CC BY
20циркулирующим на территории России, так и к ранее не зарегистрированным в России. Это может быть расценено как результат миграции штаммов определенных СТ с территорий других стран, в которых они встречаются.
Л ИТЕРАТУРА
1. Баранов А.А., Намазова Л.С., Таточенко В.К. Пневмококковая инфекция и связанные с ней заболевания — серьезная проблема современного здравоохранения. Педиатр. фармакол. 2008, 5 (1): 28-33.
2. Белошицкий Г.В. Эпидемиологическая характеристика пневмококковых менингитов: Автореф. дис. канд. мед. наук. М., 2005.
3. Белошицкий Г.В., Королева И.С., Кошкина Н.И. Пневмококковые менингиты в Российской Федерации. Эпидемиол. вакцинопроф. 2009, 2: 6-10.
4. Козлов Р.С. Пневмококки: прошлое, настоящее и будущее. Смоленск, Смоленская государственная медицинская академия, 2005.
5. Конъюгированная пневмококковая вакцина для иммунизации детей. Рекомендации ВОЗ. Педиатр. фармакол. 2007, 4 (5): 1-3.
6. Мартынова А.В. Эпидемиологический анализ заболеваемости инвазивными и не инвазив-ными формами пневмококковых инфекций в различных группах населения. Вестн. РАМН. 2007, 9: 12-16.
7. Dobay O., Rozgonyi F, Hajdu E. et al. Antibiotic susceptibility and serotypes of Streptococcus pneumoniae isolates from Hungary. J. Antimicrob. Chemother. 2003, 51 (4): 887-893.
8. Fuminori Sakai, Naoko Chiba, Akiko Ono et al. Molecular epidemiologic characteristics of Streptococcus pneumoniae isolates from children with meningitis in Japan from 2007 through 2009. J. Infect. Chemother. 2011, 17 (3): 334-340
9. Hanage W. P., Kaijalainen T. Using multilocus sequence data to define the pneumococcus. J. Bacteriology. 2005, 187 (17): 6223-6230.
10. Pneumococcal conjugate vaccine for childhood immunization-WHO position paper. Weekly Epidemiol. Rec. 2007, 82 (12): 93-104.
11. Tumanen E. I., Mitchel T. J., Morrison D. A. et al. Pneumococcus. 2004.
12. Verhelst R., Kaijalainen T., Thierry De Baere et al. Comparison of five genotypic techniques for identification of optochin-resistant pneumococcus-like isolates. J. Clin. Microbiol. 2003, 41 (8): 3521-3525.
13. WHO manual. Laboratory methods for the diagnosis of meningitis caused by Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae and Haemophilus influenzae. WHO/IVB.11.09.2011.
Поступила 12.02.13
Контактная информация: Алешкин Владимир Андреевич, д.б.н., проф., 125212, Москва, ул.Адмирала Макарова, 10, р.т. (495)452-18-16
ВАКЦИНОЛОГИЯ И ВАКЦИНОПРОФИЛАКТИКА
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2013
Е.А.Курбатова1, Д.С.Воробьев1, Н.Б.Егорова1, А.П.Батуро1, Э.Е.Романенко1, М.Е.Маркова1, С.И.Елкина1, Ю.В.Волох1, Ю.Е.Цветков2, Е.В.Сухова2, Д.В.Яшунский3, Н.Э.Нифантьев2, Н.А.Михайлова1
ШТАММОВЫЕ РАЗЛИЧИЯ ВНУТРИВИДОВОЙ ИММУНОГЕННОЙ АКТИВНОСТИ АНТИГЕННЫХ КОМПОНЕНТОВ STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE
1НИИ вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова; 2Институт органической химии им. Н.Д.Зелинского; 3НИИ биомедицинской химии им. В.Н.Ореховича, Москва
Цель. Изучение внутривидовой иммуногенной активности антигенных белково-полисахаридных компонентов S. pneumoniae. Материалы и методы. Антигенные компоненты штаммов S. pneumoniae серотипов 3, 6А, 6В, 14, 10А, 18А, 19А, 19F, 23F и бескап-
сульного штамма получали методом водной экстракции. В качестве референс-препарата использовали синтетический гексасахарид, отвечающий структуре фрагмента цепи повторяющегося звена капсульного полисахарида S. pneumoniae серотипа 14. Молекулярную массу антигенных компонентов определяли в SDS-электрофорезе. Титры антител в сыворотках крови иммунизированных мышей оценивали методом твердофазного ИФА. Протективную активность препаратов исследовали на мышах после 2-кратной иммунизации с последующим заражением вирулентными штаммами S. pneumoniae серотипов 3 и 6В. Результаты. Препараты из штаммов серотипов 6А, 6В, 14, 19А, 19F, 23F в реакции с антимикробными сыворотками характеризовались перекрестной серологической активностью (титр IgG 1200 — 12 800). Наименьшая серологическая активность выявлена у препаратов S. pneumoniae серотипа 3 и бескапсульного штамма. Конъюгат синтетического гексасахарида и бычьего сывороточного альбумина взаимодействовал только с гомологичной антимикробной сывороткой до титра (600±89,4) и не реагировал с сыворотками к серотипам 19А и 19F. Перекрестная серологическая активность препаратов, вероятно, обусловлена присутствием белоксодержащих фракций, наличие которых выявлено в SDS-электрофорезе. Это подтверждается высокой внутривидовой перекрестной протективной активностью препаратов из штаммов серотипов 6В и 10А, защищающих от заражения гетерологичными штаммами S. pneumoniae 90 — 100% мышей. Заключение. Целесообразно использовать штаммы с перекрестной антигенной и протективной активностью для получения иммуногенных белоксодержащих фракций с целью усиления и расширения спектра защитной активности вакцинных препаратов, конструируемых на основе кап-сульных полисахаридов S. pneumoniae.
Журн. микробиол., 2013, № 5, С. 60—69
Ключевые слова: пневмококк, внутривидовая перекрестная протективная активность, антиген, серологическая активность, вакцина, синтетический гексасахарид
E.A.Kurbatova1, D.S.Vorobiev1, N.B.Egorova1, A.P.Baturo1, E.E.Romanenko1, M.E.Markova1, S.I.Elkina1, Yu.V.Volokh1, Yu.E.Tsvetkov2, E.V.Sukhova2, D.V.Yashunsky3, N.E.Nifantiev2, N.A.Mikhailova1
STRAIN DIFFERENCES OF INTRA-SPECIES IMMUNOGENIC ACTIVITY OF STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE ANTIGEN COMPONENTS
1Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera; 2Zelinsky Institute of Organic Chemistry; 3Orekhovich Research Institute of Biomedical Chemistry, Moscow, Russia
Aim. Study intra-species immunogenic activity ofantigenic protein-polysaccharide components of S. pneumoniae. Materials and methods. Antigenic components of serotype 3, 6А, 6В, 14, 10А, 18А, 19А, 19F, 23F and unencapsulated S. pneumoniae strains were obtained by water extraction method. Synthetic hexasaccharide — corresponding to the structure of S. pneumoniae serotype 14 capsule polysaccharide repeated unit chain fragment was used as a reference preparation. Molecular mass of antigenic components was determined in SDS-electrophoresis. Antibody titers in blood sera of immunized mice were evaluated by solid-phase EIA method. Protective activity of preparations was studied in mice after 2 immunizations with consequent infection by virulent S. pneumoniae serotype 3 and 6B strains. Results. Preparations from serotype 6А, 6В, 14, 19А, 19F, 23F strains in reaction with anti-microbial sera were characterized by cross serologic activity (IgG titers of 1200 — 12 800). The lowest serologic activity was detected in S. pneumoniae serotype 3 and unencapsulated strain preparations. Conjugate of synthetic hexasaccharide and bovine serum albumin interacted only with homologous antimicrobial sera up to titers of 600±89.4 and did not react with sera against serotypes 19A and 19F. Cross serologic activity of preparations is probably determined by the presence of protein fractions that were detected in SDS-electrophoresis. This is confirmed by high intra-species cross protective activity of preparations from serotype 6B and 10A strains that protect 90 — 100% of mice from infection by heterologous S. pneumoniae strains. Conclusion. Use of strains with cross antigenic and protective activity for production of immunogenic protein-containing fractions with the aim ofenchanting and broadening specter ofprotective activity of vaccine preparations that are constructed based on capsule polysaccharides of S. pneu-moniae is appropriate.
Zh. Mikrobiol. (Moscow), 2013, No. 5, P. 60-69
Key words: pneumococcus, intra-species cross protective activity, antigen, serologic activity, vaccine, synthetic hexasaccharide
ВВЕДЕНИЕ
Широкое распространение вирулентных штаммов пневмококка, легко передающихся воздушно-капельным путем от больных и носителей, и возрастающая их устойчивость к антибиотикам [4], являются важным аргументом в пользу необходимости расширения исследований в области вакцинопрофилактики заболеваний, вызванных Streptococcus pneumoniae. Уже с конца 70-х годов ХХ века в ряде стран мира начала применяться вакцина на основе капсульных полисахаридов этиологически значимых серотипов S. pneumoniae. Современная полисахаридная пневмококковая вакцина содержит набор капсульных полисахаридов, полученных из 23 серотипов пневмококка.
Многолетние наблюдения подтвердили эффективность и безопасность 23-валентной пневмококковой полисахаридной вакцины «Пневмо 23» («Sanofi-Paster», Франция). Несмотря на это, выявлены и серьезные недостатки: отсутствие выраженного бустерного эффекта при ревакцинации, что свидетельствует о недостаточном развитии иммунологической памяти; низкая эффективность у детей до 2 лет и в некоторых группах риска; вакцинация не предупреждает бактерионосительства и формирования антибиотикорезистентности штаммов [3, 5, 15].
Наличие существенных недостатков 23-валентной пневмококковой вакцины вызвало интерес к продолжению исследований в других направлениях конструирования пневмококковых вакцин: на основе поверхностных белков, некапсульных штаммов, разработке ДНК и синтетических вакцин, а также включения в их состав новых адъювантов и белков-носителей. Наиболее результативным для конструирования вакцин оказался подход, включающий использование конъюгатов полисахаридов и рекомбинантных анатоксинов в качестве белков-носителей. Применение таких конъюгированных иммуногенов способствует индукции Т-зависимого иммунного ответа даже у детей первых месяцев жизни и формированию Т- и В-клеточной памяти [8, 9, 12, 15 - 17].
В настоящее время в клинической практике применяют препараты «Превенар» и «Превенар 13» («Pfizer», США), в которых в качестве белка-носителя используют рекомбинантный дифтерийный анатоксин (CRM197), конъюгированный с капсуль-ными полисахаридными антигенами пневмококка. В качестве адъюванта в состав вакцины входит алюминия фосфат. Рассматривают варианты использования и других белков-носителей. Так, в состав коммерческой пневмококковой вакцины «Синфлорикс» («GlaxoSmithKline», Австралия) наряду с дифтерийным и столбнячным анатоксинами входит D-протеин нетипируемой Haemophilus influenzae. Широкие клинические исследования, проведенные в различных регионах мира, свидетельствуют о безопасности и иммуногенности этих препаратов. Установлено, что в популяции в результате иммунизации снижается циркуляция штаммов, серотипы которых входят в состав вакцин. Однако при этом некоторые исследователи отмечали возрастание роли других штаммов и, как следствие, изменение спектра циркулирующих серотипов пневмококка, в том числе в направлении появления высоковирулентных штаммов [7, 13, 14]. Возможно также изменение микробного пейзажа и за счет других этиологически значимых возбудителей заболеваний респираторного тракта. Кроме того, такая вакцина неактивна в отношении бескапсульных штаммов и также как конъю-гированные и неконъюгированные вакцины не защищает от носительства. Имеются предположения, что указанными недостатками не будут обладать вакцины, содержащие видоспецифические белковые компоненты микробных клеток S. pneumoniae.
Целью настоящего исследования явилось изучение внутривидовой иммуногенной активности антигенных белково-полисахаридных компонентов S. pneumoniae.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В работе использованы штаммы S. pneumoniae серотипов 3 (№3 и №11/56), 6А, 6В, 14, 10А, 18А, 19А, 19F, 23F и бескапсульный №36 из коллекции НИИВС им. И.И.Мечникова с типичными морфологическими и культуральными свойствами, тестированные моноспецифическими К-сыворотками полного набора. Штаммы хранили в лиофильно высушенном состоянии в ампулах при температуре 5°С. Наиболее вирулентные для мышей штаммы относились к серотипам 3 № 11/56 (LD50=102 микробных клеток), 3 № 3 (LD50=103 м. к.), 6В (LD50=104 м. к.); менее вирулентные к серотипам 14 ^50=50х106 м. к.), 19А ^50=500х106 м. к.), 19F (LD50 >109 м. к.) и др.
Штаммы культивировали в бульоне с добавлением 10% крови крупного рогатого скота в течение 18 — 20 ч, затем на сердечно-мозговом агаре ^ecton Dickinson, США) с добавлением 5% дефибринированной донорской крови. Далее штаммы пересевали на сердечно-мозговую или полусинтетическую (с добавлением аминопептида) среды. Культивирование проводили в течение 24 ч при температуре 37°C в CО2-инкубаторе («Sanyo», Япония).
Антигенные компоненты получали методом водной экстракции из инактивиро-ванных и высушенных ацетоном микробных клеток [1]. Содержание белка в препарате определяли по методу Lowry при 750 нм [11], углеводов по методу Dubois при 490 нм [6]. Для определения электрофоретической подвижности и характеристики молекулярной массы водорастворимых антигенов S. pneumoniae использовали вертикальный SDS-электрофорез в полиакриламидном геле (ПААГ) [10]. Электрофорез выполняли по общепринятому протоколу с использованием стандартного набора оборудования (PowerPac™ Universal 100 — 120/220 — 240V, Protean II xi 2-D Cell/ Protean II xi Slab Cell, «Bio-Rad Laboratories Ltd», Германия) в 15% ПААГ при силе тока 20 мА до вхождения образцов в разделяющий гель, а затем — при 40 мА. Антигены использовали в концентрации 10 мг/мл.
Мышей линии Balb/c массой 14 — 16 г (самцы) 5-кратно иммунизировали нарастающими дозами живых микробных клеток штаммов S. pneumoniae серотипов 14, 19А и 19F с невысокой вирулентностью, что позволяло использовать их в сублетальных дозах. Первая иммунизирующая доза составляла 106 м. к. и не вызывала гибели животных при внутрибрюшинном введении. Дальнейшую иммунизацию проводили 10-кратно возрастающими дозами живой микробной культуры с интервалом 14 суток. Сыворотку крови получали через 14 суток после последней иммунизации и хранили в замороженном состоянии при -80°C.
Твердофазый ИФА проводили для определения титра антител в сыворотках крови иммунизированных мышей. На плоскодонных полистироловых планшетах ВНИИ «Медполимер» сорбировали 0,5 мкг/лунка водорастворимых антигенов S.pneunoniae серотипов 3№3 3№11/56, 6А, 6В, 14, 10А, 18А, 19А, 19F, 23F, растворенных в ФСБ («Sigma», США) и в течение 2 ч инкубировали при температуре 37°C, затем оставляли на ночь при температуре 4°C. После сорбции в лунки вносили по 100 мкл/лунка исследуемой сыворотки в двукратных разведениях, начиная с 1:100. Сыворотки разводили в ФСБ с 0,05% Tween 20 («Panreac Sintesis», Испания) и инкубировали в термостате в течение 1 ч при 37°C. После 3-кратного отмывания сыворотки с помощью ФСБ с Tween 20 в объеме 200 мкл/лунка вносили рабочее разведение конъюгата в объеме 100 мкл. В качестве конъюгата использовали антитела диагностические против IgG (H+L) мышей, меченные пероксидазой, сухие (антивидовые) (ООО «Медгамал», НИИЭИ им. Н.Ф.Гамалеи). После 3-кратного отмывания сыворотки с помощью ФСБ с Tween 20 в объеме 200 мкл/лунка вносили проявляющий реагент — тетраметилбен-зидин (ТМБ) (ООО НПО «БиоТест Системы», Россия) в объеме 100 мкл/лунка. Через 20 мин реакцию останавливали 1М раствором H2SO4 («Sigma», США). Оптическую плотность определяли на ИФА-ридере («iMark», Япония) при длине волны 450 нм.
Для сравнения в качестве покрывающего антигена использовали конъюгат синтетического гексасахарида - фрагмента цепи капсульного полисахарида S. pneu-moniae типа 14 с БСА [2]. В качестве контроля использовали сыворотки ин-тактных (неиммунизированных) мышей.
Для определения антигенной активности препаратов, полученных методом водной экстракции, во все лунки, покрытые гликоконъюгатом 1 на основе синтетического гексасахаридного лиганда и белка носителя (БСА, 0,2 мкг/мл), прибавляли рабочее разведение сыворотки в ФСБ с Tween 20 в объеме 90 мкл/лунка.
В первые 2 ряда к сыворотке прибавляли 10 мкл ФСБ, а в остальные опытные лунки исследуемый водорастворимый антиген в концентрации 10 мкг/лунка в ФСБ. В качестве референс-препарата использовали вакцину «Пневмо 23». Планшеты инкубировали в течение 1 часа при 37°C. Трехкратно отмывали раствором ФСБ с Tween 20 в объеме 200 мкл/лунка и прибавляли рабочее разведение конъ-югата. Инкубировали 45 мин при 37°C. Трехкратно отмывали раствором ФСБ с Tween 20 в объеме 200 мкл/лунка. Затем вносили 100 мкл ТМБ в качестве проявляющего реагента. Через 15 мин реакцию останавливали 1М раствором H2SO4. Определяли оптическую плотность при длине волны 450 нм. Торможение рассчитывали по формуле: 100% — х, где 100% — оптическая плотность сыворотки (ОП450) до внесения антигена, х — активность сыворотки (%) после прибавления антигена.
Мышей иммунизировали внутрибрюшинно водорастворимыми антигенами различных серотипов S. pneumoniae 2-кратно с интервалом 14 суток дозой 25 — 100 мкг/ мышь. Через 14 суток мышей заражали внутрибрюшинно наиболее вирулентными штаммами S. pneumoniae 3№3, 3№11/56 и 6В. Определяли процент выживших мышей. Учет результатов для штаммов S. pneumoniae серотипа 3 проводили в течение 10 суток после заражения, при заражении штаммом 6В — в течение 60 суток.
Статистическую обработку данных проводили с использованием пакета прикладных программ Excell и интегрированным пакетом статистического анализа Statgraphics Plus v5.0 с применением параметрических методов сравнения при нормальном распределении (t-критерий Стъюдента). В некоторых экспериментах достоверность различий между группами определяли по методу %2.
РЕЗУЛ ЬТАТЫ
Полученные путем водной экстракции антигены содержали 25,5 — 53,5% белка, 3,8 — 8,3% углеводов и 11,1 — 30,0% нуклеиновых кислот. Разброс показателей связан с исследованием препаратов, полученных из штаммов разных серотипов S. pneumoniae.
Изучение электрофоретической подвижности и молекулярной массы белковых компонентов препаратов с помощью вертикального SDS-ПААГ электрофореза показало наличие значительного числа белковых полос, находящихся в широком диапазоне от 30 до 150 кДа (рис.). При этом выявлена значительная идентичность
3№31/Й6 £6 1UA 141- М Мы
SDS-электрофорез в полиакриламидном геле.
Окраска Coumassi Brilliant Blue 250G. Концентрация антигенов 10 мг/мл; М — молекулярный весовой маркер.
Таблица 1. Тйтр перекрестнореагирующих IgG к препаратам разных серотипов S. pneumoniae в сыворотках мышей, иммунизированных живыми микробными клетками пневмококка в ИФА
Антигенный компонент, полученный из S.pneumoniae, Обратный титр IgG в сыворотке крови мышей, иммунизированных живыми микробными клетками S.pneumoniae серотипов: Контроль
сорбированный на твердой фазе 14 19А 19F Неиммунизированные
3№ 3 900+251* 87,5+12,5 900+251* 87,5+12,5
3№11/56 850+287* 250+86 350+50 125+25
6А 2666+533* 2666+533* 5333+1066* 175+25
6В 1733+811* 2266+933* 6666+3466* 233+88
10А 2933+1748* 5333+1066* 10666+2133* 400+0
14 1200+400* 2400+800* 4800+1600* 87,5+12,5
19А 2133+533* 11200+1600* 11200+1600* 175+25
19F 4533+1866* 7466+2822* 12800+0* 300+100
23F 5600+800* 5600+800* 11200+1600* 350+50
Бескапсульный 350+50* 87,5+12,5 175+25 87,5+12,5
Конъюгат синтетического 600+89,4* 87,5+12,5 87,5+12,5 87,5+12,5
гексасахарида В.рпеишотае типа 14-БСА
Примечание. Титром антител считали разведение сыворотки, при котором ОП450 превышала значения в контроле не менее, чем в 2 раза; * достоверность разности между опытом и контролем, р<0,05.
Таблица 2. Перекрестная протективная активность водорастворимых антигенов разных капсульных типов пневмококка при заражении штаммом S.pneumoniae серотипа 3№11/56
Иммунизация антигенными компонентами S.pneumoniae серотипов: Иммунизирующая доза, мкг Заражающая доза (м.к.) серотипа 3№11/56 Число выживших мышей из числа взятых в опыт, дни наблюдения Выжило/ всего %+m
1 2 3 4 5 6 7 14
6А 100 104 9/10 9/10 4/10 3/10 2/10 2/10 2/10 2/10 2/10 20+12,6
6В —«— —«— 10/10 10/1 0 10/10 10/1 0 10/10 10/1 0 10/10 10/1 0 10/1 0 100+8,5*
10А —«— —«— 10/10 10/1 0 10/10 10/1 0 10/10 10/1 0 10/10 10/1 0 10/1 0 100+8,5*
14 —«— —«— 8/10 2/10 2/10 2/10 2/10 2/10 2/10 2/10 2/10 20+12,6
18А —«— —«— 10/10 2/10 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10 0+8,5
19А —«— —«— 9/10 1 /10 1/1 0 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10 0+8,5
19 F —«— —«— 10/10 6/10 6/10 6/10 6/10 6/10 6/10 6/10 6/10 60+15,5*
23F —«— —«— 9/10 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10 0+8,5
Контроль штамма — 104 10/10 9/10 1/10 1/10 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10 0+8,5
S.pneumoniae — 105 3/10 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10 0+8,5
серотипа 3№11/56 — 106 4/10 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10 0+8,5
Примечание. Иммунизация мышей внутрибрюшинно двукратно с интервалом 14 суток. Заражение на 14 сутки после последней иммунизации; *достоверность различий между опытом и контролем, p<0,05 (здесь и в табл. 3).
электрофоретических белковых профилей в препаратах, полученных из S. pneumoniae серотипов 6В, 10А, 19F. Несколько отличались от них белковые полосы препарата, полученного из наиболее вирулентного штамма S. pneumoniae серотипа 3№ 11/56.
Серологическую активность водорастворимых антигенов определяли методом твердофазного ИФА при использовании антимикробных мышиных сывороток к серотипам 14, 19А и 19F (табл.1). В качестве препарата сравнения использовали глико-конъюгат 1.
Препараты, полученные из штаммов серотипов 6А, 6В, 14, 19А, 19F, 23F, характеризовались высокой внутривидовой перекрестной серологической активностью, и титр IgG в реакции со всеми исследованными антимикробными сыворотками составил от 1200 до 12 800. В гомологичной системе титр антител к серотипам 19А и 19F был более высоким (11 200 — 12 800), чем в гетерологичной системе. Напротив, анти-
5. ЖМЭИ 5 № 5186
65
гены из штамма серотипа 14 в гомологичной системе выявили меньший уровень антител, чем при реакции с сыворотками 19А и 19F.
Существенно меньшие титры IgG в этих же сыворотках были выявлены при их взаимодействии с препаратами, полученными из штаммов S. pneumoniae серотипа 3 (№3 и №11/56) и бескапсульного штамма.
Конъюгат 1, включающий антигенные гексасахаридные лиганды, взаимодействовал с гомологичной антимикробной сывороткой до титра 600±89,4, с сыворотками к типам 19А и 19F титр антител был значительно меньше (87,5±12,5), что не отличалось от уровня IgG у интактных мышей. Эти данные подтвердили присутствие капсульно-го полисахарида в антимикробной сыворотке.
Из табл. 1 также видно, что ряд препаратов, полученных методом водной экстракции (6А, 6В, 10А, 14, 19А, 19F), при сорбции на планшетах тестировали высокий уровень IgG в ИФА во всех исследованных сыворотках. Можно предположить, что это происходило не за счет капсульного полисахарида S. pneumoniae, а обусловлено присутствием других антигенов, содержащихся в этом препарате, вероятно, белоксо-держащих, наличие которых было выявлено в электрофорезе.
Незначительное содержание капсульного полисахарида в препаратах, полученных методом водной экстракции, подтвердилось в реакции конкурентного ИФА.
Антигенные компоненты S. pneumoniae серотипа 14, полученные методом водной экстракции, не связывали IgG к капсульному полисахариду в антимикробной сыворотке, тогда как коммерческая полисахаридная вакцина «Пневмо 23» вызывала торможение реакции на 73%.
Исследование внутривидовой перекрестной протективной активности исследуемых водорастворимых антигенов, полученных из штаммов разных серотипов S. pneu-moniae, проведено на модели заражения мышей наиболее вирулентными штаммами S.pneumoniae серотипов 3 (№11/56 и №3) и 6В.
В первом опыте для исследования протективной активности были выбраны антигены, которые в реакции с антимикробными сыворотками выявили наиболее высокий титр антител. Мышей иммунизировали двукратно внутрибрюшинно дозой 100 мкг каждого из исследуемых антигенов S. pneumoniae и через 14 суток заражали летальной дозой (104 м. к.) вирулентного штамма S.pneumoniae серотипа 3№11/56. В этом опыте 100% защита от заражения гетерологичным вирулентным штаммом 3№11/56 получена при иммунизации антигенами серотипов 6В и 10А (табл. 2). Протективной активностью обладал также антиген серотипа 19F, обеспечивающий выживаемость 60% животных. Антигены серотипов 6А, 18А, 19А и 23F не защищали от заражения штаммом 3№11/56.
Оценка протективной активности препаратов проведена также при заражении мышей другим вирулентным штаммом S. pneumoniae серотипа 3№3 (табл. 3).
Протективная активность выявлена в гомологичной системе при заражении штаммами 3№3 и 3№11/56, причем препарат, полученный из штамма 3№11/56, обеспечил даже более высокую защиту от заражения, чем гомологичный заражающему — 3№3.
Таблица 3. Перекрестная протективная активность водорастворимых антигенов разных капсульных типов пневмококка при заражении штаммом S.pneumoniae серотипа 3№3
Иммунизация антигенными компонентами S.pneumoniae серотипов: Иммунизирующая доза, мкг Заражающая доза (м. к.) серотипа 3№3 Число выживших мышей из числа взятых в опыт, дни наблюдения Выжило/ всего %±m
1 2 3 4 5 6 10
3№3 100 105 10/10 10/10 10/10 7/10 7/10 7/10 7/10 7/10 70+14,5*
3№11/56 -«- —«— 10/10 10/10 10/10 10/10 10/10 10/10 10/10 10/10 100 ±8,5*
6В -«- —«— 10/10 10/10 3/10 3/10 3/10 3/10 3/10 3/10 30 ±14,5
10А -«- —«— 10/10 10/10 9/10 9/10 9/10 9/10 9/10 9/10 90 ±9,5*
19 F -«- —«— 10/10 10/10 4/10 3/10 3/10 3/10 3/10 3/10 30 ±14,5
Контроль штамма 104 10/10 10/10 3/10 3/10 3/10 2/10 2/10 2/10 20 ±12,6
S.pneumoniae 105 10/10 10/10 2/10 2/10 2/10 2/10 2/10 2/10 20 ±12,6
серотипа 3№3 106 10/10 10/10 1/10 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10 0 ±8,5
Таблица 4. Перекрестная протективная активность водорастворимых антигенов разных капсульных типов пневмококка при заражении штаммом S.pneumoniae серотипа 6В
№№ опыта
Иммунизация антигенными компонентами 8.рпеитотае серотипов: Иммунизирующая доза, мкг Заражающая доза (м. к.) серотипа 6В Число выживших мышей из числа взятых в опыт, дни наблюдения Выжило/ всего %±m
1 2 3 7 10 15 30 60
3№3 100 105 10/10 10/10 10/10 10/10 10/10 10/10 10/10 10/10 10/10 100±8,5*
3№ 11/56 —«— —«— 10/10 10/10 10/10 10/10 10/10 10/10 10/10 10/10 10/10 100±8,5*
6А —«— —«— 10/10 10/10 9/10 9/10 9/10 9/10 9/10 9/10 9/10 90±9,5
6В —«— —«— 10/10 10/10 10/10 10/10 10/10 10/10 10/10 10/10 10/10 100±8,5*
10А —«— —«— 10/10 10/10 10/10 10/10 10/10 10/10 10/10 10/10 10/10 100±8,5*
14 —«— 9/9 9/9 8/9 8/9 8/9 8/9 8/9 8/9 8/9 88,9±10,5
18А —«— —«— 10/10 10/10 7/10 7/10 7/10 7/10 7/10 7/10 7/10 70±14,5
19А —«— —«— 5/5 5/5 5/5 5/5 5/5 5/5 5/5 5/5 5/5 100±8,5*
19 F —«— —«— 9/9 9/9 7/9 7/9 7/9 7/9 7/9 7/9 7/9 77,7±13,9
23F —«— —«— 10/10 10/10 10/10 10/10 9/10 8/10 8/10 8/10 8/10 80±12,6
Контроль штамма — 104 10/10 10/10 9/10 9/10 9/10 9/10 9/10 9/10 9/10 90±9,5
8.рпеитошае — 105 10/10 10/10 8/10 7/10 7/10 7/10 6/10 6/10 6/10 60±15,5
серотипа 6В — 106 10/10 10/10 9/10 9/10 8/10 8/10 8/10 7/10 7/10 70±14,5
3№ 11/56 50 107 10/10 9/10 9/10 9/10 9/10 9/10 8/10 6/10 6/10 60 ±15,5
6В —«— —«— 10/10 10/10 10/10 10/10 10/10 10/10 10/10 10/10 10/10 100 ±8,5**
10А —«— —«— 10/10 10/10 10/10 10/10 10/10 10/10 10/10 10/10 10/10 100 ±8,5**
19 F —«— —«— 9/10 8/10 8/10 8/10 8/10 8/10 5/10 5/10 5/10 50 ±15,8
Контроль штамма — 107 10/10 10/10 10/10 10/10 10/10 9/10 6/10 4/10 4/10 40 ±15,5
8.рпеитошае
серотипа 6В
Примечание. * Достоверность разности между опытом и контролем по Х2=5, p<0,05; ** %2=8,4, p<0,01.
В этом опыте подтвердилась перекрестная протективная активность штамма S. pneumoniae серотипа 10А. Установлена высокая степень выживаемости (90±9,5)% мышей при иммунизации препаратом из этого штамма в отношении вирулентного штамма S. pneumoniae 3№3.
В следующем исследовании в аналогичных опытах для заражения использовали штамм S. pneumoniae серотипа 6В (табл. 4). Этот штамм — менее вирулентный, чем оба исследованных штамма S. pneumoniae серотипа 3. В контроле от заражающей дозы выжило 60% мышей (опыт I). При этом выживаемость мышей, вакцинированных препаратами, полученными из обоих штаммов серотипа 3, и серотипов 6В, 10А и 19А, составила 100% (р<0,05). Эксперимент по исследованию протективной активности в отношении S. pneumoniae серотипа 6В был повторен при использовании большей заражающей дозы (опыт II). В этом опыте выжило 40% контрольных мышей и 100% мышей, вакцинированных препаратами, полученными из штаммов серотипов 6В и 10А (р<0,01).
ОБСУЖДЕНИЕ
Массовая вакцинация против пневмококковой инфекции, проводимая в ряде стран, привела к уменьшению циркуляции штаммов, включенных в состав вакцины «Пневмо 23». Учитывая возможность ротации штаммов и появления серотипов S. pneumoniae, ранее не имевших эпидемиологического значения, существует необходимость в постоянном мониторинге этих показателей и продолжении исследований в направлении разработки новых подходов к конструированию вакцинных препаратов [7, 13, 14].
В работе исследована серологическая и протективная активность водорастворимых поверхностных антигенных компонентов разных серотипов S. pneumoniae. Использованный метод водной экстракции позволил получить антигенные препараты с максимально сохраненной нативной структурой и высоким содержанием белка (25,5 — 53,5%). В электрофорезе выявлено наличие идентичных белковых компонентов у серотипов 6В, 10А и 19F.
В ИФА показано, что полученные антигенные препараты из штаммов серотипов 6А, 6В, 10А, 19А, 19F, 23F реагируют с антимикробными сыворотками к серотипам
I
II
14, 19F, 19А, выявляя в этих сыворотках высокий уровень IgG. Поскольку установлена перекрестная серологическая активность между штаммами разных серотипов, можно полагать, что в данных экспериментах реагируют не строго серотиповые кап-сульные полисахаридные антигены, а белковые антигены или же их комплексы с другими полисахаридами клеточной стенки пневмококка. Это подтверждается тем, что синтетический антигенный гексасахарид, отражающий фрагмент цепи повторяющего звена капсульного полисахарида S. pneumoniae серотипа 14 в составе конъюга-та 1 с БСА, реагировал только с гомологичной сывороткой.
Наиболее важным показателем действия антигенов является их протективная активность, которая тестирована в отношении трех штаммов (двух штаммов серотипа 3 и одного — серотипа 6В). Остальные штаммы S. pneumoniae, имеющиеся в нашем распоряжении, обладали слабой вирулентностью, недостаточной для постановки опытов по определению протективной активности препаратов.
Из представленных данных видно, что перекрестная протективная активность их различна. Наиболее активными оказались препараты, полученные из штаммов серо-типов 6В, 10А в гетерологичной системе и 3№11/56 — в гомологичной системе.
Наличие перекрестной антигенной и протективной активности является важным условием использования таких штаммов для усиления внутривидовой защитной активности вакцинных препаратов, конструируемых на основе капсульных полисахаридов S. pneumoniae. При этом целесообразным является установление роли белок-содержащих антигенов, поскольку они не только могут способствовать расширению спектра внутривидовой защитной активности, но и развитию Т-зависимого иммунного ответа.
Л ИТЕРАТУРА
1. Ванеева Н.П., Воробьев Д.С., Грищенко Н.В. и др. Изучение перекрестной активности антигенных препаратов Streptococcus pneumoniae. Журн. микробиол. 2012, 5: 36-42.
2. Курбатова Е.А., Воробьев Д.С., Семенова И.Б. и др. разработка подходов к созданию экспериментальной тест-системы для оценки антигенной активности синтетических олигоса-харидных лигандов, родственных фрагментам цепи капсульного полисахарида Streptococcus pneumoniae типа 14. Биохимия. 2013, 7: 1046-1052.
3. Клинико-иммунологические аспекты применения поликомпонентной пневмококковой вакцины «Пневмо 23» у детей с атопической бронхиальной астмой. Методические рекомендации МЗ РФ. Владивосток, 2004.
4. Резолюция заседания общественного координационного совета по пневмококковой инфекции в России. Эпидемиология и инфекционные болезни, актуальные вопросы. 2012, 5: 82-83.
5. Харит С.М. Пневмококковые вакцины. В: Вакцины и вакцинация: национальное руководство. В.В. Зверев, Б.Ф.Семенов, Р.М.Хаитов (ред.). М., ГЭОТАР-Медиа, 2011.
6. Dubois K., Gillers K.A., Hamilton J.K. et al. Colometric method for the determination of sugars. Annal. Chem. 1956, 28: 350-354.
7. Hicks L.A., Harison L.H., Flannery B. et al. Incidence of pneumococcal disease due to non-pneumococcal conjugate vaccine (PCV7) serotypes in the United States during the era ofwidespread PCV7 vaccination. 1998-2004. J. Infect.Dis. 2007, 196 : 1346-1354.
8. Jansen WT., Snippe H. Short-chain oligosaccharide protein conjugates as experimental pneumococcal vaccines. Indian J. Med. Res. 2004, 119 (l): 7-12.
9. Konen-Waisman S., Cohen A., Fridkin M., Cohen I.R. Self heat-shock protein (hsp60) peptide serves in a conjugate vaccine against a lethal pneumococcal infection. J. Infect. Dis.1999, 179: 403413.
10. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of head of bacteriophage T4. Nature. 1970, 227: 680-685.
11. Lowry O.H., Rosebrought N.F., Farr A.L., Handale R.I. Protein measurement with the Folin-reagent. J. Biol. Chem. 1951, 193: 265-271.
12. Nurkka A., Ahman H., Korkeila N. et al. Serum and salivary anti-capsular antibodies in infants and children immunized with the heptavalent pneumococcal conjugate vaccine. Pediatr. Infect. Dis. J. 2001, 20: 25-33.
13. Pelton S.I., Huot H., Finkelstein J. A. et al. Emergence of 19A as virulent and multidrug resistant pneumococcus in Massachusetts following universal immunization of infants with pneumococcal conjugate vaccine. Pediatr. Infect. Dis. J. 2007, 26 (6): 468-472.
14. Poland G.A. The prevention of pneumococcal disease by vaccines: promises and challenges. Infect. Dis. Clin. Nort. Am. 2001, 15: 97-122.
15. Reinert R.R. Pneumococcal conjugate vaccines — a European perspective. Int. J. Med. Microbiol. 2004, 294 (5): 277-294.
16. Safari D., Dekker H.A.T., Joosten A.F. Identification of the smallest structure capable of evoking opsonophagocytic antibodies against S. pneumoniae type 14. Infection and Immunity. 2008, 76 (10) : 4615-4623.
17. Wuorima T., Kayhty H., Eskola J. et al. Activation of cell-mediated immunity following immunization with neumococcal conjugate or polysaccharide vaccine. Scand. J. Immunol. 2001, 53: 422428.
Поступила 12.02.13
Контактная информация: Курбатова Екатерина Алексеевна, д.м.н., проф., 105064, Москва, М. Казенный пер., 5А, р.т. (495)917-57-74
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2013 Л.И.Ткаченко, В.В.Малеев1, Л.С.Путренок2
ОЦЕНКА СЕРОКОНВЕРСИИ ПОСЛЕ ВАКЦИНАЦИИ МЕДИЦИНСКОГО ПЕРСОНАЛА ОТ MV ИНФЕКЦИИ
Ставропольская государственная медицинская академия; Центральный НИИ эпидемиологии, Москва; 2Ставропольский краевой клинический консультативно-диагностический центр
Цель. Провести анализ формирования иммунного ответа у вакцинированных от вирусного гепатита В медицинских работников, выявить факторы риска по отсутствию серо-конверсии после вакцинации. Материалы и методы. У 49 медицинских работников был проведен ретроспективный анализ динамики титра антител к HBsAg (аИВБ) после вакцинации с 1998 — 2011гг., данных объективного статуса и основных лабораторных показателей по медицинской документации. Результаты. Из числа вакцинированных отсутствие ответа (аНВБ<10 mIU/ml) наблюдали у 20,4%, слабый ответ (аНВБ >10 mIU/ml<100 mIU/ ml) — у 34,7% и полный ответ (аНВБ>100 mIU/ml) — у 44,9% сотрудников. Возраст старше 40 лет, мужской пол , ожирение и инсулинорезистентность были сопряжены с неэффективностью вакцинации. При титре аНВБ<100 mIU/ml пациенты становились серонегатив-ными в течение трех лет после иммунизации. При титре аНВБ>100 mIU/ml пациенты оставались серопозитивны на протяжении 10 лет. Заключение. Возраст старше 40 лет, мужской пол, ожирение и инсулинорезистентность сопряжены с отсутствием формирования сероконверсии после вакцинации от НВV инфекции. При слабом иммунном ответе необходимо ежегодно мониторировать титр аНВБ с целью своевременного проведения ревакцинации. При адекватном иммунном ответе ревакцинация возможна через 10 лет.
Журн. микробиол., 2013, № 5, С. 69—74
Ключевые слова: вакцинация, вирусный гепатит В, медицинские работники, иммунный ответ
L.I.Tkachenko, V.V.Maleev1, L.S.Putrenok2
EVALUATION OF SEROCONVERSION AFTER VACCINATION OF MEDICAL STAFF AGAINST HBV INFECTION
Stavropol State Medical Academy; 1Central Research Institute of Epidemiology, Moscow; 2Stavropol Regional Clinical Consultation-Diagnostic Centre, Russia
Aim. Carry out analysis of formation of immune response in vaccinated medical staff against viral hepatitis B, detect risk factors by lack of seroconversion after vaccination. Materials and methods. In medical staff (49 individuals) retrospective analysis of dynamics of antibody titers
