CC BY
169
УДК 630.866.1
ИССЛЕДОВАНИЕ СПИРТОВОГО ЭКСТРАКТА ПОЧЕК ТОПОЛЯ БАЛЬЗАМИЧЕСКОГО
© Е.В. Исаева , Г.А. Ложкина, Т.В. Рязанова
Сибирский государственный технологический университет, пр. Мира, 82, Красноярск, 660049 (Россия) E-mail: sibstu@sibstu.kts.ru
В настоящей работе с использованием хроматографических и спектральных методов анализа определен состав веществ почек тополя бальзамического, растворимых в этаноле. Показано, что основной группой соединений спиртового экстракта являются нейтральные вещества, более 60% которых составляют ацилглицериды и эфиры стеринов. В составе спиртового экстракта обнаружены также сесквитерпеноиды и флавоноиды - вещества, обладающие антимикробным действием. Результаты исследования свидетельствуют о возможности использования почек тополя бальзамического как сырья для получения препаратов различной направленности.
Ключевые слова: тополь бальзамический, почки, спиртовый экстракт.
Введение
При существующих способах переработки лесных ресурсов в основное производство преимущественно вовлекают древесину, реже кору. Оставшиеся отходы (ветви, листья) не находят должного применения, в то время как потребность народного хозяйства в древесном сырье возрастает, а его запасы недостаточно полно возобновляются. При этом все чаще обращаются к идее использования вегетативной части быстрорастущих растений, среди которых первое место принадлежит тополю.
Род тополь (Populus L.) относится к семейству ивовых (Salicaceae), интересен по своему многообразию, запасам и распространению. Обладает уникальными биологическими особенностями (высокая скорость роста надземных органов, мощное развитие корневой системы, транспирация и фотосинтезирующая поверхность листьев), свидетельствующими о большой устойчивости, высокой продуктивности и об исключительной конкурентоспособности тополя по сравнению с медленно растущими растениями.
На территории Восточной Сибири встречаются белый, лавролистный, черный, душистый, бальзамический тополи, а также осина [1]. Наиболее изученными являются тополь белый (P. alba L.), черный, или осокорь,(P.nigra L.), и осина (P. tremula L.). Бальзамические тополи (P. balzamifera L.) достаточно широко представлены в культурах и используются для озеленения городов.
Ежегодно в целях оздоровления насаждений тополей производятся обрезки кроны деревьев. В зависимости от времени проведения данных работ обрезки представляют собой ветви с почками или листьями. Учитывая большое количество насаждений тополей, на свалки вывозятся огромные объемы отходов, которые для предотвращения загрязнения окружающей среды целесообразно вовлекать в комплексную переработку. В связи с проблемой утилизации биомассы дерева в целом важной задачей становится исследование ее химического состава.
Изучению химического состава тополей, содержащихся в них биологически активных соединений и возможности получения на их основе продуктов различного назначения посвящен ряд публикаций [2-7].
В настоящей работе приведены результаты определения химического состава веществ почек тополя бальзамического, растворимых в этаноле.
* Автор, с которым следует вести переписку.
Экспериментальная часть
Объектом исследования служил экстракт, полученный в результате обработки этиловым спиртом почек тополя бальзамического в условиях, описанных в работе [8]. Пробу почек отбирали в районе Красноярска в апреле 2006 г.
При исследовании группового состава этанольного экстракта в нашей работе мы опирались на методики, хорошо зарекомендовавшие себя при изучении экстрактивных веществ как хвойных, так и лиственных пород [4, 9]. Этанольные экстракты почек тополя бальзамического исследовали по схеме, представленной на рисунке 1.
Для фракционирования спиртового экстракта использовали растворители с различной полярностью. Для этого этанольные экстракты упаривали под вакуумом, остаток растворяли в горячей воде и проводили последовательную экстракцию петролейным эфиром, диэтиловым эфиром, этилацетатом и бутанолом. Количество веществ, переходящих в растворители, определяли весовым методом [4].
Качественный состав нейтральных веществ анализировали методом тонкослойной хроматографии на силикагеле в системе петролейный эфир - диэтиловый эфир - уксусная кислота (80 : 20 : 1) и (70 : 30 : 1), гептан - бензол (9 : 1). В качестве проявителя применяли пары йода и фосфорно-молибденовую кислоту. Идентификацию компонентов проводили сравнением их хроматографической подвижности (Яс) с литературными данными. Препаративное разделение осуществляли методом элюентной хроматографии на активированном силикагеле марки Ь 40/100. В качестве элюентов использовали гексан и диэтиловый эфир [10]. Контроль над разделением осуществляли методом микротонкослойной хроматографии. Содержание каждой фракции рассчитывали весовым методом.
Летучие компоненты экстрактов исследовали на хромато-масс-спектрометре НР6890 с М5Б5972. Условия хроматографирования: колонка НР-5 (кварц, 30 м х 0,25 мм, толщина пленки 0,25 мкм), газ-носитель - гелий (постоянный поток 1 мл/мин). Температура колонки: 50 °С (изотерма 2 мин), 50-200 °С (4 °С/мин), 200-280 °С (20 °С/мин), 280 °С (изотерма 5 мин). Температура испарителя: 280 °С, температура источника ионов: 173 °С, температура интерфейса между ГХ и МС детектором: 280 °С, объем пробы: 1 мкл раствора с разделением потока 20 к 1. Ионизация: электронный удар (70 эв), сбор данных: 1,2 скан./с при массовой области 30-650 а.е.м.
Рис. 1. Схема исследования химического состава этанольного экстракта
Анализ фенольных соединений почек тополя выполняли методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) на жидкостном хроматографе Agilent 1100 (Agilent Technologies, США) с диодноматричным детектором Agilent 1100 Series Diode Array, автосамплером и программным обеспечением обработки хроматографических данных ChemStation. Условия хроматографирования: колонка, заполненная об-ращено-фазовым сорбентом ZORBAX Eclipse XDB-C8, 4,6х150 мм. Температура 25 °С. Градиентное элюирование в системе метанол - 0,1% CF3COOH (от 20 до 100% метанола), расход элюента - 0,8 мл/мин, объем пробы - 2 мкл, аналитические длины волн 220, 254, 290, 326 и 360 нм.
Липиды извлекали модифицированным методом Блая и Дайера. Разделение липидов на группы осуществляли при помощи колоночной хроматографии на силикагеле марки L 100/250 последовательным элюированием растворителями с повышением их полярности. Применяли следующие растворители: хлороформ, ацетон, изопропиловый спирт [10].
Жирные кислоты, полученные в результате щелочного гидролиза липидов, переводили в метиловые эфиры и исследовали на хромато-масс-спектрометре GCD Plus «Hewlett Packard», США, с капиллярной колонкой НР-5 с диаметром 0,32 см, длиной 300 см. Условия анализа: газ-носитель - гелий, скорость 1 мл/мин, температура колонки 180-230 °С, скорость нагрева 3 °С/ мин.
Анализ углеводов осуществляли по методике, приведенной в работе [11]. Состав свободных моносахаридов был подтвержден методом газохроматографического анализа в виде их триметилсилиловых эфиров на хроматографе ЛХМ-80. Разделение осуществляли на металлической колонке, заполненной Cromato n-N-AW-НMDS (0,125-0,160 мм) с нанесенным 5% SE-30; в качестве подвижной фазы использовали гелий. Температура колонки 180-230 °С, испарителя и детектора - 200 °С; скорость нагрева 4 °С/ мин.
Результаты и их обсуждение
Для промышленной оценки сырья необходимо знание группового состава экстрактов, которое позволит оценить возможные выходы групп веществ и определить последующие технологические решения.
Спиртовый экстракт из почек тополя представляет собой жидкость темно-коричневого цвета со специфическим запахом, свойственным используемому сырью, с содержание сухих веществ 34% от массы абсолютно сухого сырья (а.с.с.).
При выдерживании спиртового экстракта на холоде из него выпадают воска. Содержание воска в почках тополя составило около 2,0% на а.с.с., что сопоставимо с содержанием воска в хвойных [12]. В сухом виде это порошок светло-желтого цвета, при добавлении даже небольшого количества этанола - вязкая пастообразная масса. Температура плавления 53 °С. Содержание неомыляемых веществ около 30%, омыляемых -до 70%. Исследование растворимой в хлороформе части восков показало наличие углеводородов парафинового ряда (n-пентакозан, гептакозан, октакозан), алифатических одноатомных спиртов и их эфиров (1-гептатриакотанол и Е-10,13,13-триметил-11-тетрадецен-1ол ацетат).
Фракционирование веществ, содержащихся в спиртовом экстракте образцов почек тополя, проводили после его осветления с использованием растворителей с различной полярностью: петролейный эфир (ПЭ), диэтиловый эфир (ДЭ), этилацетат (ЭА) и бутанол (Бут). Результаты приведены на рисунке 2.
Характер распределения фракций спиртового экстракта почек тополя подобен почкам березы [13, 14], качественный состав веществ - различен.
Рис. 2. Фракционный состав спиртового экстракта почек тополя бальзамического
□ ДЭ
остаток
Установлено, что из экстракта почек в петролейный эфир переходит около 5% спирторастворимых веществ. Основными компонентами являются моно- и сесквитерпеноиды, не содержащие в своей структуре кислород: куркумен, аморфен, бизаболен, фарнезен, кариофиллен, иланген и др. (65% и более от веществ, извлекаемых петролейным эфиром), н-алканы (С23-С29), жирные кислоты (пальмитиновая, олеиновая и ли-нолевая), частично пигменты (3,0 мг% каротиноидов, 9,7 мг% зеленых пигментов) и другие вещества.
Наибольшее количество веществ из этанольного экстракта почек тополя извлекается диэтиловым эфиром - 72%. При разделении этой группы веществ с помощью колоночной хроматографии получили 6 фракций. Результаты хроматографирования приведены в таблице 1.
Исследования фракций с использованием хроматографических и спектральных методов анализа показали, что в состав нейтральных веществ входят преимущественно нейтральные кислородсодержащие соединения, среди которых основное место занимают классы сложных эфиров и спиртов. Сложные эфиры представлены несколькими группами соединений: моно-, ди-, триацилглицериды (58% от суммы веществ, растворимых в ДЭ), эфиры стеринов (эргостерилацетат), ацетаты монотерпеновых спиртов (пренилацетат и бензилацетат). В составе углеводородов значительна доля терпеноидных спиртов: монотерпеновый спирт - линолоол, сескви-терпеновые спирты - бизаболол, эвдесмол, эремолигенол, сесквицинеол, на долю которых приходится около 8% веществ экстракта. Обнаружен ациклический дитерпеноид фитол и изофитол (около 0,1%). В состав веществ, растворимых в диэтиловом эфире, частично входят гликолипиды и метоксилированные фенольные соединения (2',6'-дигидрокси-4'-метоксихалкон и производные кофейной кислоты).
Установлено, что этилацетат извлекает более полярные фенольные соединения указанных классов, некоторые гликозиды и частично полярные липиды. На долю веществ, извлекаемых этилацетатом, приходится около 9% этанольного экстракта, полученного из почек тополя. В составе этилацетатного экстракта почек тополя фенольные соединения распределяются следующим образом: халконы (более 40%), флаванонолы (16%), коричные кислоты и их производные (16%), флаваноны (9%), флавоны (6%) и флавонолы (около 2%). Индивидуальные соединения флавоноидов, идентифицированные методом ВЭЖХ, приведены в таблице 2.
Также в состав экстракта входят фосфо- и частично гликолипиды [7, 15].
Из литературы известно, что бутанолом извлекаются гликозиды фенольных соединений, ацилированных фенолокислотами, уксусной кислотой или метоксилированных по углеводной части молекул [4]. В спиртовом экстракте почек тополя содержится 7% бутанолорастворимых веществ, установление состава которых является предметом дальнейших исследований.
Таблица 1. Результаты разделения нейтральных веществ, извлекаемых диэтиловым эфиром из почек тополя бальзамического, на колонке с силикагелем
Фракция Содержание, % от суммы веществ, растворимых в ДЭ Элюент: гексан - диэтиловый эфир Соединения
1 17,8 100 : 0 Углеводороды
2 4,8 99 : 1 Эфиры стеринов
3 20,3 95 : 5 Триацилглицериды
4 11,9 92 : 2 Свободные жирные кислоты
5 27,1 85 : 1 Диацилглицериды
6 10,6 0 : 100 Моноацилглицериды
Таблица 2. Содержание флавоноидов и коричных кислот в этилацетатном экстракте
Соединение Содержание, % от а.с.с.
3,4-дигидро-2',6'-дигидрокси-4'-метоксихалкон 0,17
Пиноцембрин 0,17
Пинобаксин 0,27
Хризин 0,17
Галангин 0,02
2',6'-дигидрокси-4'-метоксихалкон 0,19
Пиностробин 0,16
Тектохризин 0,11
Коричные кислоты и соединения коричного типа 0,44
В применяемые для разделения органические растворители переходит 93% веществ, экстрагируемых из почек тополя бальзамического этиловым спиртом. Остальное количество веществ, входящих в состав эта-нольных экстрактов, как показали наши исследования, состоит из углеводов, не растворимых в использованных растворителях. Определение восстанавливающей способности водного остатка показало наличие в нем свободных моносахаридов (0,12% а.с.с.), сахарозы (0,42% а.с.с.) и более трудногидролизуемых дисахаридов (1,79% а.с.с.), что согласуется с ранее полученными данными [16]. Хроматографическими методами в их составе обнаружены галактоза, глюкоза и фруктоза.
Содержание суммарных липидов в почках тополя бальзамического составляет около 65% от экстрактивных веществ, растворимых в этаноле. С помощью колоночной хроматографии липиды разделяли на три группы. Нейтральные липиды составляют около 69%, гликолипиды - около 30%; фосфолипиды - до 1% от суммы липидов почек. С использованием метода ВЭЖХ был изучен жирно-кислотный состав липидов почек тополя бальзамического. Результаты приведены в таблице 3.
Результаты идентификации эфиров жирных кислот свидетельствуют о том, что основными в липидах почек тополя являются кислоты ряда пальмитиновой и стеариновой кислот. Значительную долю ненасыщенных жирных кислот нейтральных и фосфолипидов в почках тополя представляют диеновые (более 60% от суммы ненасыщенных жирных кислот), в гликолипидах - триеновые (около 42%) кислоты.
Таблица 3. Состав жирных кислот липидов почек тополя бальзамического
Наименование кислот Содержание, % от суммы кислот
нейтральные липиды гликолипиды фосфолипиды
Нонановая 0,2 - 0,2
Декановая 0,4 0,6 0,4
Додекановая 0,7 0,9 1,2
Тетрадекановая 1,7 3,9 3,2
Пентадекановая - 1,2 1,2
Гексадекановая 24,3 28,2 33,1
цис-9-гексадеценовая 1,2 4,2 1,4
Октадекановая 12,2 16,7 6,7
цис-9-октадеценовая 5,2 12,2 6,5
9,12-октадекадиеновая 22,2 11,8 27,7
6,9,12-октадекатриеновая 7,6 20,5 10,2
Эйкозановая 7,2 - -
Изогенкозановая 4,2 - -
Генкозановая 6,0 - -
Докозановая 7,0 - 3,3
Нами была исследована биологическая активность спиртового экстракта. Установлено, что спиртовой экстракт почек проявляет антифунгальную активность в отношении фитопатогенных штаммов грибов рода Fusarium, бактериостатическое и бактерицидное действие по отношению к бактериям рода Staphylococcus.
Выводы
В результате проведенных исследований установлено, что основной группой соединений спиртового экстракта являются нейтральные вещества, более 60% которых составляют ацилглицериды, эфиров стеринов. В составе спиртового экстракта обнаружены также сесквитерпеноиды и флавоноиды - вещества, обладающие антимикробным действием. Результаты исследования свидетельствуют о возможности использования почек тополя бальзамического, произрастающего в Красноярске, как сырья для получения препаратов фенольных веществ и липидного концентрата, на основе которых могут быть получены лекарственные формы различной направленности и косметические препараты.
Список литературы
1. Бакулин, В.Т. Интродукция и селекция тополя в Сибири. Новосибирск, 1990. 174 с.
2. Поляков В.В., Адекенов С.М. Биологически активные соединения растений Populus L. и препараты на их основе. Алматы, 1999. 160 с.
3. Сенцов М.Ф. и др. Сравнительное исследование компонентного состава почек некоторых видов Populus L методом ВЭЖХ // Растительные ресурсы. 1997. Т. 33. Вып. 2. С. 5.
4. Рощин В.И. и др. Групповой состав экстрактивных веществ листьев и побегов осины // Химия древесины. 1986. №4. С. 106-109.
5. Фуксман И. Л., Понькина Н.А. Нейтральные вещества элементов фитомассы Populus tremula L. // Растительные ресурсы. 1992. Вып. 3. С. 94-99.
6. Isidorov V.A., Vinogorova V.T. GC-MS analyses of compounds extracted from buds of Populus balsamifera and Populus nigra // Z. Naturforsch. 2003. C. 355-360.
7. Исаева Е.В., Рейсер Г.В., Бурдейная Т.М. К вопросу о комплексном использовании вегетативной части тополя // Химия и химическая технология. 2007. Т. 50. Вып. 6. С. 53-55.
8. Ложкина Г.А., Исаева Е.В., Рязанова Т.В. Влияние различных факторов на процесс экстракции почек тополя бальзамического // Химия растительного сырья. 2007. №2. С. 51-54.
9. Рощин В.И. и др. Состав экстрактивных веществ хвои и побегов ели европейской // Химия древесины. 1983. №4. С. 56-61.
10. Кейтс М. Техника липидологии. М., 1975. 322 с.
11. Исаева Е.В., Рязанова Т.В. Групповой состав углеводов почек тополя // Химия растительного сырья. 2006. №1. С. 33-36.
12. Лебедева О.И., Рубчевская Л.П., Репях С.М. Воск хвои пихты сибирской и сосны обыкновенной // Химия древесины. 1991. №5. С. 88-90.
13. Ведерников Д.Н. и др. Групповой состав компонентов почек Betula pendula Roth // Растительные ресурсы. 2004. Т. 40. Вып. 2. С. 83-88.
14. Галашкина Н.Г., Ведерников Д.Н., Рощин В.И. Флавоноиды почек Betula pendula Roth // Растительные ресурсы. 2004. Т. 40. Вып. 1. С. 62-68.
15. Исаева Е.В., Волошина С.Г. Гликолипиды почек тополя // Вестник СибГТУ. 2001. №2. С. 124-127.
16. Исаева Е.В., Рязанова Т.В. Групповой состав углеводов почек тополя // Химия растительного сырья. 2006. №1. С. 33-36.
Поступило в редакцию 7 апреля 2008 г.
После переработки 10 февраля 2009 г.
