CC BY
157
Экология и биология паразитов
УДК 630.41
ОПТИМИЗАЦИЯ УСЛОВИЙ ВЫДЕЛЕНИЯ И КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ХВОЙНОЙ НЕМАТОДЫ Bursaphelenchus mucronatus В ЛАБОРАТОРНЫХ УСЛОВИЯХ
Е.А. РОГОЖИН
соискатель О.А. КУЛИНИЧ доктор биологических наук
Российская академия наук Центр паразитологии Института проблем экологии и эволюции им. А.Н. Северцова РАН, 119071, Москва, Ленинский проспект, д. 33, e-mail: rea21@list.ru
В лабораторных условиях были проведены опыты по оптимизации условий культивирования хвойной нематоды Bursaphelenchus mucronatus на различных видах грибов-микромицетов. Проведено сравнение различных модификаций вороночного метода выделения нематод, включающих в себя такие параметры как наличие фильтра, температуру и время экспозиции.
Ключевые слова: Bursaphelenchus mucronatus, хвойная нематода, метод Бермана, культивирование, выделение, лабораторные условия.
Древесные нематоды в своем жизненном цикле проходят две альтернативные стадии развития: фитофагии и микохилофагии. Жуки-усачи рода Mo-nochamus в период дополнительного питания переносят нематод с погибшего дерева на здоровое. Нематоды выходят из жука и проникают в ткани здорового дерева, где питаются на клетках смоляных каналов (стадия фитофагии). В дальнейшем, в результате гибели клеток и в итоге всего дерева стволовые древесные нематоды рода Bursaphelenchus переходят на питание другим субстратом - грибами. В мертвой древесине присутствуют различные виды грибов (Gymnopilus, Phaeocollybia и Galerina), на гифах которых и происходит развитие и размножение нематод (стадия микохилофагии) [8]. Наличие на древесном спиле специфического синего окрашивания может являться индикатором присутствия в этом спиле нематод рода Bursaphelenchus [5, 12].
Популяционные показатели древесных стволовых нематод при развитии как на растении-хозяине, так и на грибах зависят от разных факторов: влажности, температурных и аэробных условий. Для некоторых видов древесных нематод рода Bursaphelenchus было доказано, что их жизненный цикл на грибах при оптимальной температуре (25 оС) может продолжаться в среднем 4-5 сут, тогда как при понижении температуры до 12 оС он увеличивается до 12 сут [3, 5, 10, 11]. Повышенная влажность и наличие оптимальных аэробных условий также способствуют развитию нематод [6]. В лабораторных условиях бурсафеленхов обычно культивируют на различных видах фитопатоген-ных грибов или на древесных дисках.
При выделении нематод из древесины или из агаровой пластинки с грибами используют различные модификации метода Бермана [1]. В зависимости от модификации метода Бермана и других условий (аэрации, температуры, наличия фильтра, времени экспозиции) число выделенных нематод может существенно варьировать. Разные исследователи применяют и рекомендуют различные модификации этого метода.
В связи с этим целью наших исследований стало определение оптимальных условий культивирования хвойной нематоды Bursaphelenchus mucronatus на различных видах грибов in vitro; установление оптимальных условий при выделении хвойной нематоды B. mucronatus из древесины с использованием вороночного метода Бермана.
Материалы и методы Биологическим материалом служили нематоды и микроорганизмы. Нематоды. В работе по выделению и культивированию использовали изолят хвойной древесной нематоды B. mucronatus Mamya & Enda, 1979, выделенный из древесины ели (Picea abies) из лесонасаждений Иркутской области.
Микроорганизмы. В работе по культивированию нематод in vitro использовали следующие микроорганизмы: Fusarium graminearum штамм VKM F-1668, Verticillium albo-atrum штамм VKM F-2437, Alternaria solani штамм VKM F-1878, Trichoderma album штамм VKM F-1208. Культуры получены во Всероссийской коллекции микроорганизмов Российской академии наук Института физиологии и биохимии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН. Культуры Botrytis cinerea штамм СГР-1 и Phytophthora infestans штамм «УДАЧА 2» выделены в Лаборатории защиты растений РГАУ-МСХА им. К.А. Тимирязева.
Инокулирование нематод в древесину в лабораторных условиях С целью размножения нематод в древесине использовали цилиндрические участки веток с корой сосны (Pinus sylvestris) длиной около 10 см и диаметром 7-8 см. В древесных болванках были проделаны сверлом с помощью электродрели отверстия, куда вносили нематодный инокулюм. Инокулюм составлял 2000 нематод (имаго и личинки разных возрастов) в 1 мл воды. После инокуляции отверстия снаружи заматывали парафильмом. Инкубирование болванок с инокулятами проводили в термостате при температуре 22 оС в течение 10 нед.
Схема постановки опыта по выделению нематод При выделении нематод из древесины или из агара использовали вороночный метод Бермана. Диаметр стеклянной воронки составлял 10 см. На нижнюю часть резиной трубки, соединенной с воронкой, надевали пластиковую пробирку вместимостью 1,5 мл [1]. Воронку закрепляли на штативе и помещали в нее металлическую сетку с ячейками диаметром около 2 мм, чтобы кусочки растительной ткани не тонули и не забивали отверстия воронки. Далее воронку заполняли чистой водопроводной водой до уровня несколько выше сетки. На сетку помещали небольшие кусочки древесины массой 20 г, нарезанные ручным секатором. В процессе такой экспозиции стволовые нематоды активно выходят из растительной ткани и постепенно оседают на дно пробирки. Необходимо отметить, что, чем лучше аэрация помещенных в воде кусочков растительной ткани, тем более интенсивно происходит выделение из них нематод [2].
При постановке опыта использовали такие факторы, как наличие или отсутствие ватного фильтра в воронках (фактор А), температура (комнатная - 20 °С или повышенная - 27 °С) при выделении (фактор Б) и время экспозиции (24 или 48 ч) (фактор В) (табл. 1.). Общее число вариантов - 8, число повторностей в каждом варианте - 10. Общее число воронок в данном эксперименте - 80.
Подсчет выделенных нематод по каждому варианту осуществляли под бинокуляром МБС-10 в чашке Петри размером 35 х 10 мм с последующим пересчетом на 1 г древесины [2]. Дисперсионный анализ полученных данных проводили с использованием программного обеспечения STRAZ [4].
1. Варианты лабораторного опыта по оптимизации условий выделения хвойных нематод В. тиегопМш вороночным методом Бермана
Вариант Ватный фильтр, Температура вы- Продолжительность
наличие деления, °С экспозиции, ч
есть нет 20 27 24 48
А0Б0В0 + + +
А0Б0В1 + + +
А0Б1В0 + + +
А0Б1В1 + + +
А1Б0В0 + + +
А1Б0В1 + + +
А1Б1В0 + + +
А1Б1В1 + + +
Схема постановки опыта по культивированию нематод на грибах и
оомицете
Культуры грибов и оомицетов выращивали в чашках Петри размером 60 х 15 мм в течение 8-12 сут в зависимости от микроорганизма при оптимальной для каждого вида температуре. Затем в каждую чашку в каплю воды объемом 100 мкл с помощью энтомологической иглы помещали 20 особей нематод (10 самцов и 10 самок), после чего на поверхности мицелия гриба от капли с нематодами с помощью иглы было сделано по 4 радиальных луча для обеспечения лучшего контакта нематод с грибом и лучшего преодоления ими поверхностного натяжения воды. Чашки с нематодами заматывали пара-фильмом и инкубировали в термостате при температуре 25 °С. При проведении учета (21, 28, 35 и 42 сут инкубирования) с поверхности агаризованной питательной среды и крышек чашек Петри проводили пятикратный смыв нематод водой с последующим их помещением в пробирку. Общее число вариантов - 6, число повторностей каждого варианта - 3. Таким образом, общее число чашек Петри в данном эксперименте составило 18. Подсчет нематод проводили в чашке Петри вышеуказанным способом.
Результаты и обсуждение Культивирование хвойной древесной нематоды B. mucronatus на грибах и оомицетах in vitro
Для анализа степени развития нематод B. mucronatus на грибах и оомицете, в качестве контроля использовали вариант с грибом F. graminearum, колонии которого независимо от условий выращивания не образуют конидий. Мицелий этого гриба в культуре in vitro способен долгое время сохраняться в условиях повышенной температуры окружающей среды. Как видно из рисунка 1, по данному варианту в первый день учета было отмечено максимальное общее число особей нематод (более 2 тыс.). При последующем инкубировании в течение трех недель наблюдали тенденцию увеличения популяции B. mucronatus. Нематоды активно питались и размножались на данном виде гриба. Численность нематод при последнем учете достигала 8 тыс. особей.
Другую тенденцию по изменению численности нематод наблюдали в варианте с их культивированием на B. cinerea, изолированном с пораженных листьев шиповника и способен давать в культуре in vitro большое число конидий (в среднем, более 100 тыс. с 1 см ). При первом учете общее число особей нематод было меньше, чем в контроле, причем при дальнейшем культивировании было отмечено увеличение их плотности популяции (более 3 тыс. особей) на фоне постепенного снижения общей биомассы гриба, однако на 35-е сутки средняя численность нематод в данном варианте начала снижаться и ко времени последнего учета уменьшилась более чем втрое (около 1 тыс.) относительно своего максимума. Помимо этого, в процессе инкубиро-
вания было отмечено, что нематоды не поедали споры гриба, а питались преимущественно на тонких гифах грибов.
8000
S
н7ооо
а ^6000
I
^5000 ва
=54000 я S
§¿3000 о
§2000
3^1000
es
о
S 0
Рис.1. Динамика общей численности хвойной нематоды B. mucronatus при культивировании на различных видах грибов in vitro
Важно также отметить, что общее снижение численности нематод в данном варианте коррелировало с постепенным ростом вегетативной массы B. cinerea и образованием склероциев на поверхности питательной среды. Предположительно, данный эффект может являться следствием антибиоза со стороны микроорганизма, который способен к дальнейшему росту за счет конидий. Вероятно, данный гриб не является благоприятным питательным субстратом для нематод-микофилофагов.
Впервые показано развитие древесных нематод в культуре оомицета P. infestans. Нематоды были способны питаться мицелием оомицета. Вероятно, данный пищевой субстрат не является благоприятным для развития B. mucronatus, в связи с этим смертность в популяции была гораздо выше, чем в контроле (среднее число особей в данном варианте при итоговом учете было меньше, чем в контроле при первом учете).
Ранее в опытах in vivo было установлено, что овсяная нематода Aphelen-chus avenae, которая также является типичным микофагом, ограничивала комплекс оомицетов (Phytophthora capsici и Pythium ultimum) на пасленовых в среднем на 50-85 % [7]. Гифы B. sorokiniana и A. solani, как показали результаты эксперимента, не являются оптимальным питательным субстратом для размножения нематод B. mucronatus, однако отдельные особи все же способны развиваться и завершить свой жизненный цикл.
На мицелии гриба V. alboatrum размножение нематод было достаточно оптимальным (средняя плотность популяции в 1 тыс. особей была достигнута на 35-е сутки культивирования). Напротив, развития нематод на мицелии T. album не происходило вовсе. Ранее было выявлено, что нематоды B. xylo-philus развивались на мицелии Verticillium spp. внутри сегментов Pinus densif-lora [9]. При этом через 28 сут инкубирования число особей нематод, выделенных из древесины, было ниже более чем в 100 раз. В то же время при таком же заражении древесных сегментов тремя различными видами грибов рода Trichoderma spp. отмечали разную численность нематод B. xylophilus (от 100 до 10 тыс. в зависимости от вида гриба).
■ F.
graminearum(KOHmpom>) " B. cinerea
■ A solani
" B. sorokiniana
■ V.albo-atrum " T. album
21 28 35 42
День инкубирования
Сравнительное выделение хвойной древесной нематоды В. тисгопаи из древесных субстратов модифицированными методами Бермана Независимо от температуры и продолжительности экспозиции наличие ватного фильтра снижало общее число нематод в пробирках. Однако наличие ватного фильтра позволяет существенно уменьшить количество «древесного мусора» в пробах, который часто мешает при просмотре проб с нематодами и, особенно при их подсчете (табл. 2). Повышенная температура также способствовала более активному выходу нематод из древесных тканей и преодолению преграды в вариантах с ватным фильтром. Аналогичным образом более продолжительное время инкубирования также увеличило среднее число особей при итоговом подсчете.
2. Среднее число особей хвойной древесной нематоды B. mucronatus, выделенных различными модифицированными вороночными методами Бер-_ мана (на 1 г сырой древесины)_
Вариант Температура 20 °С при экспозиции, ч Температура 27 °С при экспозиции
24 48 24 48
Без ватного фильтра 0,33+0,14 0,78+0,12 0,95+0,12 1,26+0,20
С ватным фильтром 0,12+0,02 0,19+0,05 0,26+0,11 0,51+0,15
Таким образом, наибольшее число нематод в пересчете на 1 г сырой древесины было отмечено в варианте выделения при температуре 27 °С, продолжительности 48 ч и при отсутствии ватного фильтра (1,26 особей). При этом в таком же варианте, но с наличием ватного фильтра общее число выделившихся нематод было существенно меньше (0,55 особей). Предполагаем, что это связано с тем, что большему числу крупных в размерах половозрелых особей затруднительно преодолевать волокна целлюлозы ватного фильтра, в то время как личинки преимущественно 2 и 3-го возрастов весьма активно двигаются и проникают через преграду.
Литература
1. Деккер Х. Нематоды растений и борьба с ними. - М.: Колос, 1972. -444 с.
2. Кулинич О.А. Методические указания по выявлению, определению паразитических нематод лесных древесных пород и методы защиты от них. -М., 1990. - 70 с.
3. Кулинич О.А. Сосновая древесная нематода Bursaphelenchus xylophilus // Справочник по карантинным вредителям для территории Российской Федерации. - Нижний Новгород: Арника, 1995. - С. 103-106.
4. Отдел автоматизированных систем управления информационных технологий Российского государственного аграрного университета - МСХА им. К.А. Тимирязева (http: //www .oas .timacad.ru/product/straz .php).
5. Dwinell L.D. Ecology of the Pinewood Nematode in Southern Pine Chip Piles. USDA // Southeastern Forest Experimental Station, Res. Pap. SE-258. -1986. - 14 p.
6. Dwinell L.D. Population dynamics of Bursaphelenchus xylophilus in air-dried loblolly pine wood. - Phitopathology. - 1994. - 1090 р.
7. Garrison M., Qi R., Hu S., Shew D. Suppression of Phytophthora capsici and Pythium ultimum by the fungal-feeding nematode Aphelenchus avenae // Phy-topatology. - 2009. - V. 99 (6 suppl.). - P. 41.
8. Kirk P. M., Cannon P. F. et al. Ainsworth & Bisby's Dictionary of the Fungi (10th edition). - 2008. - Wallingford (UK): CABI Europe-UK.
9. Maehara N., Futai K. Effect of fungal interactions on the numbers of pine-wood nematode, Bursaphelenchus xylophilus (Nematoda: Aphelenchoididae), carried by the Japanese pine sawyer, Monochamus alternatus (Coleoptera: Ceramby-cidae) // Fundam. appl. Nematol. - 1997. - V. 20, № 6. - P. 611-617.
10. Mamiya Y. The Pine Wood Nematode. In "Plant and Insect Nematodes" (Ed. W.R. Nickle). - Marcel Deccer, New-York, 1984. - P. 589-628.
11. Tomminen J., Halik S., Bergdahl D.R. Incubation temperature and Time Effects on Life Stages of Bursaphelenchus xylophilus in Wood Chis // J. of Nema-tology. - 1991. - V. 23, № 4. - P. 477-484.
12. Warren J.E., Edwards O.R., Linit M.J. Influence of bluestain fungi on laboratory rearing of pinewood nematode infested beetles // Fundam. appl. Nematol. - 1995. - V. 18, № 1. - P. 95-98.
Optimization of isolation and cultivation conditions of coniferous nematode Bursaphelenchus mucronatus in laboratory environments
E.A. Rogozhin, O.A. Kulinich
The experiments on optimization of cultivation conditions of coniferous nematode Bursaphelenchus mucronatus on various fungi species were carried out. Paravariations of Baermann funnel method including such parameters as the presence of cotton filter, temperature and time of exposition also were effected.
Keywords: Bursaphelenchus mucronatus, Baermann method, cultivation, allocation, in vitro condition.
