CC BY
412
УДК 582.681.81+595.7991:615.011.3
ИССЛЕДОВАНИЕ ЭЛЕКТРОННЫХ СПЕКТРОВ ФЛАВОНОИДОВ ТОПОЛЯ И ПРОПОЛИСА
В.Б. Браславский, В.А. Куркин, ГОУ ВПО «Самарский государственный медицинский университет»
Куркин Владимир Александрович - e-mail: [email protected]
В сравнительном аспекте изучены УФ-спектры флавоноидов почек некоторых видов рода Тополь (сем. Ивовые - Salicaceae) - тополя черного (Populus nigra L.), тополя бальзамического (Populus balsamifera L.) и прополиса, служащих источником антимикробных лекарственных средств (настойка тополя, настойка прополиса и др.).
Ключевые слова: сем. Ивовые, Salicaceae, почки тополя, тополь черный (Populus nigra L.), тополь бальзамический (Populus balsamifera L.), прополис, УФ-спектры, флавоноиды, пиностробин, пиноцембрин.
The comparative investigations of the samples of the UV spectra of flavonoids of the buds of some species of genus Populus L. (Salicaceae) - Populus nigra L.), Populus balsamifera L. and propolis was carried out. The studied objects are the source of antimicrobial preparations (tincture of Populus, tincture of propolis etc.).
Key words: Salicaceae, Populus L., Populus nigra L., Populus balsamifera L., buds, propolis, UV spectra, flavo-
noids, pinostrobin, pinocembrin.
Введение
Перспективным источником получения антимикробных, противовоспалительных и ранозаживляющих фитопрепаратов являются представители семейства ивовых (Salicaceae), в частности, виды рода Тополь (Populus L.), а также продукт пчеловодства - прополис, одним из растительных источников которого является тополь [1, 2, 3]. Почки тополя черного (Populus nigra L.) семейства Ивовых (Salicaceae) включены в Государственный реестр лекарственных средств (1992 г.), разрешенных для применения в медицинской практике, однако к моменту начала наших исследований нормативная документация (НД) на данное сырье отсутствовала, так как имеющийся в свое время (1932 г.) ОСТ 4286 на почки тополя черного утратил юридическую силу [4]. Почки тополя черного разрешены к применению в медицинской практике в качестве антисептического средства [5]. Нами была разработана нормативная документация «Тополя почки» (ФСП 42-0329168201) на это ценное лекарственное сырье, причем кроме тополя черного для расширения сырьевой базы в НД дополнительно включены 4 вида близких по химическому составу к тополю чёрному: т. бальзамический (Populus balsamifera L.), т. душистый (Populus suaveolens Fisch.), т. лавролистный (Populus laurifolia Ledeb.), т. канадский (Populus deltoides Marsh.). В Государственный реестр лекарственных средств включены также гомеопатические препараты: тополь бальзамический и тополь осинообразный [5]. Кроме того, нами пока-
зана перспективность использования некоторых видов тополя, интродуцированных в Самару и Новосибирск [1, 6, 7, 8]. В качестве лекарственного средства нами предложена «Тополя настойка» (ФСП 42-0329174701), которая обладает выраженной антимикробной активностью и низкой токсичностью. При этом необходимо отметить, что настойка тополя по своим антимикробным свойствам в 2-3 раза превосходит активность настойки прополиса [1]. В СамГМУ проводятся исследования по созданию и других лекарственных форм с использованием извлечений из почек тополя: мазь, суппозитории, лекарственные пленки пролонгированного действия [9]. При проведении фитохимических и микробиологических исследований было установлено, что в плане антимикробной активности наибольший интерес представляют почки следующих видов тополя, заготовленных в европейском и сибирском регионах: т. черный, т. бальзамический, т. душистый, т. лавролистный, т. канадский [1, 4, 6, 8, 10]. Исследованы препараты данных видов, обладающие выраженной антимикробной активностью в отношении стафилококка и антракоида (312-625 мкг/мл). Выявлено, что антимикробная активность препаратов на основе почек тополя обусловлена не эфирным маслом, а в основном флавоноидами [1, 7]. Так, флаванон пиноцембрин (формула 2) проявил ярко выраженную активность на основные грамположительные бактерии, а его 7-метоксианалог пиностробин (формула 1) проявил более слабую, но явно избирательную
антимикробную активность в отношении ЕБЬепсЫа соН [7], за счет структуры, обусловливающей липофильные свойства вещества и его сродство с липидной мембраной гра-мотрицательных бактерий.
Пиностробин (1) Пиноцембрин (2)
Установлено, что антимикробные свойства экстрактов из почек тополя черного, т. бальзамического и т. канадского (дельтовидного) обусловлены наличием флавоноидов, в частности, пиноцембрина и пиностробина, относящихся к главным компонентам данных растений. К доминирующим компонентам экстрактов из почек тополя относятся также гидроксикоричные кислоты, обладающие подобным спектром действия [11]. В этой связи стандартизацию почек тополя предложено проводить по содержанию суммы флавоноидов и гидроксикоричных кислот в пересчете на флаванон пиностробин (формула 1). Для целей стандартизации нами был разработан Государственный стандартный образец (ГСО) пиностробина: ФС 42-0073-01 «Пиностробин-стандартный образец». Изучение УФ-спектров спиртовых экстрактов почек тополя и раствора ГСО пиностробина показало, что характер кривой поглощения спиртовых экстрактов из почек тополя обусловлен в основном веществами флаваноновой природы. Кроме того, в этой области УФ-спектра находится один из максимумов поглощения гидроксикоричных кислот, которые при аналитической длине волны (289 нм) имеют удельный показатель поглощения около 600, близкий к таковому ГСО пиностробина (684-727). С целью выбора аналитической длины волны нами были изучены УФ-спектры спиртовых растворов разрабатываемых препаратов тополя и прополиса и было показано, что они имеют основной максимум поглощения при длине волны (около 290) 289±1 нм, дающий батохромный сдвиг в присутствии треххлористого алюминия (около 308±1 м). Аналогичные результаты были получены и для ГСО пиностробина, позволяющие сделать вывод о том, что характер кривой поглощения настойки почек тополя и прополиса определяется в основном веществами флава-ноновой природы [2, 4, 8]. В связи с этим разработана методика количественного определения суммы флавоноидов и гидроксикоричных кислот в почках тополя и в прополисе (ВФС 42-1084-81) с использованием прямой спектрофотоме-трии испытуемого раствора и ГСО пиностробина при длине волны 289 нм [2, 4, 8]. Во всех исследованных образцах почек видов тополя отмечено высокое содержание суммы флавоноидов и гидроксикоричных кислот (фенилпропанои-дов) (15,0-32,0%) [4, 7, 8]. Актуальна эта проблема и для лекарственных средств на основе прополиса: «Прополиса настойка» (ФС 42-3736-99), «Пропосол» (ФС 42-3463-97), «Пропоцеум» (ФС 42-2354-92), в случае которых стандартизация осуществляется без использования какого-либо стандарта, а методики не отвечают параметрам валидации [12, 13]. Так, определение подлинности прополиса проводят реакцией с хлорным железом, которая не является специфичной, а в ФС 42-3736-99 «Настойка прополиса» предусмотрена лишь цианидиновая реакция (флавоноиды). Результаты
ранее проведенных исследований свидетельствуют о возможности и перспективности использования метода высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) для стандартизации почек тополя, прополиса и препаратов на их основе [4, 14-18], однако указанная проблема требует дополнительного изучения спектральных характеристик флавоноидов и других биологически активных соединений.
В ходе исследований с помощью методов тонкослойной хроматографии (ТСХ), колоночной хроматографии, УФ-, ЯМР-спектроскопии, масс-спектрометрии и ВЭЖХ было установлено, что в почках тополя преобладают флавоноиды и фенилпропаноиды [4, 6, 8, 9, 14-21]. В результате изучения химического состава почек 5 видов тополя выделено и охарактеризовано свыше 30 флавоноидов (пиностробин, пиноцембрин, пинобанксин, альпинон, хризин и др.) и фенил-пропаноидов (гидроксикоричные кислоты и их производные: п-кумаровая, кофейная, феруловая кислоты и др.) [4, 6, 8, 9, 10, 14-20]. При этом установлена структура новых соединений: 2-метил-3-бутенилкофеат (изопентенилкофеат) и 3,7-О-диацетилфлаванон (популигенин), выделенный из почек т. душистого [17].
Для почек тополя, прополиса и их препаратов предложена качественная реакция, заключающаяся в определении в анализируемом экстракте методом ТСХ двух диагностических флавоноидов почек тополя - пиностробина (формула 1) и пиноцембрина (формула 2) с использованием ГСО пино-стробина.
Целью настоящих исследований является сравнительное исследование УФ-спектров флавоноидов почек некоторых видов рода Тополь (Populus L.) и прополиса.
Материал и методы
В качестве материала исследования использовали почки тополя черного (Populus nigra L.), тополя бальзамического (Populus balsamifera L.), собранные в Самарском ботаническом саду в марте 2009 г., а также образцы прополиса (Самарская обл.). Регистрацию электронных спектров растворов пиностробина и пиноцембрина, а также водноспиртовых извлечений из почек исследуемых видов тополя и прополиса осуществляли с использованием спектрофотометра «Specord 40» (Analytik Jena).
Результаты и их обсуждение
По химическому составу почки тополя близки к прополису, однако у почек более высокое содержание биологически активных веществ фенольной природы и, как следствие, более высокая антимикробная и противогрибковая активность [1, 4, 15, 17]. Близость компонентного состава почек тополя и прополиса была показана как нами [2, 14-17, 21], так и другими исследователями с использованием современных хроматографических и спектральных методов анализа [3, 22, 23, 24, 25, 26].
Исследование УФ-спектров водно-спиртовых извлечений почек тополя черного (рис. 1) и тополя бальзамического (рис. 2) показало, что в обоих случаях имеется интенсивный основной максимум поглощения при длине волны около 290 нм (флаваноны) и «плечо» при длине волны около 326 нм (флаваноны и гидроксикоричные кислоты). Наличие максимумов поглощения в УФ-спектрах спиртового раствора пиностробина (рис. 3) и пиноцембрина (рис. 4) при длине волны 289 и 291 нм (соответственно) свидетельствуют о том, что именно данными флавоноидами в основном опреде-
ляется характер кривом поглощения исследуемых видов тополя. Это подтверждается и спектральными характеристиками комплексов пиностробина и пиноцембрина с АІСІ3: в УФ-спектрах наблюдается характерный для флаванонов батох-ромный сдвиг максимума поглощения в область 310 нм (рис. 1-4). Сопоставимые спектральные характеристики обнаружены нами и для водно-спиртовых извлечений прополиса (рис. 5). РИС. 1.
\
U
Vi
U
\\ 2
\\ А
\\ /
j \
200
Absoibance
УФ-спектр спиртового раствора извлечения почек тополя черного. Обозначения: 1 - исходный раствор; 2 - раствор в присутствии А1С13. РИС. 2.
1
п 2
\\ 1 I
I, Л
\ И \ \
\ и Vv
200
Absorbance
[nm]
УФ-спектр спиртового раствора почек тополя бальзамического. Обозначения: 1 - исходный раствор; 2 - раствор в присутствии А1С13. РИС. 3.
[А]
2 I
1 I
I А
/V I
\
\ I
U
200 250 300 350 400 450 [пт] Absorbance
УФ-спектр спиртового раствора ГСО пиностробина. Обозначения:
1 - исходный раствор; 2 - раствор в присутствии А1С13.
РИС. 4.
\\ 2
I
А
I j
U П
м г
і \
\\ \
у VI
200
Absorbance
УФ-спектр спиртового раствора пиноцембрина.
Обозначения: 1 - исходный раствор; 2 - раствор в присутствии А1С13. РИС. 5.
УФ-спектр спиртового раствора извлечения прополиса. Обозначения: 1 - исходный раствор; 2 - раствор в присутствии А1С13.
РИС. 6.
УФ-спектр раствора пиностробина в ацетонитриле.
В связи с этим представляет большой научный и практический интерес углубленное исследование спектров поглощения основных флавоноидов тополя и прополиса - пиностробина и пиноцембрина.
В УФ-спектре раствора пиностробина наблюдаются характерные максимумы поглощения света в области: (Хтах) 212 нм, подобие «плеча» при 225 нм и «плечо» 320 нм, наибольший длинноволновый - при 289 нм (рис. 3). После реакции с трёххлористым алюминием (3% спиртовый раствор) образуется батохромный комплекс с характерными максимумами поглощения в области: (Хтах) 222 нм, 309 нм и 377 нм.
Важное значение имеет исследование УФ-спектров веществ флавоноидной природы в растворе ацетонитрила
для рекомендаций по диагностическим длинам волн в методе обращенно-фазовой ВЭЖХ. Так, раствор пиностробина в ацетонитриле имеет аналогичный характер кривой поглощения света спиртовым раствором пиностробина, однако максимумы поглощения смещены на 2-3 нм (рис. 7). Так, основной максимум поглощения пиностробина в ацетонитриле в сравнении со спиртовым раствором имеет гипсо-хромный сдвиг (287 нм), т. е. ближе к 288 нм, а не к 290 нм, а минимум - батохромный (249 нм), кроме того, сглаживается коротковолновый максимум на 214 нм.
После добавления 1% уксусной кислоты к раствору пиностробина в ацетонитриле УФ-спектр в коротковолновой области (до 256 нм) даёт фоновое поглощение, не позволяющее использовать эту область для измерений, однако сохраняется максимум поглощения при 287 нм (в случае элюента ацетонитрил-вода (5:5) с добавлением 1% раствора уксусной кислоты максимум - при 288 нм, минимум - 254 нм) (рис. 7).
28 .Опт |
/\
1 254. Опт I у
200 250 300 350 400 450 [пт]
Absorbance
РИС. 7.
УФ-спектр поглощения раствора пиностробина в элюенте ацетонитрил-вода (5:5) с добавлением 1% раствора уксусной кислоты.
В УФ-спектре спиртового раствора пиноцембрина наблюдаются характерные максимумы поглощения света: (Xmax) 212 нм, «плечо» при 320 нм, наибольший длинноволновый - при 291 нм (+2 нм от пиностробина) (рис. 3 и 8), минимумы - как у спектра пиностробина (204 и 247-248 нм) (рис. 3 и 8). После реакции с трёххлористым алюминием (3% спир-товый раствор) образуется батохромный комплекс с характерными максимумами поглощения: (Xmax) 220 нм, 309 нм (основной максимум) и 377 нм (рис. 4).
Absorbance
РИС. 8.
УФ-спектр поглощения спиртового раствора пиноцембрина.
УФ-спектр раствора пиноцембрина в ацетонитриле имеет максимумы поглощения при 210 (212 нм - в спирте) и 287
(291 нм - в спирте) и 327 нм, минимумы - при 206 и 246, 315 и 378 нм соответственно (рис. 9).
1
\ І210.0пт|
1206. Опт | 1287. Опт |
\ 1327. Опт |
|24Є.0пт | 1378. Опт |
200 250 300 3 50 400 4 50 [пгл]
Absorbance
РИС. 9.
УФ-спектр раствора пиноцембрина в ацетонитриле.
[А]
0.Э 0.8 0.7 О. Є 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1
РИС. 10.
УФ-спектр раствора пиноцембрина в ацетонитриле с добавлением 1% уксусной кислоты.
После добавления 1% уксусной кислоты к раствору пиноцембрина в ацетонитриле увеличивается фоновое поглощение до 250 нм и измерение в коротковолновой области теряет специфичность и информативность (рис. 10). Результаты данных исследований свидетельствуют о том, что при обосновании аналитической длины волны в ВЭЖХ-анализе сырья и препаратов тополя и прополиса, а также других лекарственных растений, и препаратов, содержащих флаво-ноиды, необходимо ориентироваться на максимумы поглощения со значениями более 250 нм, в том случае, если в методике используются элюентные смеси, с добавлением уксусной кислоты.
Выводы
1. В сравнительном аспекте изучены УФ-спектры растворов пиностробина и пиноцембрина - основных флавонои-дов почек тополя черного (Populus nigra L.), тополя бальзамического (Populus balsamifera L.) и прополиса.
2. Установлено, что характер кривой поглощения в УФ-спектрах водно-спиртовых извлечений почек тополя и прополиса обусловлен в основном флаванонами, в частности, пиностробином и пиноцембрином, имеющих максимумы поглощения при длине волны 289 и 291 нм соответственно.
3. При обосновании аналитической длины волны в ВЭЖХ-анализе сырья и препаратов тополя и прополиса, а также других лекарственных растений и препаратов, содержащих флавоноиды, необходимо ориентироваться на максимумы поглощения со значениями более 250 нм, в случае, если в
методике используются элюентные смеси, содержащие уксусную кислоту. ^
ЛИТЕРАТУРА
1. Браславский В.Б., Куркин В.А., Жданов И.П. Антимикробная активность экстрактов и эфирных масел почек некоторых видов Populus L. Раст. ресурсы. 1991. Т. 27.Вып. 2. С. 77-81.
2.Куркин В.А., Браславский В.Б, Запесочная Г.Г. Определение флавоноидов в прополисе. Фармация. 1992. № 1. С. 35-39.
3.Wollenweber E. et al. A Novel Caffeic Acid Derivative and Other Constituents of Populus Bud Extcretion and Propolis (Bee Glue) / Wollenweber E., Asacawa Y., Schillo D., Lehmann U. And Weigel H. Z. Naturforschung. C: Biosci. 1987. Bd. 42. №. 9-10. S. 1030-1034.
4. Браславский В.Б. Исследование химического состава некоторых видов тополя (Populus L.). Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук. Москва. 1994. 23 с.
5.Государственный реестр лекарственных средств. Том I. М. 2008. Сс. 408, 469.
6. Браславский В.Б., Куркин В.А., Бакулин В.Т. Сравнительное химическое исследование некоторых видов и гибридных форм Populus L., культивируемых в Сибири. Раст. ресурсы. 1993. Т. 29. Вып. 4. С. 77-81.
7. Браславский В.Б. Тополь и прополис - перспективные источники лекарственных средств. Известия Самарского научного центра Российской академии наук. Специальный выпуск «XII конгресс «Экология и здоровье человека». 2007. Том 2. С. 152-155.
8. Браславский В.Б., Куркин В.А., Запесочная Г.Г., Безрукова Н.А. Количественное определение суммы флавоноидов и гидроксикоричных кислот в почках некоторых видов Populus L. Растительные ресурсы. 1991. Т. 27. Вып. 3. С. 130-134.
9. Браславский В.Б., Куркин В.А., Мизина П.Г. Перспективы использования фитопрепаратов на основе видов рода Populus L. и прополиса. II Российский фитотерапевтический съезд: сборник научных трудов съезда. Москва. 22-23 октября 2010 г. Приложение к журналу «Традиционная медицина». 2010. № 3 (22). М.: Изд-во Профессиональной ассоциации натуротерапевтов, 2010. С. 97-103.
10. Куркин В.А., Браславский В.Б., Запесочная Г.Г. и др. Способ получения настойки тополя для лечения гнойно-воспалительных заболеваний мягких тканей. Патент РФ № 2135201. А 61 К 35/78. Бюл. № 3 от 27. 08. 1998 г.
11. Куркин В.А. Фармакогнозия: учебник для студентов фармацевтических вузов (факультетов). Изд. 2-е, перераб. и доп. Самара: ООО «Офорт»; ГОУВПО «СамГМУ», 2007. 1239 с.
12. Арзамасцев А.П., Багирова В.Л., Садчикова Н.П. Основные аспекты совершенствования фармакопейного анализа. Хим.-фарм. журн. 2000. Т. 34. № 5. С. 47-48.
13. Самылина И.А. Традиционная медицина и питание: теоретические и практические аспекты: Материалы I Международного научного конгресса. М.: Институт традиционных методов лечения МЗ РФ, 1994. С. 254.
14. Куркин В.А., Браславский В.Б., Запесочная Г.Г. Исследование химического состава почек Populus balsamifera L. методом ВЭЖХ. Раст. ресурсы. 1993. Т. 29. Вып. 3. С. 85-90.
15. Куркин В.А., Браславский В.Б., Запесочная Г.Г. Исследование экстрактов прополиса и почек тополя бальзамического методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (Материалы VI Всероссийского симпозиума по молекулярной жидкостной хроматографии). Журнал физической химии. 1994. Т. 68. № 10. С. 1816-1818.
16. Сенцов М.Ф., Браславский В.Б., Куркин В.А., Запесочная Г.Г. Исследование химического состава почек Populus laurifolia Ledeb. Раст. ресурсы. 1996. Т.32. Вып. 1-2. С. 100-105.
17. Сенцов М.Ф., Браславский В.Б., Куркин В.А., и др. Сравнительное исследование компонентного состава почек некоторых видов Populus L . методом ВЭЖХ. Растительные ресурсы. 1997. Т. 33. Вып. 2. С. 51-56.
18. Куркин В.А., Запесочная Г.Г., Браславский В.Б., Толкачев В.О. Флавоноиды почек Populus deltoides. Химия природ. соединений. 1990. № 4. С. 548-550.
19. Куркин В. А., Запесочная Г. Г., Браславский В. Б. Флавоноиды почек Populus balsamirefa L. Химия природ. Соединений. 1990. № 2. С. 272-273.
20. Куркин В.А., Сенцов М.Ф., Запесочная Г.Г. Браславский В.Б., Толкачев В.О. Флавоноиды почек Populus laurifolia. Химия природ. соединений. 1994. № 6. С. 831-833.
21 . Браславский В.Б, Куркин В.А. Стандартизация сырья и препаратов тополя и прополиса. Фармация. 2009. № 4. С. 53-56.
22. Растительные ресурсы СССР: Цветковые растения, их химический состав, использование; семейства Paeoniaceae - Thymelaeaceae. Л.: Наука, 1986. 336 с.
23. Соколов И.В., Торгов И.В. Флавоноидные агликоны в прополисе и его источниках. Химия природных соединений. 1990. № 4. С. 550-551.
24. Bankova V., Ророv S., Маге^ N. Ftawnoids from propolis // International conference on chemistry and biotechnology of biologically active natural products. Sofia. 1981. tol. 3. № 1. P. 104-110.
25. Harborne J.B., Mabry T.J. The Flavonoids: Advances and Research. London: Chapman and Hall, 1982. 744 p.
26. Karrer W. institutions und Vorkommen der organischen Pflanzenstoffen. Basel und Stuttgart: Birkenhauser Verlag. 1958. 1207 s.
