CC BY
305
УДК 630.866.1:633.878.32
БИОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ ЭКСТРАКТОВ И ЭФИРНЫХ МАСЕЛ ПОЧЕК ТОПОЛЯ БАЛЬЗАМИЧЕСКОГО КРАСНОЯРСКОГО КРАЯ
© Е.В. Исаева , Г.А. Ложкина, Ю.А. Литовка, Т.В. Рязанова
Сибирский государственный технологический университет, пр. Мира, 82, Красноярск, 660049 (Россия) E-mail: sibstu@sibstu.kts.ru
В работе представлены результаты исследования антифунгальной, антибактериальной и иммуномоделирующей активности эфирного масла и спиртового экстракта из почек тополя бальзамического Красноярского края.
Введение
Согласно исследованиям ряда ученых [1-3], эфирные масла и спиртовые экстракты почек тополя обладают выраженными антимикробными свойствами, превосходящими по таковым экстракт прополиса, а в ряде случаев и эвкалиптовое масло. По рецептам народной медицины они давно используются для лечения бронхитов, туберкулеза, ревматизма, в качестве ранозаживляющего и противовоспалительного средства.
В последнее время рядом авторов проводятся исследования по влиянию веществ растительного происхождения на ростовые характеристики мицелиальных и дрожжевых грибов [4-6]. Большинство исследований имеет фармакологическую направленность, тогда как возможно использование эфирных масел и растительных экстрактов при хранении зерновых, овощных и плодовых культур для их защиты от многочисленных возбудителей болезней, в том числе грибов рода Fusarium [7].
Антисептические свойства экстрактов почек тополя связывают с наличием в их составе фенолкарбоно-вых кислот и флавоноидов [8]. Поскольку летучие компоненты и флавоноиды почек тополя бальзамического Красноярского края имеют отличительные особенности компонентного состава от тополей других регионов, нами была исследована биологическая активность эфирного масла и спиртового экстракта, полученных из них.
Экспериментальная часть
Объектами исследования служили спиртовый экстракт и эфирное масло почек тополя бальзамического, произрастающего в Красноярске. Для выделения эфирного масла использовали метод гидродистилляции. Этанольный экстракт из почек тополя был получен в оптимальных условиях [9].
Для установления антифунгальной активности были использованы штаммы микроскопических грибов Т11 Fusarium sporotrichiodes Sherb. и Т13 Fusarium moniliforme Sheldon, которые характеризуются высокой степенью токсичности в отношении семян, проростков и сеянцев Larix sibirica L., Picea obovata L. и Pinus sylvestris L. Штаммы проявляют среднюю чувствительность к метаболитам ряда антагонистически активных штаммов грибов рода Trichoderma, а также химическим фунгицидам ТМТД, фундазол и виал-ТТ [10].
Для изучения влияния спиртового экстракта и эфирного масла из почек тополя бальзамического на ростовые характеристики грибов рода Fusarium изучаемые штаммы выращивали на сусловом агаре при 28 °С в течение 7 суток для получения инокулюма. Затем пробойным сверлом диаметром 8 мм из краевой зоны колонии гриба вырезали агаровые блоки и помещали их в центр чашек Петри [11], куда предварительно была внесена сусловая среда, содержащая спиртовой экстракт либо эфирное масло из расчета 1000 мкг/мл и 5000 мкг/мл
* Автор, с которым следует вести переписку.
соответственно. Концентрации исследуемых веществ готовили путем их асептического внесения в колбы Эр-ленмейера, содержащие стерильную и охлажденную до 40 °С питательную среду. В качестве контроля использовали сусловый агар, инокулированный изучаемыми штаммами. Чашки Петри герметично закрывали при помощи клейкой ленты для избегания потерь летучих соединений. Посевы инкубировали при 28 °С в течение 10 суток, измеряя диаметр колонии, скорость роста и микроморфологические особенности. Процентное ингибирование роста грибов (антифунгальную активность) вычисляли по сравнению с контролем [7].
Для определения антибактериальной активности сусловую среду, содержащую спиртовой экстракт либо эфирное масло из расчета 500 мкг/мл и 800 мкг/мл соответственно, засевали бактериями Staphylococcus aureus, Staphylococcus haemoliticus, Staphylococcus caseoliticus, Staphylococcus aldiconicus (штаммы бактерий предоставлены НИИ проблем Севера СО РАН). В качестве контроля использовали сусловый агар, инокули-рованный изучаемыми штаммами. Чашки Петри с посевами бактерий помещали в термостат при температуре 28 °С на 7 суток.
Исследование иммуномодулирующей активности эфирного масла почек тополя проводили на полиморфноядерных нейтрофилах крови здорового человека с использованием 36-канального хемилюминес-центного анализатора «CL3604» (Россия). Оценку спонтанной и индуцированной хемилюминесценции проводили в течение 90 мин на хемолюминометре, определяя следующие параметры: время выхода на максимум, максимальное значение хемилюминесцентной кривой, площадь кривой. Регистрацию результатов и управление хемилюминесцентным анализатором осуществляли через микроЭВМ IBM/АТ. Для исследования в состав стандартных хемилюминесцентных проб вводили 20 мкл спиртового экстракта эфирного масла почек тополя с концентрацией 0,03 г/л.
Обсуждение результатов
В таблице 1 представлен состав компонентов, извлекаемых этиловым спиртом из почек тополя бальзамического.
На долю веществ, обеспечивающих антимикробные свойства экстракта, таких как терпеноиды, флаво-ноиды и гидроксикоричные кислоты, приходится 24% экстрактивных веществ.
В составе флавоноидов почек тополя бальзамического, произрастающего в Красноряком крае, по сравнению с бальзамическими тополями других регионов содержится больше тектохризина, пиноцембрина и хал-конов и значительно меньше пиностробина. Основными компонентами являются 2',6'-дигидрокси-4'-метоксихалкон, 3,4-дигидро-2',6'-дигидрокси-4'-метоксихалкон, пинобаксин и пиноцембрин.
Эфирное масло почек тополя бальзамического Красноярского края характеризуется более высоким содержанием сесквитерпеноидов (94% от эфирного масла). Доля кислородсодержащих компонентов эфирного масла составляет 57%, из которых более 72% приходится на сесквитерпеновые спирты. В составе эфирных масел почек тополя количественно преобладают такие компоненты, как бизаболол, эвдесмол, куркумен и аморфен. Известно, что некоторые производные бизаболола обладают противоопухолевой активностью [12]. В эфирном масле тополей других регионов содержание этих веществ в несколько раз ниже. Высокое содержание сескви-терпеноидов, вероятно, будет обусловливать антимикробные свойства эфирного масла почек тополя.
Установление антифунгальной активности. Грибы рода Fusarium широко распространены в природе и представляют собой обширную, биологически неоднородную группу, в состав которой входят облигатные сапротрофы, факультативные паразиты и факультативные сапротрофы. Их действие на растения определяется совокупностью вирулентных свойств, которые варьируют у различных видов и популяций внутри вида под влиянием растения-хозяина и экологических условий региона [13, 14].
Таблица 1. Состав спиртового экстракта почек тополя бальзамического
Наименование компонента Содержание, % от экстракта
Экстрактивные вещества, в том числе:
углеводороды 7,8
нейтральные липиды 52,4
гликолипиды 18,4
фосфолипиды 1,2
флавоноиды (в пересчете на дигидрокверцетин) 16,2
воскообразные вещества 4,0
хлорофилл, мг% 40,6
каротиноиды, мг% 2,6
Грибы рода Fusarium продуцируют около 150 токсических соединений, представляющих опасность для человека, животных и растений. Фитотоксины, подавляя жизнедеятельность растительных клеток в малых концентрациях, являются детерминантами многих заболеваний растений, в частности фузариозов, и способствуют утомлению почвы вследствие накопления высокотоксичных видов [13-15].
Проведенные исследования показали, что штаммы Т11 и Т13 практически не различаются между собой по скорости роста, как в контрольном, так и опытных вариантах (рис. 1).
При внесении веществ растительного происхождения из почек тополя бальзамического выявлено достоверное снижение скорости роста штаммов по сравнению с контролем. Так, при использовании эфирного масла скорость роста штаммов Т11 и Т13 уменьшилась в среднем в 2,4 и 2,2 раза, при внесении спиртового экстракта - в 6,9 и 6,1 раза соответственно.
На рисунке 2 представлена динамика прироста диаметра колоний штаммов Т11 и Т13 в течение восьми суток культивирования. Отмечена общая тенденция замедления роста на 6—7-е сутки культивирования. В контрольном варианте задержка роста мицелия лимитируется размерами чашки Петри и питательным субстратом, в опытных вариантах, вероятно, внесенными соединениями, обладающими антифунгальной активностью. Минимальный прирост диаметра колоний обоих штаммов происходит при внесении в питательную среду веществ спиртового экстракта.
Штаммы микромицетов обладают различной чувствительностью к изучаемым соединениям. Так, спиртовой экстракт из почек тополя бальзамического в большей степени, а эфирное масло в меньшей обладают выраженной антифунгальной активностью: в отношении штамма Т11 Fusarium sporotrichioides 77,4 и 48,9%, в отношении штамма Т13 Fusarium monШforme 76,7 и 48,3 % соответственно. В ходе проведенных исследований фунгицидной активности выявлено не было, что свидетельствует о необходимости увеличения концентрации исследуемых соединений с целью эффективного ограничения роста фитопатогенных грибов рода Fusarium.
2
s
СВ
о
о
CL
Л
Н
О
о
CL
О
О
4’99 4,82
2,11 2,16
нп
0,72 0,79
контроль эфирное масло спиртовой экстракт
П 777 Fusarium sporotrichioides □ 773 Fusarium moniliforme
Рис. 1. Влияние веществ растительного происхождения на скорость роста микроскопических грибов рода Fusаrium
сутки
-контроль - -эфирное масло —4
сутки
спиртовой экстракт
Рис. 2. Динамика прироста колоний грибов рода Fusarium под влиянием веществ растительного происхождения
Внесение в питательную среду изучаемых соединений оказало влияние на морфологические особенности штаммов микроскопических грибов: отмечено изменение текстуры колоний (рис. 3), особенно при внесении спиртового экстракта, уменьшение плотности и высоты мицелия, отсутствие характерной пигментации мицелия и питательной среды.
Микроскопическое исследование штаммов из контрольных и опытных вариантов позволило выявить резкое уменьшение конидиегенеза обоих штаммов при использовании спиртового экстракта (рис. 4).
Таким образом, эфирное масло и спиртовой экстракт, полученные из почек тополя бальзамического, проявляют антифунгальную активность в отношении фитопатогенных штаммов грибов рода Fusarium, что проявляется в снижении скорости роста и изменении морфологических особенностей мицелия, а также уменьшении показателей конидиегенеза. Изученные соединения растительного происхождения могут оказаться перспективными антимикотиками при правильном подборе концентрации действующего вещества и чувствительной мишени.
Установление антибактериальной активности. Исследование противомикробного действия эфирного масла и спиртового экстракта из почек тополя проводили на бактериях Staphylococcus aureus, Staphylococcus haemoliticus, Staphylococcus caseoliticus, Staphylococcus aldiconicus, обладающих резистентностью ко всем антибиотикам пенициллинового ряда.
Установлено бактерицидное действие спиртового экстракта в отношении Staphylococcus aureus, Staphylococcus haemoliticus, Staphylococcus caseoliticus, бактериостатическое - в отношении Staphylococcus aldiconi-cus. Эфирное масло обладает бактериостатическим действием по отношению ко всем исследованным штаммам Staphylococcus, что согласуются с данными других авторов [16].
Установление иммуномодулирующей активности. Предварительные исследования иммуномодулирующей активности эфирного масла почек тополя, проведенные на полиморфноядерных нейтрофилах крови здорового человека, дали обнадеживающие результаты.
Данные спонтанной хемилюминесценции приведены на рисунке 5.
контроль спиртовой экстракт эфирное масло
Рис. 3. Морфология колоний штамма Т11 Fusarium sporotrichioides на пятые сутки культивирования
контроль спиртовой экстракт эфирное масло
Рис. 4. Морфология конидий штамма Т 11 Fusarium sporotrichioides на третьи сутки культивирования. Увеличение х1000
2000
"е 1600 1
Й 1200 О
о
о
1
§ 800
0
0
1080 2160 3240 4320 5400
Время, с
Рис. 5. Спонтанная хемилюминесценция полиморфноядерных нейтрофилов крови здорового человека:
1 - контрольная проба; 2 - проба с добавлением эфирного масла почек тополя, 3 -проба с добавлением этанола
Как свидетельствуют результаты, эфирное масло почек тополя бальзамического проявляет небольшую иммуностимулирующую активность, так как по сравнению с контрольной пробой и пробой этанола (концентрация спирта идентична концентрации этанола в растворе эфирного масла почек тополя) имеет большую площадь пика хемилюминесценции (в 1,11 и 1,07 раза соответственно).
Таким образом, установлено, что эфирное масло и спиртовой экстракт, полученные из почек тополя бальзамического, произрастающего в Красноярске, проявляют антифунгальную активность в отношении фитопатогенных штаммов грибов рода Fusarium, бактериостатическое и бактерицидное действие по отношению к бактериям рода Staphylococcus и может быть перспективно как для получения лекарственных препаратов, так и препаратов для защиты растений.
Список литературы
1. Браславский В.Б., Куркин В. А., Жданов И.П. Антимикробная активность экстрактов и эфирных масел почек некоторых видов Popuius L // Растительные ресурсы. 1991. Т. 27. Вып. 2. C. 77-81.
2. Куркин В.А., Браславский В.Б., Жданов И.П. Перспективы создания лекарственных препаратов на основе почек тополя // Реализация научных достижений в практической фармации. Харьков, 1991. C. 190.
3. Поляков В.В., Адекенов С.М. Биологически активные соединения растений Populus L. и препараты на их основе. Алматы, 1999. 160 с.
4. Бадалян С.М., Топчян А.В. Исследование природных противогрибковых средств растительного присхождения // Успехи медицинской микологии. М., 2003. С. 88-90.
5. Ермакова Т.С., Титов Л.П. Антимикотическое действие эфирных масел на дрожжеподобные и плесневые грибы // Успехи медицинской микологии. М., 2003. С. 95-96.
6. Молочко В. А., Горбунов В. А. Поиск противогрибковых средств среди препаратов растительного происхождения // Успехи медицинской микологии. М., 2003. С. 102-103.
7. Пячюлите Д.Ю., Мотеюнайте О. Исследование фунгицидного действия эфирных масел // Успехи медицинской микологии. М., 2003. С. 106-109.
8. Scaysbrook T., Greenway W., Whatley F.R Relation of antimicrobial compounds present in poplar bud exudates to disease resistance by poplars // Z. Naturforsch. 1992. V. 47. P. 197-200.
9. Ложкина Г.А., Исаева Е.В., Рязанова Т.В. Влияние различных факторов на процесс экстракции почек тополя бальзамического // Химия растительного сырья. 2007. №2. С. 51-54.
10. Громовых Т.И., Литовка Ю.А., Андреева О.Н. Биологический контроль болезней сеянцев хвойных в лесных питомниках Средней Сибири. Красноярск, 2005. 264 с.
11. Егоров Н.С. Основы учения об антибиотиках. М., 1994. 512 c.
Выводы
12. Itokawa H. Studies on the antitumor bisabolane sesquiterpenoids isolated from Curcuma xantorhiza // Chem.Pharm.Bull.1985. V. 33. №8. P. 3488-3492.
13. Билай В.И. Фузарии. Киев, 1977. 442 с.
14. Nelson P. E., Toussoun T.A, Marasas W.F.O. Fusarium species: An illustrated manual for identification. Pennsylvania State University Press, 1983. 193 p.
15. Монастырский О.А. Токсины фитопатогенных грибов // Защита и карантин растений. 1996. №3. С. 12-14.
16. Поляков В.В., Бекенова Г.Е., Баев А.В. Бактерицидное действие масла почек тополя бальзамического // Поиск. Алматы. 1996. №3. С. 63-65.
Поступило в редакцию 9 ноября 2007 г.
