibodies by chemically defined glycoconjugates and synthetic oligosaccharides. Carbohydr Res. 1992, 232(1): 131-142.
14. Safari D., Dekker H.A., Joosten A.F. Identification of the smallest structure capable of evoking opsonophagocytic antibodies against S. pneumoniae type 14. Infect. Immun. 2008, 76 : 4615-4623.
15.Song J.Y., Moseley M.A., Burton R.L., Nahm M.H. Pneumococcal vaccine and opsonic pneumococcal antibody. J. Infect. Chemother. 2013, 3: 412-425.
Поступила 25.02.18
Контактная информация: Курбатова Екатерина Алексеевна, д.м.н.,
105064, Москва, М.Казенный пер., 5а, р.т. (495)917-57-74
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2018
И.ВФельдблюм1 , К.А.Субботина1, С.Д.Новгородова1, Г.М.Игнатьев2-6, М.Х.Алыева1, М.К.Ерофеева3, В.Г.Орловский4, И.А.Ленева5, С.Я.Мельников2, Е.В.Казакова2, Е.П.Начарова2, В.П.Трухин2
РЕАКТОГЕННОСТЬ, БЕЗОПАСНОСТЬ И ИММУНОГЕННОСТЬ ОТЕЧЕСТВЕННОЙ ГРИППОЗНОЙ ИНАКТИВИРОВАННОЙ РАСЩЕПЛЕННОЙ ВАКЦИНЫ ФЛЮ-М ПРИ ИММУНИЗАЦИИ ВЗРОСЛЫХ 18-60 ЛЕТ
'Пермский государственный медицинский университет им. Е.А.Вагнера; 2С.-Пе-тербургский НИИ вакцин и сывороток и предприятие по производству бактерийных препаратов; 3НИИ гриппа, С.-Петербург; 4ООО «Инфекционный центр», Новосибирск; 5НИИ вакцн и сывороток им. И.И.Мечникова, Москва; 6Федеральный научный центр исследований и разработки иммунобиологических препаратов им. М.П.Чумакова, Москва
Цель. Оценка реактогенности, безопасности и иммуногенности вакцины гриппозной инактивированной расщепленной Флю-М. Материалы и методы. Реактогенность, безопасность и иммуногенность препарата исследованы в многоцентровом двойном слепом сравнительном рандомизированном клиническом исследовании при иммунизации добровольцев 18-60 лет (препарат сравнения — инактивированная сплит-вакцина для профилактики гриппа Ваксигрип). Результаты. Отечественная расщепленная гриппозная вакцина Флю-М производства СПбНИИВС характеризуется хорошей переносимостью, высоким профилем безопасности и достаточной иммуногенностью, сопоставимой с гриппозной вакциной Ваксигрип. Заключение. Вакцина гриппозная инактивированная расщепленная Флю-М производства СПбНИИВС может быть рекомендована для регистрации на территории Российской Федерации для специфической профилактики гриппа у взрослых в возрасте от 18 до 60 лет.
Журн. микробиол., 2018, № 5, С. 31—37
Ключевые слова: вакцина против гриппа Флю-М, взрослое население 18-60 лет, безопасность, реактогенность, иммуногенность, рандомизированное клиническое исследование
