CC BY
85
Применение
УДК 57З.6.086.8З5:6ЗЗ/6З5
ПРОБЛЕМЫ ПРИМЕНЕНИЯ РАСТИТЕЛЬНЫХ ОТХОДОВ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ ЗАЩИТЫ РАСТЕНИЙ
© Ю.А. Литовка , А.Г. Савицкая1, Т.В. Рязанова1, Н.А. Нешумаева
1 Сибирский государственный технологический университет, пр. Мира, 82, Красноярск, 660049 (Россия), e-mail: litovkajul@rambler.ru 2Красноярский научно-исследовательский институт сельского хозяйства, пр. Свободный, 66, Красноярск, 660062 (Россия)
Представлены результаты исследований по твердофазному культивированию фитотоксичных штаммов рода Fusarium на растительных субстратах - отходах деревоперерабатывающей промышленности, которые являются перспективными субстратами для получения биофунгицидов на основе антагонистически активных штаммов грибов. изучена продуктивность биоконтрольного штамма при совместном культивировании с фитопатогенными грибами на растительных субстратах; отмечена общая тенденция снижения численности фитопатогенных грибов по сравнению с монокультурой. Показано, что штаммы рода Fusarium способны колонизировать кору и древесную зелень пихты, в связи с чем применение этих субстратов в качестве компостов нецелесообразно из-за возможности возникновения эпифито-тий фузариоза.
Ключевые слова: биофунгициды, фитопатогены, растительные субстраты, твердофазная ферментация, Fusarium, Trichoderma.
Введение
Одной из основных причин заболеваний растений в ювенильный период в лесных питомниках является накопление в почве фитопатогенной микофлоры. Ведущую роль в патогенезе играют штаммы видов рода Fusarium, которые имеют обширный ареал, занимая различные экологические ниши, и способны синтезировать токсины широкого спектра действия, ферменты, гормоны и некоторые неидентифицированные биологически активные вещества. Для защиты растений от фитопатогенных грибов используют антагонистические активные штаммы микроорганизмов, в том числе грибы рода Trichoderma. Одним из перспективных направлений по созданию биофунгицидов является использование растительных отходов, при этом успешно решаются сразу несколько проблем: наличие большого количества доступного, дешевого и ежегодно возобновляемого сырья для промышленной биотехнологии, утилизация трудногидролизуемых отходов деревоперерабатывающей промышленности и сельскохозяйственного комплекса и, наконец, получение современных форм комплексных биологических фунгицидов, способных эффективно ограничивать численность фитопатогенных грибов и улучшать структуру почв.
Растительные субстраты, используемые для получения биопрепаратов, играют большую роль в сохранении активности штаммов-антагонистов и повышении их конкурентоспособности при взаимодействии с аборигенной почвенной микрофлорой. Однако при разработке биофунгицидов на растительных отходах зачастую не учитывается тот факт, что в почву попадают дополнительные источники углеродного и азотного питания как для сапротрофов, так и факультативных паразитов, что может оказать негативное влияние на фитопатологическое состояние конкретного микробоценоза и привести к резкому увеличению численности фитопатогенных грибов. В связи с этим, целью работы была оценка возможности колонизировать растительные субстраты фитотоксичными штаммами рода Fusarium, а также изучение продуктивности биоконтрольного штамма на растительных субстратах в монокультуре и совместно с фитопатогенами.
*Автор, с которым следует вести переписку.
Экспериментальная часть
Объектами исследований служили предварительно отобранные по признаку фитотоксичности штаммы грибов рода Fusarium: Т13 Fusarium verticillioides Nirenberg, Т11 Fusarium sporotrichioides Sherb., Б-04-к Fusarium solani Appel & Wollenw. и антагонистически активный штамм МГ6 Trichoderma asperellum Samuels. Штаммы выделены из почвы и корневой системы хвойных и злаковых растений на территории Средней Сибири в 2001-2005 гг. и в настоящее время находятся на хранении в коллекции чистых культур грибов Центра биотехнологии и микологии Сибирского государственного технологического университета (Красноярск).
Для отбора фитотоксичных штаммов грибы рода Fusarium культивировали на токсигенной среде Myro в течение 21 сут при температуре 27±2 °С [1]. Культуральным фильтратом, содержащим смесь микотоксинов, обрабатывали семена хвойных и злаковых растений путем их замачивания в течение 24 ч и последующего проращивания в течение 7-14 сут для определения энергии прорастания, лабораторной всхожести и морфометрических показателей проростков. Высокотоксичными считали изоляты грибов, подавляющие всхожесть семян на 50-100%, среднетоксичными - на 30-50%, и слаботоксичными - менее 30% при достоверной разнице с контролем. Фитотоксическую активность метаболитов отобранных штаммов оценивали на двухсуточных проростках кукурузы [2]. Оценку чувствительности фитопатогенных микро-мицетов к метаболитам биоконтрольного штамма проводили методом агаровых лунок [3].
Для отбора штаммов, способных расти на растительных субстратах, содержащих лигноцеллюлозу, оценивали целлюлолитическую и фенолоксидазную активность. Целлюлолитическую активность культуральной жидкости, полученной на КМЦ-содержащей среде, определяли методом Хагердона - Иенсена [2], основанном на окислении восстанавливающих групп сахаров железосинеродистым калием в щелочной среде и на йодометрическом определении его избытка. Тест на фенолоксидазную активность определяли по реакции Бавендамма на агаризованной среде с танином [2].
Для оценки способности грибов колонизировать растительные субстраты использовали исходную кору пихты, твердый остаток коры пихты после углекислотной экстракции, измельченную древесную зелень пихты, гидролизный лигнин. Субстраты измельчали, стерилизовали под давлением 1,01-105 Па в течение 60 мин и засевали суспензией грибов из расчета 1106 колониеобразующих единиц (кое) на 1 г абсолютно сухого субстрата (а.с.с.). Грибы культивировали в конических колбах объемом 100 мл при начальном рН 6,5, влажности субстратов 70%, температуре 25±2 °С в течение 45 сут.
Биологическую продуктивность оценивали по количеству колониеобразующих единиц на 1 г а.с.с. в динамике в камере Горяева. Для оценки степени утилизации и изменения биохимического состава растительных субстратов грибами рода Fusarium (легкогидролизуемые полисахариды, трудногидролизуемые полисахариды, лигниновые вещества, редуцирующие вещества) проводили химический анализ субстратов до и после биодеструкции по методам, принятым в химии растительного сырья [4]. После культивирования на растительных субстратах повторно оценивали фитотоксичность штаммов Fusarium по описанной методике.
Обсуждение результатов
Исследование культуральных фильтратов двенадцати штаммов рода Fusarium показало, что высокую степень токсичности в отношении семян Picea obovata L., Larix sibirica L. и пшеницы районированного сорта «Тулунская-12» проявили три штамма: лабораторная всхожесть снизилась в 2,9; 3,1 и 11,6 раз на семенах соответствующего сорта (рис. 1).
Морфометрические показатели проростков также оказались меньше по сравнению с контролем, особенно на семенах хвойных пород. Исследование фитотоксической активности отобранных штаммов на двухдневных проростках кукурузы подтвердило данные о высоком уровне накопления фитотоксичных метаболитов и ингибировании ростовых процессов (рис. 2). Динамика фитотоксической активности у трех штаммов была неодинаковой, стабильно высокие значения активности на протяжении исследуемого временного периода отмечены у штамма Т11, что согласуется с данными ряда авторов о токсигенных свойствах представителей вида Fusarium sporotrichioides [1, 5, 6].
Отобранные фитотоксичные штаммы оказались высокочувствительными к действию метаболитов биоконтрольного штамма: диаметр зоны подавления роста фитопатогенов составил 18,6-29,5 мм (табл. 1). Кроме антагонистического действия метаболитов, штамм МГ6 Trichoderma asperellum проявлял высокую гиперпаразитическую активность (3 балла), занимая до 75% площади колонии патогенна с явно выраженным спороношением.
Э 20 -!
го
^ контроль Т11 Т13 Б-04-к
штаммы
□ ель русская И лиственница сибирская □ пшеница "Тулунская 12"
Рис. 1. Влияние культурального фильтрата штаммов рода Гшагшш на лабораторную всхожесть семян хвойных и злаковых растений
аг 12о
8 1оо
X
в О
7 14 21 28
Время, сут
—Ш Т13 •••*•• Б-04-к
Рис. 2. Фитотоксическая активность культуральных фильтратов штаммов рода Гшапиш в отношении двухсуточных проростков кукурузы
Таблица 1. Антагонистическая активность метаболитов штамма МГ6 Тг1сквёвгша asperelluш
Штаммы рода Еизагіиш Антагонистическая активность
Антибиотическая активность (диаметр зоны отсутствия роста, (М±т), мм) Гиперпаразитическая активность (зона колонизации патогена, балл)
Т11 ¥.$рогоЫсЫогс1е$ 29,5±0,24 3
Т13 F. \erticillioides 18,6±0,31 3
Б-04-к F. solani 25,1±0,12 3
Таблица 2. Целлюлолитическая активность штаммов микромицетов при глубинном культивировании на КМЦ-содержащей среде
Штамм, вид Количество глюкозы, мг/мл
Т13 Еизагіиш verticillioides 0,139
Б-04-к Fusariuш solani 0,131
Т11 Fusariuш sporotrichioides 0,129
МГ6 Trichoderшa asperelluш 0,122
Для предварительной оценки способности фитотоксичных штаммов колонизировать растительные субстраты изучали их целлюло-литическую и фенолоксидазную активность.
Глубинное культивирование на жидкой питательной среде с КМЦ показало, что штаммы, отобранные по признаку фитотоксичности, и биоконтрольный штамм обладали целлюлоли-тической активностью. Максимум активности в среднем приходился на 2—4-е сутки культивирования, достоверное снижение активности у всех штаммов происходило на 7-8-е сутки культивирования (табл. 2).
Одним из важных показателей способностей штаммов утилизировать растительные субстраты является их способность окислять лигнин и лигниноподобные вещества. Известно, что виды рода Тпскоёвгша и Ешагшш относятся к группе целлюлозоразрушающих грибов. Однако существуют немногочисленные работы, которые доказывают, что ряд штаммов способен окислять фенольные соединения [7-9]. В наших исследованиях на основании теста Бавендамма на агаризованной среде с танином установлено наличие фенолоксидазной активности I типа только у биоконтрольного штамма МГ6 Тпскоёвгша а^рвгвИиш, которая проявлялась в появлении коричневого пигмента в процессе всего роста гриба за край растущей колонии. При этом добавление танина в питательную среду ограничивало скорость роста колонии и интенсивность спорообразования.
Проведенные исследования фитотоксической и ферментативной активности позволили отобрать для твердофазного культивирования три штамма грибов рода Гшагшш. В качестве выходного параметра культивирования на растительных отходах использовали продуктивность спорообразования. Установлено, что все фитотоксичные штаммы рода Гшагшш колонизируют исследуемые растительные субстраты, однако динамика продуктивности варьировала как между штаммами, так и в зависимости от типа растительного субстрата (рис. 3-5).
кора пихты твердый остаток коры пихты после СО?-экстракции
ТИ РиБОГІит 5рогоїгісЬіоі(іе5 -ш- Т13 РиБагіит \zerticiHioides 0 ^
Б-04-к РиБагіит чоіапі
время, сут
Рис. 3. Продуктивность штаммов рода Етагшш на исходной коре пихты
Рис. 4. Продуктивность штаммов рода Етапиш на коре пихты после углекислотной экстракции
Рис. 5. Продуктивность штаммов рода Ешапиш на древесной зелени
На исходной коре пихты, не подвергавшейся обработке, продуктивность спорообразования была максимальной по сравнению с другими растительными субстратами, при этом штаммы характеризовались схожей динамикой: в среднем выход на стационарную фазу роста соответствовал 30-м суткам культивирования (рис. 3). Процент жизнеспособных клеток по окончании ферментации в среднем составил 93-95%.
Химический анализ коры пихты до и после биодеструкции показал, что штаммы рода Ешапиш изменяют биохимический состав субстрата: содержание редуцирующих сахаров, легкогидролизуемых полисахаридов (ЛГП) и трудногидролизуемых полисахаридов (ТГП) уменьшилось, содержание лигниновых веществ осталось без изменений. Штаммы Т11 и Т13 активнее использовали легкогидролизуемые полисахариды (ЛГП), содержание которых после биодеструкции уменьшилось в 2,8 и 4,1 раза соответственно. Штамм Б-04-к характеризовался минимальным потреблением ЛГП и ТГП по сравнению с другими фитопатогенами, при этом продуктивность спорообразования была максимальной, что вероятно, связано с более активным потреблением редуцирующих сахаров и, следовательно, более высокой скоростью роста.
На твердом остатке коры пихты после углекислотной экстракции максимальная продуктивность всех штаммов зафиксирована на 15 сут культивирования, однако этот параметр был существенно ниже, по сравнению с исходной пихтовой корой. Как и в первом случае, наибольшей скоростью рост обладал штамм Б-04-к Ешапиш &'о1ап1 (рис. 4). Сравнительный химический анализ твердого остатка коры пихты после СО2-экстракции показал, что штаммы Т11 Е. зротоМскШйез и Т13 F.verticillioides активнее использовали ЛГП, содержание которых после биодеструкции уменьшилось в 2,4 и 3,9 раза соответственно. Для штамма Б-04-к Е.8о1ат отмечено использование преимущественно редуцирующих сахаров и ТГП.
Древесную зелень пихты активно колонизировал один штамм Б-04-к, максимальная продуктивность которого отмечена на 15-е сутки культивирования (рис. 5). Остальные фитотоксичные штаммы были практически не способны колонизировать этот растительный субстрат, что, вероятно, связано с особенностями его химического строения и ингибированием роста микроскопических грибов.
После пассажа через растительные субстраты у исследуемых штаммов были повторно исследованы фитотоксические свойства. Установлено, что степень фитотоксичности осталась на прежнем высоком уровне после культивирования на коре пихты. Усиление фитотоксичности отмечено после пассажа через древесную зелень и кору пихты после углекислотной экстракции. Таким образом, из всех исследованных растительных субстратов исходная кора пихты без химической обработки является наиболее благоприятным субстратом для размножения грибов рода Ешапиш, а потому применение коры пихты для компостирования почв, особенно в период посева хвойных или злаковых культур, является нецелесообразным и может привести к существенному накоплению пропагул фитопатогенов в почве. Остальные изученные растительные субстраты менее пригодны для роста фитопатогенов, а значит, представляют интерес как потенциальная основа для создания биофунгицидов.
Рядом авторов уже была доказана способность колонизировать растительные субстраты биоконтрольными штаммами рода Trichoderшa [7-9]. В настоящем исследовании штамм МГ6 Т. а8реге11иш был использован для сравнительного анализа продуктивности биоконтрольного и фитопатогенных штаммов на аналогичных растительных субстратах, а также для оценки его взаимоотношений с фитотоксичными штаммами при совместном твердофазном культивировании.
В таблице 3 представлены данные по биологической продуктивности штамма МГ6 на 30-е сутки культивирования, из которых следует, что титр его клеток на всех растительных субстратах существенно превышает этот показатель фитопатогенных грибов. Максимальная продуктивность отмечена на твердом остатке коры пихты после экстракции сжиженной углекислотой.
Химический анализ субстратов до и после биодеструкции биоконтрольным штаммом выявил общую тенденцию уменьшения количества ТГП и лигниновых веществ на фоне увеличения содержания ЛГП, особенно на твердом остатке коры после углекислотной экстракции. Вероятно, предварительная экстракция сжиженной углекислотой повышает доступ ферментов целлюлоли-тического комплекса к трудногидролизуемым полисахаридам, способствует улучшению структуры субстрата и удалению вещества - ингибиторов роста микроскопических грибов, что в совокупности способствует лучшей адаптации штамма на субстрате и высокой продуктивности.
Совместное культивирование антагонистически активного штамма МГ6 Т. а8реге11иш и фитотоксичных штаммов рода Еивапиш изучали на исходной коре пихты, поскольку этот растительный субстрат оказался наиболее благоприятным для твердофазной ферментации фитопатогенных штаммов. Установлено резкое снижение продуктивности фитопатогенов (в 3,3-42,5 раза) в сравнении с монокультурой (табл. 4), что свидетельствует об угнетении развития грибов рода Еивапиш биоконтрольным агентом. Продуктивность штамма МГ6 в среднем снизилась в 2,1 раза по сравнению с монокультурой, что свидетельствует о конкурентных взаимоотношениях двух штаммов на растительном субстрате.
При совместном культивировании штаммов биодеструкция коры пихты происходила за счет активного потребления ЛГП и ТГП. Процентное содержание лигниновых веществ практически не изменилось, несмотря на то, что штамм МГ6 Т. а8реге11иш в монокультуре утилизировал эти соединения. Вероятно, в условиях жесткой конкуренции происходило использование наиболее энергетически выгодных соединений для ускорения роста и выживания за счет вытеснения конкурентного организма.
Таблица 4. Продуктивность биоконтрольного и фитопатогенных штаммов на коре пихты при совместном культивировании
Выход спор, К±т-107т 'а.с.с.
В монокультуре При совместном культивировании
Еизапит Trichoderma
Т11 К sporotrichioides 6,8±0,02 0,16±0,02 20,0±2,47
Т13 К verticillioides 7,8±0,60 0,28±0,02 14,1±0,31
Б-04-к Е^іат 16,6±0,31 5,1±0,60 13,1±1,08
МГ6 Т.азреггііит 30,9±2,49 - -
Таблица 3. Продуктивность штамма МГ6 ТпсИоёггша аірєгєііиш на растительных субстратах
Субстрат Выход спор, Ы±т -107 т-1а.с.с.
Кора пихты 30,9±0,3
Твердый остаток коры пихты 3 7 ,
после СО2- экстракции
Древесная зелень пихты 25,1±0,3
Заключение
Проведенные исследования позволяют считать наиболее перспективными субстратами для создания биофунгицидов кору пихты после углекислотной экстракции и древесную зелень пихты при подборе оптимальной дозы биоконтрольного штамма и сроков внесения биопрепарата. Применение растительных отходов с целью компостирования и улучшения структуры почвы является проблематичным вследствие возможности активной колонизации последних почвенными фитотоксичными штаммами грибов, что может спровоцировать возникновение локальных или более масштабных эпифитотий фузариоза.
Список литературы
1. Монастырский О.А. Токсины фитопатогенных грибов // Защита и карантин растений. 1996. №3. С. 12-14.
2. Билай В.И. Методы экспериментальной микологии. Киев, 1983. 234 с.
3. Егоров Н.С. Основы учения об антибиотиках. М., 2004. 512 с.
4. Рязанова Т.В., Чупрова Н.А., Исаева Е.В. Химия древесины. Красноярск, 1996. 358 с.
5. Билай В.И., Пидопличко Н.М. Токсинобразующие микроскопические грибы. Киев, 1970. 290 с.
6. Nelson P.E., Toussoun T.A., Marasas W.F.O. Fusarium species: ап illustrated manual for identification, Pennsyl-
vania, 1983, 193 p.
7. Заика Н.А., Громовых Т.И. Твердофазная ферментация сибирских штаммов грибов рода Trichoderma // Сибирский экологический журнал. 2007. №3. С. 471-475.
8. Клягина Ю.П., Смирнов В.Ф., Стручкова И.В., Трофимов А.Н., Кислицын А.Н. Биодеструкция лигнина из древесно-стружечных плит микроскопическими грибами // Химия растительного сырья. 2005. №4. С. 41-44.
9. Махова Е.Г., Рязанова Т.В., Чупрова Н.А. Биодеструкция лиственничной одубины грибами Trichoderma Asperellum, Trichoderma Koningi // Химия растительного сырья. 2001. №4. С. 69-75.
Поступило в редакцию 20 июля 2011 г.
