Получение конидиального материала спорыньи для проведения работ по воздействию мутагенными факторами Текст научной статьи по специальности «Промышленные биотехнологии»

Электронный научно-образовательный вестник "Здоровье и образование в XXI веке" №2, 2006 г. (Т. 8)

ПОЛУЧЕНИЕ КОНИДИАЛЬНОГО МАТЕРИАЛА СПОРЫНЬИ ДЛЯ ПРОВЕДЕНИЯ РАБОТ ПО ВОЗДЕЙСТВИЮ МУТАГЕННЫМИ ФАКТОРАМИ. Барсегян А.Г., Савина Т.А., Бобылева Р.И.

Всероссийский научно-исследовательский институт лекарственных растений, Москва, Россия.

Спорынья пурпурная (Claviceps purpurea (Fr.) Tul) является основным источником для получения эргоалкалоидов, широко использующихся в современной фармацевтической практике, как в виде индивидуальных препаратов, так и в составе различных многокомпонентых лекарственных средств. Преимущественным сырьем для выделения эргоалкалоидов на сегодняшний день служит паразитарно выращиваемая спорынья. Однако непрерывно ведутся работы по получению сапрофитных штаммов-продуцентов эргоалкалоидов.

Целью настоящей работы было: - подобрать оптимальную плотность конидий в инокулюме для последующего воздействия мутагеном; - изучить морфологию полученных колоний.

В работе использовали рожки спорыньи эргокриптинового штамма F-3602, полученного селекционерами ВИЛАР. Чистую культуру гриба получали из зрелых склероциев спорыньи, которые стерилизовали 0,2% раствором сулемы в течение 2-3 минут и такое же время в 96% этиловом спирте. Простерилизованный таким образом склероций в асептических условиях разрезали на кусочки, переносили в пробирки со скошенной питательной средой и культивировали в термостате в течение 30 суток при температуре (24±1) °С. В состав агаризованной питательной среды входили минеральные соли, углеводы, биологически активные вещества. К 30-суточной культуре в асептических условиях добавляли стерильную дистиллированную воду и при помощи микробиологической петли аккуратно снимали ее с поверхности агара, после чего фильтровали через двойной марлевый фильтр, с целью отделения конидий от кусочков среды, воздушного и поверхностного мицелия. В полученной таким образом водной суспензии подсчитывали число конидий, используя камеру Горяева. Концентрация конидий суспензии составляла 3,5 106шт/мл. Для постановки эксперимента проводили серию разведений исходного раствора: х10, х100, х1000, х10000 и х100000 раз. Посев подготовленных таким образом образцов осуществляли на поверхности агара в чашках Петри (по 0,1 мл каждого раствора). В качестве образца сравнения использовали исходную суспензию конидий (без дополнительного разведения). Наблюдение проводили в течение 20 суток ежедневно.

Было установлено, что рост мицелия гриба начинался на 3 сутки культивирования. В контрольном варианте и в варианте с 10-кратным разбавлением к 14 суткам мицелий образовывал сплошной ковер. В вариантах с разбавлением в 100 и 1000 раз в течение первых 10 суток можно было выделить единичные колонии, которые к 20 суткам также образовывали сплошной ковер. Разбавление в 10000 раз давало ожидаемый результат. Данное разбавление позволяло получить на поверхности агара от 3 до 6 колоний. Данные по влиянию исходной плотности инокулюма на образование колоний гриба приведены в табл.1. Таблица 1

Влияние исходной плотности инокулюма на образование колоний C. purpurea эргокриптинового штамма (F-3602)

Сутки Показатели Разведение

роста х0 (контроль) х10 х100 х1000 х10000 х100000

Фактическое число конидий в 0,1 мл суспензии

3,5105 3,5 104 3,5103 3,5102 3,510 3,5

10 Число колоний сплошной рост сплошной рост до 236 до 128 до 40 до 3

20 Число сплошной сплошной сплошной сплошной сплошной до 6

колоний рост рост рост рост рост

Из

литературных данных известно, что при воздействии мутагенными факторами продуктивные мутанты Qaviceps проявлялись в основном при выживаемости клеток ниже 1%. С учетом этого, для проведения аналогичных работ с культурой эргокриптинового штамма ^-3602) спорыньи, нами были выбраны концентрации с плотностью конидий в диапазоне 3,5 (103-104)шт/мл.

По своей морфологии колонии имеют распростертую с возвышающимся центром форму. Поверхность колоний войлочная, цвет белый, края фестончатые, диаметр 1,7-2,3 см. Центральная часть колонии с возрастом приобретала бежевый оттенок, становилась бархатистой. В начальный период выращивания при микроскопии наблюдалось наличие длинного, местами разветвленного мицелия. На 10-12 сутки начинался конидиогенез, со временем количество конидий увеличивалось.

Материалы VII Международного конгресса «Здоровье и образование в XXI веке»

Стр. [66]