CC BY
166
УДК 630.866.1
ФЛАВОНОИДЫ ПОЧЕК ТОПОЛЯ БАЛЬЗАМИЧЕСКОГО (POPULUS BALZAMIFERA L.), ПРОИЗРАСТАЮЩЕГО В КРАСНОЯРСКЕ.
1. ФЛАВОНОИДЫ ЭТИЛАЦЕТАТНОГО ЭКСТРАКТА ПОЧЕК ТОПОЛЯ БАЛЬЗАМИЧЕСКОГО
© Е.В. Исаева1, Г.А. Ложкина1, Т.В. Рязанова1, С.В. Морозов2, Е.И. Черняв
1 Сибирский государственный технологический университет, пр. Мира, 82, Красноярск, 660049 (Россия) E-mail: [email protected] 2Новосибирский институт органической химии им. Н.Н. Ворожцова СО РАН, ул. Лаврентьева, 9, Новосибирск (Россия)
В работе приведена динамика содержания флавоноидов в различные периоды развития тополя бальзамического, произрастающего в Красноярске. С использованием метода ВЭЖХ исследованы флавоноиды, входящие в состав этил-ацетатного экстракта почек тополя. Показано, что их состав отличается от тополей других регионов.
Ключевые слова: тополь бальзамический, почки, флавоноиды, ВЭЖХ.
Введение
Почки тополя богаты экстрактивными веществами, обладающими широким спектром биологической активности. Исследованиями, проведенными ранее, было установлено, что как с технологической, так и с экономической точки зрения наиболее эффективным растворителем для извлечения экстрактивных веществ почек тополя является этанол. Доля спирторастворимых веществ составляет в среднем 35-45% от массы сырья в зависимости от фазы развития дерева [1]. Для оценки почек как промышленного сырья необходимо знание группового состава экстрактов, которое позволит оценить возможные выходы групп веществ и определить последующие технологические решения.
При исследовании состава экстрактивных веществ почек тополя бальзамического в данной работе мы опирались на методики, зарекомендовавшие себя при изучении древесной зелени как хвойных, так и лиственных пород [2, 3]. Спиртовые экстракты фракционировали с использованием растворителей различной полярности: петролейный эфир, диэтиловый эфир, этилацетат и бутанол [2], что позволило сконцентрировать группы компонентов, различающихся по классам органических соединений.
Как показывают результаты исследований, в петролейный эфир переходит от 3,7 до 5,2% экстрактивных веществ почек [4]. Установлено, что основными компонентами являются моно- и сесквитерпеноиды, не содержащие в своей структуре кислород, н-алканы, жирные кислоты, частично пигменты и другие вещества.
Наибольшее количество веществ из этанольного экстракта почек тополя извлекается диэтиловым эфиром -71-78%. Экстрагируются в основном нейтральные кислородсодержащие соединения, среди которых основное место занимают классы сложных эфиров и спиртов. Диэтиловым эфиром также извлекается часть гликолипидов, метоксилированных фенольных соединений (фенолокислоты и флавоноиды).
Более полярные фенольные соединения указанных классов и частично полярные липиды извлекаются этилацетатом. На долю этих веществ приходится около 9% а.с.в. этанольного экстракта, полученного из почек тополя.
* Автор, с которым следует вести переписку.
Известно, что бутанолом могут извлекаться гликозиды фенольных соединений, ацилированных феноло-кислотами, уксусной кислотой или метоксилированных по углеводной части молекул [2]. Из спиртового экстракта почек тополя в бутанол переходит 7% веществ.
Цель настоящей работы - исследование фенольных соединений, входящих в состав этилацетатного экстракта.
Имеющиеся литературные сведения указывают на наличие в коре и почках тополей (белого, черного, лавролистного, душистого) фенолглюкозидов, фенолкарбоновых кислот (кофейная, феруловая, гидроксико-ричная), флавоноидов, дубильных веществ [5]. Многие из этих соединений интересны с фармакологической и терапевтической точек зрения. Кроме того, большинство фенольных соединений обладают антимикробной активностью и антиоксидантными свойствами [6-8].
Наиболее многочисленной группой природных фенольных соединений являются флавоноиды. Известно, что для почек тополя характерно наличие флаванонов, флавонов, флавонолов и др. [9, 10]. Они принимают участие в фотосинтезе, образовании лигнина и суберина, в качестве защитных агентов в патогенезе растений [11].
Состав фенилпропаноидов почек тополя зависит от целого ряда факторов, таких как вид и форма тополя, фаза развития, место произрастания и др.
Так, в почках тополей (P. nigra, P. trichocarga, P. grandidentata), произрастающих в Германии, идентифицированы фенольные соединения - и-гидроксиацетофенон, диметилкофейная кислота, циннамоил-циннамат, ванилин и ряд флавоноидов - хризин, хризин-7-метиловый эфир, апигенин, галангин, 7-метилгалангин, 7-метилкемпферол, кверцетин, 7-метилкверцетин и 3,7-диметил кверцетин, пиноцембрин, 7-метил-пиноцембрин, 2,5-дигидрокси-7-метоксифлаванон и 2',6'-дигидрокси-4'-метоксихалкон. В P. nigra было идентифицировано ранее неизвестное соединение - диметилаллильный эфир кофейной кислоты [12].
В почках бальзамических тополей, произрастающих в Северном Казахстане, установлено наличие в составе полифенолов таких соединений, как пиностробин, пиноцембрин, хризин, тектохризин, апигенин, кемпферол, кверцетин, мирицетин, галангин, изальпинин, изорамнетин, рамнетин, 2,6-дигидрокси-4'-метоксихалкон и 4',6'-дигидроксихалкон. В составе почек тополя обнаружены также протокатеховая, галловая, транс-коричная, и-кумаровая, феруловая и кофейная кислоты [13].
Для изучения различных групп фенольных соединений, выделяемых из растений, широко применяется метод высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) [10, 14], который был использован нами для изучения индивидуального состава флавоноидов почек тополя, входящих в состав этилацетатной фракции спиртового экстракта.
Экспериментальная часть
Объектом исследования служили почки тополя бальзамического, произрастающего на территории Красноярска. Отбор проб проводили с деревьев 30-летнего возраста в третьей декаде каждого месяца. Пробы почек усредняли по высоте кроны дерева, для выделения экстрактивных веществ использовали 96%-ный этанол. Условия процесса экстракции изложены в работе [15].
Содержание флавоноидов определяли спектрофотометрическим методом на спектрофотометре СФ-26 в пересчете на дигидрокверцетин по методике, предложенной В. А. Куркиным и В.Б. Браславским [16].
Анализ фенольных соединений почек тополя выполняли методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) на жидкостном хроматографе Agilent 1100 (Agilent Technologies, США) с диодноматричным детектором Agilent 1100 Series Diode Array, автосамплером и программным обеспечением обработки хроматографических данных ChemStation. Условия хроматографирования: колонка, заполненная об-ращенно-фазовым сорбентом ZORBAX Eclipse XDB-C8, 4,6х150 мм. Температура - 25 °С. Градиентное элюирование в системе метанол - 0,1% CF3COOH (от 20 до 100% метанола), расход элюента - 0,8 мл/мин, объем пробы - 2 мкл, аналитические длины волн - 220, 254, 290, 326 и 360 нм.
ВЭЖХ/МС-анализ осуществляли с использованием жидкостного хроматографа с диодно-матричным и масс-селективным детекторами «Agilent 1100 Series LC/MSD». Для масс-селективного детектора был использован метод химической ионизации при атмосферном давлении (APCI). Сканирование отрицательных ионов с m/z 100-700 с дискретностью m/z 0,1. Рабочие параметры для APCI: поток газа-осушителя (азот) -4 л/мин с температурой 340°С. Температура испарителя - 400 °С. Разделение проводилось на колонке 4,6x150 мм, заполненной обращенно-фазовым сорбентом Zorbax Rx-C18, 5цт.
Обсуждение результатов
Установление наличия флавоноидов в исходном спиртовом экстракте, полученном из почек тополя бальзамического, и этилацетатной вытяжке проводили с использованием УФ-спектроскопии. На рисунке 1 представлен УФ-спектр экстрактов, выделенных из почек тополя.
Из рисунка 1 видно, что УФ-спектры спиртового и этилацетатного экстрактов почек тополя бальзамического имеют основные максимумы поглощения при длине волны около 290 и 323 (326) нм. Аналогичные результаты получены для раствора образца пиностробина [10]. Кроме того, в этой области УФ-спектра находится один из максимумов поглощения гидроксикоричных кислот, в частности феруловой кислоты (Хмакс 291 и 323 нм), которые присутствуют в почках тополя. Известно, что подобный УФ-спектр имеет и раствор кофейной кислоты (Хмакс 299 и 326 нм), также найденной в экстракте из почек тополя [12, 17]. Сопоставление полученных нами результатов с литературными данными позволило сделать вывод о том, что характер кривой поглощения экстрактов из почек тополя определяется, в основном, веществами флавоноидной природы.
На рисунке 2 приведено содержание флавоноидов в почках тополя бальзамического в различные периоды развития дерева.
I), е.о.п 0.7
0.6
0.5
0,4
0.3
0.2
0,1
0 -|-------1------1-------1------1------1-------1------1------1-------1------1------1 Л.
240 250 260 270 280 290 300 310 320 330 340 350
Рис. 1. УФ-спектр спиртового (а) и этилацетатного (б) экстрактов почек тополя бальзамического
о
о
ей
н
о
«
о
ч
8
§
о
■е
ч
о
и
3
и
12
10
октябрь ноябрь декабрь январь февраль март апрель
Месяц отбора проб
8
6
4
2
0
Рис. 2. Содержание флавоноидов в почках тополя бальзамического
Для данной группы веществ характерно наличие двух максимумов - зимнего и весеннего. Изменения в содержании флавоноидов, вероятно, обусловлены тем, что, входя в состав фенольных соединений, они играют важную роль в обмене веществ. К одной из важнейших функций фенольных веществ относят их участие в процессе дыхания за счет обратимого окисления и восстановления, кроме того, эти соединения выполняют в растениях также защитные функции, связанные с воздействием неблагоприятных условий среды [18-20]. Возможно, этим обусловлено некоторое снижение в содержании флавоноидов в зимнее время. Фенольные соединения участвуют в процессе роста растений, исполняя роль стимуляторов, и наиболее интенсивно образуются в молодых, энергично растущих тканях, к которым можно отнести и почки растений. Как свидетельствуют результаты исследований, содержание флавоноидов в почках тополя увеличивается с началом периода вегетации (март).
Общее количество флавоноидов в исследуемых нами почках тополя бальзамического составило 7,511,1% от а.с.с. Например, в группе бальзамических тополей из Самарского ботанического сада в почках содержится 34,6-35,2% флавоноидов [9], Петропавловска (Казахстан) - 1,96% в пересчете на кверцетин [13].
Качественный и количественный анализ этилацетатного экстракта почек тополя бальзамического выполнен методом ВЭЖХ. В качестве аналитических длин волн использовали 290 и 326 нм, которые были выявлены как основные в УФ-спектре этилацетатного экстракта тополя бальзамического (см. рис. 1).
Для этилацетатного экстракта на рисунке 3 приведен хроматографический профиль, анализ которого позволяет выявить основную группу сигналов с временами выхода 15,5-18,5 мин. Этот фрагмент хроматограммы и УФ-спектры основных идентифицированных соединений приведены на рисунке 4.
отнесение сигналов на хроматограмме выполнено на основании анализа экспериментальных УФ- и масс-спектров (табл. 1) и соответствующих литературных данных [17, 21, 22].
Следует отметить, что флавоноиды, идентифицированные в экстракте почек тополя бальзамического, принадлежат к разным структурным типам, для которых получены значения характерных спектральных отношений (табл. 1), которые могут быть использованы для групповой идентификации фенилпропаноидов в экстрактах из растительного сырья [23].
В этилацетатном экстракте идентифицированы также гидроксикоричные кислоты (и-кумаровая, феруловая и 3,4-диметоксикоричная) и их производные в интервале 4-12 мин. Кроме того, в этом же интервале на основании анализа хроматографических и УФ-спектральных характеристик удалось выявить вещества, которые, по нашему мнению, имеют флаваноновую природу (строение веществ изучается).
оценка содержания фенольных соединений в этилацетатном экстракте приведена в таблице 2.
а)
2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
Время, мин.
2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
Время, мин.
Рис. 3. ВЭЖХ-хроматограмма этилацетатного экстракта почек тополя бальзамического, а - Х=290 нм; б - Х=326 нм
Рис. 4. Фрагмент ВЭЖХ-хроматограммы этилацетатного экстракта почек тополя в интервале 15,5-18,5 мин (X 290, 326 нм) и УФ-спектры основных идентифицированных соединений
Таблица 1. УФ- и масс-спектральные характеристики идентифицированных компонентов этилацетатного экстракта почек тополя
Номер на хрома- Соединение m/z Характерные спектральные отношения
тограмме (рис. 4) А(280/254) А(320/280) А(360/254)
1 3,4-дигидро-2',6'-дигидрокси-4'-метоксихалкоп 272 2,8 3,3 10,8
2 Пиноцембрин 256 10,2 0,3 0,1
3 Пинобаксин 272 11,3 0,4 0,9
4 Хризин 254 1,0 0,8 0,3
5 Галангин 270 0,7 1,0 1,0
6 2',6'-дигидрокси-4'-метоксихалкоп 270 3,4 3,3 11,5
7 Пиностробин 270 11,0 0,3 0,5
8 Тектохризин 268 1,4 0,7 0,3
Таблица 2. Содержание фенольных соединений в этилацетатном экстракте почек тополя
Группа фенольных соединений Содержание, мг%
Коричные кислоты и их производные1 21
Флаванонолы2 20
Халконы3 52
Флавоны2 8
Флаваноны2 12
Флавонолы3 2
1 - в пересчете па кофейную кислоту; 2 - в пересчете па дигидрокверцетин; 3 - в пересчете па кверцетин.
Таким образом, в составе флавоноидов, выделенных из почек тополя бальзамического, идентифицированы следующие соединения:
пинобаксин (3) (16,21 мин)
HO
пиностробин (7) (18,03 мин)
пиноцембрин (2) (16,09 мин)
OH O хризин (4) (16,48 мин)
тектохризин (8) (18,32 мин)
галангин (5) (16,68 мин)
3,4-дигидро-2',6'-дигидрокси-4'-метоксихалкон (1) (15,95 мин) 2',6'-дигидрокси4'-метоксихалкон (6) (17,51 мин)
Результаты исследований свидетельствуют о том, что основными компонентами являются 2',6'-ди-гидрокси-4'-метоксихалкон - 0,74%, 3,4-дигидро-2',6'-дигидрокси-4'-метоксихалкон - 0,65%, пинобаксин -
0,53%, хризин - 0,21%, пиностробин - 0,17%, пиноцембрин - 0,15% и галангин - 0,05% от а.с.с. Также обнаружены коричные кислоты и их производные (0,56% от а.с.с.).
Полученные результаты хорошо согласуются с данными других авторов [24]. Так, сравнительное изучение почек некоторых дикорастущих сибирских и дальневосточных видов тополя, а также новых гибридных и полиплоидных форм растений, полученных в Центральном Сибирском ботаническом саду СО РАН, показало, что во всех исследованных образцах почек сибирских видов и форм тополя наблюдается сравнительно низкое содержание пиностробина, но более высокое содержание его халконового аналога по сравнению с таковыми в почках видов тополя, произрастающих в европейской части России.
Для почек тополя, произрастающего в Красноярске, характерно более высокое содержание тектохризина, пиноцембрина (в 2,4 раза по сравнению с тополями Самарской области) и халконов (в 2,3 раза) и значительно меньшее содержание пиностробина (в 4,9 раза). Работами [9,10,13] показано наличие в почках тополя таких соединений, как апигенин, кемпферол, 7-метилкверцетин, кверцетин, которые в составе флавоноидов исследованных нами образцов почек не обнаружены.
Более подробные сведения о флавоноидах почек тополя бальзамического могут быть получены только при изучении состава флавоноидов, извлекаемых другими растворителями.
Результаты исследований фенольных соединений почек тополя, входящих в состав веществ, извлекаемых диэтиловым эфиром и бутанолом, будут представлены в следующем сообщении.
Заключение
Методом ВЭЖХ изучен состав основных флавоноидов этилацетатного экстракта почек тополя бальзамического. При сопоставлении полученных результатов с литературными данными, установлено, что по количественному и качественному составу флавоноидов тополя бальзамические, произрастающие в разных регионах, значительно различаются. Почки тополя бальзамического, произрастающего в Красноярске, содержат меньше пиностробина и больше халконов, по сравнению с аналогичным видом тополя, произрастающего в европейской части России.
Список литературы
1. Исаева Е.В., Рейсер Г.В., Бурдейная Т.М. К вопросу о комплексном использовании вегетативной части тополя // Химия и химическая технология. 2007. Т. 50. Вып. 6. С. 53-55.
2. Рощин В.И. и др. Групповой состав экстрактивных веществ листьев и побегов осины // Химия древесины. 1986. №4. С. 106-109.
3. Рощин В.И. и др. Состав экстрактивных веществ хвои и побегов ели европейской // Химия древесины. 1983. №4. С. 56-61.
4. Ложкина Г.А, Исаева Е.В. Фракционный состав спиртового экстракта почек тополя бальзамического // Новые достижения в химии и химической технологии растительного сырья. Барнаул, 2007. Кн. 2. С. 236-239.
5. Растительные ресурсы СССР. Л., 1986. 336 с.
6. Браславский В.Б., Куркин В.А., Жданов И.П. Антимикробная активность экстрактов и эфирных масел почек некоторых видов PopuiusL. // Растительные ресурсы. 1991. Т. 27, вып. 2. C. 77-81.
7. Куркин В.А. Фенилпропаноиды лекарственных растений: итоги и перспективы исследований в области создания фитопрепаратов // Новые достижения в химии и химической технологии растительного сырья. Барнаул, 2007. Кн. 2. С. 236-239.
8. Куркин B.A. и др. Перспективы использования растительного сырья, содержащего флавоноиды, в качестве антимикробных и противовоспалительных лекарственных средств // Человек и лекарство: Тез. докл. М., 1995. С. 238.
9. Куркин В.А., Запесочная Г.Г., Браславский В.Б. Флавоноиды почек Populus balzamifera L. // Химия природных соединений. 1990. №2. С. 272-273.
10. Куркин В.А., Браславский В.Б., Запесочная Г.Г. Исследование химического состава Populus balzamifera L. методом ВЭЖХ // Растительные ресурсы. 1993. Т. 29, вып. 3. С. 85-90.
11. Запрометов М.Н. Фенольные соединения: распространение, метаболизм и функции в растениях. М., 1993. 272 с.
12. Wollenweber E., Asarawa U., Scnillo D. A novel caffeic acid derivatives and other constituents of Populus buds excretion and propolis (bee-glue) // Z. Naturforschung. 1987. V. 42, №9/10. P. 1030-1034.
13. Поляков В.В Масло тополя бальзамического (Populus balzamifera) и производные мирицетина, обладающие биологической активностью: Автореф. дис. ... д-ра хим. наук: 02.00.10. Караганда, 1999. 55 с.
14. Бауэр Г. и др. Высокоэффективная жидкостная хроматография в биохимии / Под ред. И.В. Березина. М., 1988. 687 с.
15. Ложкина Г.А, Исаева Е.В., Рязанова Т.В. Влияние различных факторов на процесс экстракции почек тополя бальзамического // Химия растительного сырья. 2007. №2. С. 51-54.
16. Браславский В.Б. и др. Количественное определение суммы флавоноидов и гидроксикоричных кислот в почках некоторых видов Populus L. // Растительные ресурсы. 1991. Т. 27, вып. 3. С. 130-134.
17. Mabry T.J, Markham K.R., Thomas M.B. The systematic identification of flavonoids. Berlin, Heidelburg, New York, 1970. P. 354.
18. Алехина Н.Д. и др. Физиология растений / Под ред. И.П. Ермакова. М., 2007. 640 с.
19. Кретович В.Л. Биохимия растений. М., 1986. 503 с.
20. Фуксман И. Л. и др. Физиологическая и биохимическая индикация состояния сосны обыкновенной в условиях промышленного загрязнения // Экология. 1997. №3. С. 184-187.
21. Маликов В.М., Юлдашев М.П. // Химия природных соединений. 2002. №4. С. 299-324.
22. Маликов В.М., Юлдашев М.П. // Химия природных соединений. 2002. №5. С. 385-409.
23. Черняк Е.И., Вялков А.И., Царалунга Я.С., Морозов С.В. Использование методов газовой и высокоэффективной жидкостной хроматографии для идентификации природных биологически активных фенольных соединений // Химия в интересах устойчивого развития. 2007. Т. 15, №5. С. 609-624.
24. Браславский В.Б., Куркин В.А., Бакулин Б.Т. Сравнительное химическое исследование некоторых видов и гибридных форм Populus L., культивируемых в Сибири // Растительные ресурсы. 1993. Т. 29, вып. 4. С. 77-81.
Поступило в редакцию 13 декабря 2007 г., После переработки 25 января 2008 г.
