CC BY
12© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2015
Д.С.Воробьев, И.Б.Семенова, Ю.В.Волох, Э.Е.Романенко, \А-П.Батуро\, Н.А.Михайлова
ИЗУЧЕНИЕ ПРОТЕКТИВНОЙ АКТИВНОСТИ БЕЛОКСОДЕРЖАЩИХ АНТИГЕНОВ STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE В ГЕТЕРОЛОГИЧНОЙ СИСТЕМЕ
НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова, Москва
Цель. Исследование протективной активности белоксодержащих антигенов пневмококка, полученных из серотипов 6В, 10А, 14, 19F, 23F и 36R, против заражения гетероло-гичными штаммами S. pneumoniae. Материалы и методы. В работе использованы штаммы S. pneumoniae серотипов 3, 6В, 10А, 14, 19F, 23F и 36R, полученные из коллекции штаммов пневмококка НИИВС им. И.И.Мечникова. Белоксодержащие антигены S. pneumoniae выделяли путем осаждения ацетоном надосадочной фракции культуральной среды. Протективную активность препаратов белоксодержащих антигенов пневмококка изучали в опытах активной защиты мышей линии BALb/c. Результаты. Полученные данные свидетельствуют, что белоксодержащие антигены пневмококка, выделенные из серотипов 6В, 10А, 14, 19F и 23F, эффективно защищают животных от последующего заражения гетерологичным штаммом S. pneumoniae серотипа 3 № 11/56. Защита отмечена на уровне от 80 до 100% (р<0,05). В другом опыте аналогичный протективный эффект выявлен в группах мышей, иммунизированных препаратами белоксодержащих антигенов пневмококка, полученных из серотипов 6В и 36R, против заражения гетерологичным штаммом S. pneumoniae серотипа 3 № 11/56. Защита отмечена на уровне 90% (р<0,05). Заключение. Результаты проведенных экспериментов позволяют предположить, что в формировании перекрестной защиты в опытах на животных главную роль играют белки пневмококка, входящие в состав исследуемых препаратов, а не полисахаридные антигены.
Журн. микробиол., 2015, № 6, С. 51—55
Ключевые слова: протективная активность, белоксодержащие антигены, S. pneumoniae D.S.Vorobiev, I.B.Semenova, Yu.V.Volokh, E.E.Romanenko, \A.P.Batur0, N.A.Mikhailova
STUDY OF PROTECTIVE ACTIVITY OF PROTEIN-CONTAINING ANTIGENS OF STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE IN A HETEROLOGOUS SYSTEM
Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera, Moscow, Russia
Aim. Study protective activity of protein-containing antigens of pneumococcus, obtained from serotypes 6В, 10А, 14, 19F, 23F and 36R, against infection with heterologous strains of S. pneumoniae. Materials and methods. S. pneumoniae strains of serotypes 3, 6В, 10А, 14, 19F, 23F and 36R, obtained from the collection of pneumococcus strains of Mechnikov RIVS, were used in the study. Protein-containing antigens of S. pneumoniae were isolated by acetone precipitations of supernatant fraction of culture medium. Protective activity of preparations of protein-containing antigens of pneumococcus was studied in experiments of active protection of BALb/c line mice. Results. The data obtained give evidence, that protein-containing antigens of pneumococcus, isolated from serotypes 6В, 10А, 14, 19F and 23F, effectively protect animals from subsequent infection with a heterologous S. pneumoniae strain of serotype 3 No. 11/56. Protection was noted at a level from 80 to 100% (p<0.05). Similar protective effect was detected in another experiment in a group of mice, immunized with preparations ofprotein-containing antigens of pneumococcus, obtained from serotypes 6B and 36R, against infection with a heterologous S. pneumoniae strain of serotype 3 No. 11/56. Protection was noted at a level of 90% (p<0.05). Conclusion. The results of the experiments carried out allow to assume, that the main role in formation of cross-protection in experiments in animals is played by pneumococcus proteins, that are a part of the studied preparations, and not polysaccharide antigens.
Zh. Mikrobiol. (Moscow), 2015, No. 6, P. 51—55
Key words: protective activity, protein-containing antigens, S. pneumoniae
ВВЕДЕНИЕ
Проблема пневмококковой инфекции в последние десятилетия остается актуальной для России [4]. Streptococcus pneumoniae способен вызывать тяжелые инвазивные формы пневмококковой инфекции, особенно среди детей младше 2 лет и у лиц пожилого возраста [5, 7]. В настоящее время отмечается рост антибиотикорезистент-ности пневмококка, что значительно затрудняет лечение [9]. Кроме того, с определенной частотой меняется этиологическая значимость серотипов возбудителя. Так, в структуре доминирующих серотипов в России после 2000 года возросло значение серотипов 3, 6В, 7F, а также появились новые, ранее не выявлявшиеся, серотипы 4 и 15А/В [1]. Поэтому наиболее рациональным представляется профилактика пневмококковой инфекции с помощью вакцинации.
Перспективным направлением является разработка вакцины на основе белков пневмококка, которые, как известно [8], обладают высокой гомологией между собой и, предположительно, могут формировать перекрестную защиту.
Ранее нами исследована активность белоксодержащих антигенов пневмококка против заражения гомологичным штаммом S. pneumoniae [2]. Однако известно, что иммунный ответ к пневмококковой инфекции строго сероспецифический [6], т.е. против штаммов S. pneumoniae разных серогрупп формируется каждый раз свой иммунитет. Исследования последних лет убедительно показывают, что нельзя создать вакцину от всех штаммов/серогрупп S. pneumoniae на основе капсульных полисаха-ридных антигенов.
Цель работы — исследование перекрестной протективной активности ряда препаратов на основе белоксодержащих антигенов пневмококка против заражения гетерологичными штаммами (№ 3 и № 11/56) S. pneumoniae сероти-па 3.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В работе использованы штаммы S. pneumoniae серотипов 3, 6В, 10А, 14, 19F, 23F и 36R, полученные из коллекции НИИВС им. И.И.Мечникова. Культуру возбудителя выращивали в сердечно-мозговом бульоне в течение 16 — 18 часов в СО2 инкубаторе при температуре 37°C и 5% содержании углекислого газа.
Опыты проводили на мышах линии Balb/c массой 16 — 18 г, полученных из питомника НЦ Биомедицинских технологий, филиал «Андреевка».
Белоксодержащие антигены пневмококка выделяли путем ацетонового осаждения надосадочной фракции культуральной среды.
Белоксодержащие антигены пневмококка мышам вводили внутрибрю-шинно двукратно с интервалом в 2 недели в дозах 10, 30, 50 и 100 мкг/ особь. Через две недели после повторного введения препарата мышей за-
Таблица 1. Выживаемость мышей при внутрибрю-шинном введении препарата белоксо-держащего антигена пневмококка (Бса) серотипа 3 (штамм № 3)
Препарат
Иммунизирующая доза, мкг/мышь
Выживаемость на 10 сутки*
Критерий значимости, Z
Бса 10 5/10 2,2**
//-// 50 5/10 //-//
//-// 100 1/10 1,43
Контроль — 1/10 (интактные мыши)
Примечание. Заражающая доза — 25 LD50. *Здесь и в табл. 2—4: в числителе — число выживших мышей, в знаменателе — число зараженных животных; ** достоверность разницы между опытом и контролем (р<0,05).
Таблица 2. Выживаемость мышей при внутрибрю-шинном введении препаратов белоксо-держащих антигенов пневмококка (Бса) серотипов 3 (штамм № 3), 14 и 19F
Препарат
Выживаемость на 10 сутки*
Критерий значимости, Z
Бса серотипа 3 (№ 3) 10/10 4,1**
Бса серотипа 14 2/10 1,64
Бса серотипа ОТ 7/10 3,33**
Контроль (интактные мыши) 0/10 —
Примечание. Иммунизирующая доза — 30 мкг/ мышь; серотип 3 (штамм № 3) заражающая внутри-брюшинная доза — 19,95 LD50.
Таблица 3. Выживаемость мышей при внутрибрю-шинном введении препаратов белоксо-держащих антигенов пневмококка (Бса) серотипов 3 ( штамм № 11/56), 6В, 10А, 14, № и 23F
ражали внутрибрюшинно суточной культурой S. pneumoniae в дозе 105 микробных клеток в 0,5 мл физиологического раствора (штамм № 3) и в дозе 104 микробных клеток в 0,5 мл физиологического раствора (штамм № 11/56). В качестве контроля служили неимму-низированные мыши. Наблюдение за животными проводили в течение 10 — 14 дней.
Животных выводили из эксперимента под эфирным наркозом.
Результаты оценивали по выживаемости мышей в течение срока наблюдения, рассчитывая достоверность по методу С.А.Гланца [3].
РЕЗУЛ ЬТАТЫ
В работе проведено сравнение про-тективного действия белоксодержащих антигенов пневмококка в гомологичной и гетерологичной системах.
На первом этапе изучена протек-тивная активность антигенного препарата пневмококка, выделенного из серотипа 3 (штамма № 3) (табл. 1), в гомологичной системе. Мышей иммунизировали двукратно с интервалом 14 дней белоксодержащим антигеном пневмококка в дозах 10, 50 и 100 мкг/ особь и заражали через две недели после второй иммунизации бульонной культурой S. pneumoniae серотипа 3 (штамм № 3) в дозе 25 LD50. Дозы 10 и 50 мкг/особь защищали 50% опытных животных на протяжении 10 дней (р<0,05), в контроле наблюдали гибель 90% мышей. Доза 100 мкг/особь оказалась неэффективной.
Далее проведено сравнение протективной активности препаратов белоксодержа-щих антигенов пневмококка в гомологичной и гетерологичной системе. Мышей иммунизировали двукратно антигенами, полученными из серотипов 3 (штамм № 3), 14 и 19F в дозе 30 мкг/особь. Через две недели после второй иммунизации животных заражали бульонной культурой S. pneumoniae серотипа 3 (штамм № 3) в дозе 19,95 LD50 (табл. 2). Полученные результаты свидетельствовали, что гомологичный белок-содержащий антиген пневмококка серотипа 3 защищал 100% мышей в течение 10 дней эксперимента, гетерологичный белоксодержащий антиген, выделенный из се-ротипа 19F, защищал 70% животных (р<0,05), а препарат из серотипа 14 вообще не проявлял протективного эффекта.
В эксперименте оценена перекрестная протективная активность препаратов белоксодержащих пневмококка, полученных из серотипов 3, 6В, 10А, 14, 19F и 23F от заражения 1,99 LD50 S. pneumoniae серотипа 3 (штамм № 11/56) (табл. 3). Животным вводили препараты двукратно с интервалом 14 дней в дозе 50 мкг/особь. Подтверждено,
Препарат Выживаемость на 10 сутки* Критерий значимости, Z
Бса серотипа 3 (№ 11/56 ) 10/10 3,83**
Бса серотипа 6В 10/10 3,83**
Бса серотипа 10А 8/10 2 94**
Бса серотипа 14 8/10 3,2**
Бса серотипа 19F 9/10 3,5**
Бса серотипа 23F 8/10 3,1**
Контроль (интактные мыши) 1/10 —
Примечание. Иммунизирующая доза — 50 мкг/ мышь; серотип 3 (штамм № 11/56) заражающая внутрибрюшинная доза — 1,99 LD50.
Таблица 4. Выживаемость мышей при внутрибрю-
шинном введении препаратов белоксо-
держащих антигенов пневмококка (Бса) серотипов 3 (штаммы № 11/56 и 3), 6В, 10А, 14, 23F и 36К
Препарат Выживаемость на 10 сутки* Критерий значимости, Z
Бса серотипа 3 (№ 3) 9/10 2,5**
Бса серотипа 3 (№ 11/56) 9/10 2,5**
Бса серотипа 6В 9/10 2,5**
Бса серотипа 10А 6/10 1,39
Бса серотипа 14 7/10 1,76
Бса серотипа 19F 7/10 1,69
Бса серотипа 23F 7/10 1,87
Бса серотипа 36R 9/10 2,5**
Контроль (интактные мыши) 3/10 —
Примечание. Иммунизирующая доза — 100
мкг/мышь; серотип 3 (штамм № 11/56) заражающая внутрибрюшинная доза — 1,58 LD50.
что гомологичный белоксодержащий антиген пневмококка защищал 100% животных. Протективный эффект гетерологичных белоксодержащих антигенов пневмококка различался: вариант из серотипа 6В защищал 100% мышей, из серотипа 19F — 90%, а из серотипов 10А, 14 и 23F — 80% животных соответственно (р<0,05).
В опыте изучена перекрестная протективная активность препаратов белоксодержащих антигенов пневмококка, выделенных из серотипов 3, 6В, 10А, 14, 19F, 23F и 36R от заражения 1,58 LD50 S. pneumoniae серотипа 3 (штамм № 11/56) (табл. 4). Животных иммунизировали двукратно с интервалом 14 дней в дозе 100 мкг/особь. Гомологичные белоксодержащие антигены пневмококка, полученные из серотипа 3, защищали 90% мышей (р<0,05). Такая же протекция отмечалась при введении гетерологичных белоксодержащих антигенов пневмококка, выделенных из серотипов 6В и 36R (р<0,05). Препараты, полученные из серотипов 10А, 14, 19F и 23F, не защищали мышей от заражения штаммом № 11/56 серотипа 3.
Таким образом, выявленная гетерологичная защита была сопоставима с таковой в гомологичной системе (80 — 100%).
ОБСУЖДЕН И Е
Представленные результаты по гомологичной защите подтверждают ранее полученные [2], свидетельствующие, что белоксодержащие антигены пневмококка, полученные из серотипа 3, способны создавать высокую защиту опытных мышей при заражении S. pneumoniae серотипа 3. В экспериментах на животных получены интересные результаты по наличию перекрестной защиты. Все испытанные препараты белоксодержащих антигенов пневмококка, выделенные из серотипов 6В, 10А, 14, 19F, 23F, защищали мышей от заражения гетерологичным штаммом № 11/56 S. pneumoniae серотипа 3. Выраженность защиты составила 80 — 100%. В другом опыте про-тективным эффектом обладали препараты, полученные из серотипов 6В и 36R (по 90% выживших животных соответственно) при заражении животных штаммом № 11/56 S. pneumoniae серотипа 3. Такая разница обусловлена, вероятно, разными иммунизирующими и заражающими дозами.
В отдельном эксперименте продемонстрировано протективное действие (70%) препарата белоксодержащего антигена пневмококка, выделенного из серотипа 19F, при заражении мышей штаммом № 3 S. pneumoniae серотипа 3. Белоксодержащий антиген, приготовленный из серотипа 14, в этом же опыте защитным действием не обладал.
В проведенных экспериментах наличие и выраженность защиты зависели от штамма заражающей культуры S. pneumoniae, а также от дозы введенного патогена.
Таким образом, выявленная перекрестная протективная активность в опытах in vivo позволяет предположить, что она формируется преимущественно за счет белковых антигенов пневмококка, поскольку последние обладают высокой степенью гомологии между собой, в то время, как среди капсульных полисахаридов такой гомологии не обнаружено. Эту мысль подтверждает также эффективность белок-содержащего антигена пневмококка, полученного из бескапсульного серотипа 36R, в котором должны отсутствовать полисахаридные антигены. Однако наличие капсульных полисахаридов в других исследуемых образцах может играть роль адъю-вантов и, соответственно, усиливать иммунный ответ к белоксодержащим антигенам.
Учитывая полученные данные, необходимо проверить перекрестную протектив-ную активность отдельных белковых фракций пневмококка, выделенных из разных серотипов, против заражения как гомологичным, так и гетерологичными серотипами S. pneumoniae. Главной целью следующих экспериментов станет отбор наиболее им-муногенных штаммов S. pneumoniae, из которых будут выделены протективные белковые фракции пневмококка.
Л ИТЕРАТУРА
1. Белошицкий Г.В., Королева И.С. Серотиповая характеристика штаммов S. pneumoniae в Москве. Эпидемиология и вакцинопрофилактика. 2014, 1 (74): 90-97.
2. Воробьев Д.С., Семенова И.Б., Волох Ю.В. и др. Изучение протективной активности белоксодержащего комплекса антигенов Streptococcus pneumoniae в гомологичной системе. Журн. микробиол. 2013, 1: 21-26.
3. Гланц С.А. Медико-биологическая статистика. М., Практика, 1999.
4. Костинов М.П., Андреева Н.П., Петрова Т.И. Клиническая и эпидемиологическая эффективность вакцинопрофилактики пневмококковой инфекции у детей. Эпидемиология и инфекционные болезни. 2013, 3: 45-52.
5. Assaad U., El-Masri I., Porhomayon J., El-Solh A. Pneumonia immunization in older adults: review of vaccine effectiveness and strategies. Clinical Interventions in Aging. 2012, 7: 453461.
6. Grabenstein J.D., Klugman K.P. A century of pneumococcal vaccination research in humans. Clin. Microbiol. Infect. 2012, 18: 1-10.
7. Klugman K.P. Contribution of vaccines to our understanding of pneumococcal disease. Phil. Trans. R. Soc. B. 2011, 366: 2790-2798.
8. Perez-Dorado I., Galan-Bartual S., Hermoso J.A. Pneumococcal surface proteins: when the whole is greater than the sum of its parts. Molecular Oral Microbiology. 2012, 27: 221-245.
9. Westerink J., Schroeder H., Nahm M. Immune responses to pneumococcal vaccines in children and adults: rationale for age-specific vaccination. Aging and Disease. 2012, 1 (3): 51-67.
Поступила 17.02.15
Контактная информация: Воробьев Денис Сергеевич, к.м.н.,
105064, Москва, М. Казенный пер., 5А, р.т. (495)917-49-00
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2015
С.П.Заднова, Н.А.Плеханов, И.М.Крепостнова, П.С.Ерохин, Н.И.Смирнова
ВЛИЯНИЕ ОСМОТИЧЕСКОГО И ОКСИДАТИВНОГО СТРЕССА НА ШТАММЫ ГЕНОВА-РИАНТОВ VIBRIO CHOLERAE БИОВАРА ЭЛЬ ТОР
Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб», Саратов
Цель. Исследование влияния осмотического и оксидативного стресса на выживаемость и изменение фенотипических и генетических свойств штаммов геновариантов V. cholerae биовара Эль Тор. Материалы и методы. В работе было использовано 22 штамма V. cholerae биовара Эль Тор. Фенотипические свойства штаммов изучали на среде LB с добавлением соответствующих ингредиентов. Поверхностные структуры клеток исследовали с помощью сканирующего зондового микроскопа «Solver P47-PRO». ПЦР проводили с использованием специфических праймеров на амплификаторе «Терцик». Результаты. Показано, что через 60 мин инкубации в 3 М растворе NaCl и через 6 мин нахождения в 20 мМ растворе перекиси водорода количество выживших клеток геновариантов было соответственно в 3,0 — 25,0 раз и 4,3 — 7,6 раза больше, чем у типичных штаммов. Один из механизмов повышенной устойчивости геновариантов к высоким концентрациям соли связан с продукцией на поверхности клеток дополнительного экзополисахаридного слоя в более ранние сроки, чем у типичных штаммов. Осмотический стресс вызывает обратимое снижение подвижности в штаммах геновариантов V cholerae биовара Эль Тор. Выявлено, что осмотический и оксидативный стресс приводит к утрате ряда мобильных генетических элементов в штаммах геновариантов. Заключение. Геноварианты V cholerae биовара Эль Тор, вызвавшие вспышки холеры в России в 1993 — 2001 гг., в отличие от типичных штаммов, изолированных в 1970 — 1990 гг., более устойчивы к действию осмотического и оксидативного стресса, что, возможно, способствует их лучшей выживаемости как во внешней среде, так и в макроорганизме.
Журн. микробиол., 2015, № 6, С. 55—62
Ключевые слова: геноварианты Vibrio cholerae биовара Эль Тор, осмотический и оксидативный стресс, выживаемость, изогенные клоны
