CC BY
63
ISSN 0202-5493.МАСЛИЧНЫЕ КУЛЬТУРЫ. Научно-технический бюллетень Всероссийского научно-исследовательского института масличных культур. Вып.2 (148-149), 2011
Л.В. Маслиенко,
доктор биологических наук Д.А.Курилова, младший научный сотрудник Е.Ю. Шипиевская,
кандидат биологических наук
ГНУ ВНИИМК Россельхозакадемии Россия,350038, г. Краснодар, ул. Филатова,17 Тел: (861) 275-85-19, факс (861) 254-27-80 e-mail: biometod@yandex.ru
ОПТИМАЛЬНЫЕ ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ ДЛЯ ВЫРАЩИВАНИЯ ШТАММА XK-1-4 CHAETOMIUM OLIVACEUM COOKE ET ELLIS
АНТАГОНИСТА ВОЗБУДИТЕЛЯ БЕЛОЙ ГНИЛИ
Ключевые слова: белая гниль, штамм, антагонист, питательные среды, стационарное культивирование, глубинное культивирование
УДК 576.8:632
Введение. Вредоносной болезнью многих сельскохозяйственных культур, в т. ч. и масличных (подсолнечника, сои и озимого рапса), является белая гниль (Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary). Основной запас инфекционного начала возбудителя белой гнили сохраняется на растительных остатках и в почве в виде склероциев.
Использование организмов-интродуцентов -один из наиболее известных и широко распространенных путей применения биологического метода защиты растений от болезней, вызываемых грибами. Микроорганизм, пригодный для получения эффективного биопрепарата, должен проявлять антагонистическую активность против патогенов в широко варьируемых условиях. Во многих странах ведутся поиски таких микроорганизмов, проводятся испытания их в полевых условиях, результаты которых показывают перспективность подобных исследований [1; 2; 3; 4; 5; 6; 7; 8; 9].
Микробиологических препаратов для снижения запаса инфекционного начала возбудителей болезней в почве и на растительных остатках чрезвычайно мало. Поэтому создание новых высокоэффективных эколо-
гически безопасных микробиопрепаратов на основе штаммов, снижающих жизнеспособность склероциев белой гнили, является актуальной задачей.
В результате ступенчатого скрининга грибов и бактерий из коллекции антагонистов возбудителей болезней масличных культур лаборатории биометода ВНИИМК к возбудителю белой гнили озимого рапса отобран от-селектированный штамм Xk-1-4 Chaetomium olivaceum Cooke et Ellis, наиболее активно разлагающий склероции возбудителя болезни.
В целях разработки элементов технологического регламента производства биопрепарата на основе перспективного штамма гриба-антагониста Xk-1-4 Chaetomium oliva-ceum определяли оптимальные питательные среды для штамма продуцента в условиях стационарного и глубинного культивирования.
Материалы и методы. Для определения оптимальных питательных сред из естественных субстратов для выращивания штамма Xk-1-4 Chaetomium olivaceum субстрат промывали, размельчали, помещали в колбы Эрленмейера объёмом 750 мл, заполняя 70 % объёма, стерилизовали в автоклаве в течение часа при давлении 1,5 атм., засевали спорами и мицелием гриба и помещали в термостат с температурой 25 оС. Учёт проводили через 10 суток культивирования. Учитывали рост мицелия, интенсивность спорообразования, образование плодовых тел. Субстрат с выращенным грибом вытряхивали из колб, просушивали при температуре 30-35 оС в течение 4 суток, размалывали на шаровой мельнице до величины частиц 60 мкм и определяли титр лабораторного образца микробиопрепарата. Для этого готовили ряд последовательных разведений. 1,0 г препарата помещали в колбу со стерильной дистиллированной водой (90 мл), тщательно перемешивали, доводили объем до 100 мл и ставили на качалку на 10 минут. Разведение препарата, или его концентрация в приготовленной суспензии, составляло 10-2. Предварительно стерильную дистиллированную воду разливали по 9,0 мл в стерильные сухие пробирки. Затем отбирали 1,0 мл суспензии и переносили в пробирку с 9,0 мл стерильной воды. Полученное разведение 10-3 тщательно перемешивали. Таким же образом готовили все последующие разведения до 10-8. При приготовлении использовали каждый раз отдельные стерильные мерные колбы, пипетки и пробирки.
Для определения титра использовали разведения 10-7 и 10-8. Для этого суспензию по
1,0 мл из соответствующего разведения переносили в три стерильные чашки Петри. Затем в эти чашки заливали по 15-20 мл агаризиро-ванной среды, остуженной до 45-50 °С, и смешивали питательную среду с посевным материалом легкими вращательными движениями, после чего чашки оставляли на горизонтальной поверхности до застывания среды. Чашки Петри ставили в термостат с оптимальной температурой и через 3-5 суток инкубации подсчитывали среднее число колоний в трёх повторностях.
Титр (количество колониеобразующих единиц в 1,0 г препарата) вычисляли по формуле:
Т = a х 10п , V
где Т - количество колониеобразующих единиц (КОЕ) в 1,0 г;
а - среднее число колоний, выросших после посева из данного разведения;
V - объем суспензии, взятый для посева;
10п - коэффициент разведения.
Подбор оптимальных искусственных сред и условий культивирования на них перспективного штамма антагониста проводили на жидких питательных средах Чапека, Тайло-на-3 и Рудакова при стационарном и глубинном культивировании. Предварительно посевной материал выращивали на агаризо-ванной питательной среде - картофельно-сахарозном агаре (КСА). Учитывали накопление биомассы, образование спор, плодовых тел. Выращивание проводили при оптимальной температуре 25 °С. Учёты роста мицелия и образования плодовых тел проводили через 3, 5 и 10 суток культивирования.
Глубинное культивирование штамма ХЫ-4 СИавОтшт оНуасвыт осуществляли на круговой качалке с оборотом двигателя 200 об./мин в колбах Эрленмейера объёмом 750 мл при объёмах среды 150 мл при температуре 25 оС в течение 4 суток.
Результаты и обсуждение. Грибы рода СкаеШттт обычно встречаются в почве и в органическом компосте, способны разлагать целлюлозу и другие органические вещества, проявляют антагонистические свойства к различным микроорганизмам почвы [10; 6].
Гриб относится к классу Ascomycetes, порядку Sphaeriales, семейству Скае^т1асеае.
Гриб - аэроб. Ранее установлено, что наиболее благоприятным для роста мицелия и образования плодовых тел является выращивание гриба на картофельно-сахарозном агаре при температуре 25 °С. При выращивании на искусственных питательных средах (среда
Чапека) штамм Xk-1-4 Chaetomium olivaceum Cooke et Ellis ассимилирует сахарозу, крахмал, в средней степени - глюкозу и в слабой степени - маннит. Из источников азота использует нитратный, аммонийный азот, мочевину, в слабой степени - тиомочевину. Оптимальный уровень рН среды - 6 [6].
Определение оптимальной питательной среды для штамма Xk-1-4 Chaetomium olivaceum из естественных субстратов
Всего для выращивания штамма Xk-1-4 Chaetomium olivaceum было использовано тринадцать естественных субстратов (табл. 1).
Таблица 1
Рост штамма Хк-1-4 Chaetomium olivaceum на естественных субстратах при температуре 25 °С через 10 суток
Среда Рост мицелия, балл* Образование плодовых тел, балл** Титр порошка, КОЕ/г
Силос 3 1 1,8 х 109
Солома 5 2 2,0 х 109
Сено 5 2 3,8 х 109
Опилки 2 1 6,0 х 106
Жом 2 1 9,0 х 103
Комбикорм 4 2 3,6 х 109
Сенаж 0 0 0
Семянки подсолнечника 5 2 6,5 х 109
Лузга подсолнечника 5 2 3,0 х 109
Лузга + семянки (1:3) 5 2 6,4 х 109
Лузга + семянки (1:1) 5 2 4,6 х 109
Лузга + гумат натрия 0,1 % 5 2 4,2 х 109
Лузга + гумат натрия 0,2 % 5 2 5,0 х 109
Лузга + гумат натрия 0,3 % 5 2 6,6 х 109
Порошок лузги + кукурузный экстракт 5 2 8,0 х 109
Отходы от очистки семян подсолнечника 5 2 3,9 х 109
Отходы + гумат натрия 0,2 % 5 2 7,3 х 109
Кукурузная мезга 5 2 6,0 х 109
Отходы от очистки семян рапса 4 2 2,6 х 106
Отходы от очистки семян горчицы 0 0 0
*рост мицелия в баллах (зарастание поверхности среды): 1 - до 10 %; 2 - до 30 %;
3 - до 50 %; 4 - до 75 %; 5 - до 100 %. ** образование плодовых тел в баллах:
0 - отсутствие плодовых тел; 1 - единичные; 2 - массовое количество.
Установлено, что наиболее благоприятными из испытанных естественных субстратов являлись среды на основе семянок и лузги подсолнечника с различными добавками, отходы от очистки семян подсолнечника и кукурузная мезга. На этих средах наблюдался обильный рост мицелия, массовое образование плодовых тел и максимальный титр готового биопрепарата 3,0-8,0 х 109 КОЕ/г.
Также высокие показатели роста отмечены при выращивании гриба на средах из соломы, сена и комбикорма 2,0-3,6 х 109 КОЕ/г. Слабый рост гриба или полное отсутствие роста отмечено на средах из сенажа, жома, опилок, отходов от очистки семян горчицы 0-6,0 х 106 КОЕ/г.
Стационарное выращивание штамма
Хк-1 -4 Chaetomium olivaceum на искусственных питательных средах
Стационарное выращивание штамма Хк-1-4 Chaetomium olivaceum проводили на жидких питательных средах сложного состава -Тайлона-3, Рудакова и Чапека, содержащих углеводы и в разном соотношении соединения азота, фосфора, калия и магния, а также микроэлементы. Среды Тайлона-3 и Рудакова в отличие от Чапека содержат кукурузный экстракт (табл. 2).
Таблица 2
Влияние питательньх сред и срока стационарного культивирования на рост штамма Xk-1-4 Chaetomium olivaceum
Краснодар, ВНИИМК
Питательная среда Рост мицелия, балл * через, суток Масса сухого мицелия, г ** через 10 суток
3 5 10
Чапека 0 1 1 0,27 ± 0,01
Тайлона-3 1 1 3 0,64 ± 0,08
Рудакова 1 2 3 1,26 ± 0,12
* рост мицелия в баллах:
0 - нет роста;
1 - рост мицелия отдельными колониями;
2 - мицелиальная плёнка сплошная тонкая;
3 - мицелиальная плёнка сплошная толстая. ** масса мицелия в расчете на 100 мл
питательной среды
Установлено, что максимальный рост ми-целиальной плёнки гриба обеспечивает среда Рудакова. Уже через 5 суток культивирования
на этой среде отмечена сплошная тонкая ми-целиальная плёнка, тогда как на среде Тайло-на-3 гриб рос отдельными поверхностными колониями, а на среде Чапека отдельными колониями в глубине питательной среды. Через 10 суток культивирования на среде Рудакова и на среде Тайлона-3 образовались сплошные толстые мицелиальные плёнки, а на среде Чапека отдельные колонии так и не срослись в одну мицелиальную плёнку. Масса сухого мицелия через 10 суток культивирования была максимальной на среде Рудакова. Следует отметить, что штамм Хк-1-4 Chaeto-mium olivaceum на жидких питательных средах растёт гораздо хуже, чем на естественных субстратах и за 10 суток стационарного культивирования ни на одной из испытанных сред плодовые тела не образовались.
Глубинное культивирование штамма Хк-1-4 Chaetomium olivaceum
Изучение кинетики рост гриба при глубинном культивировании показало, что через 24 часа на всех средах отмечен бесцветный, средний по толщине, с выростами, несепти-рованный мицелий с негранулированной цитоплазмой (табл. 3).
При этом мицелий группировался в комочки с диаметром 1,0-4,0 мм на среде Рудакова и 1,0-2,0 мм на среде Тайлона-3. На среде Чапека было много непроросших посевных сумкоспор, а на средах Тайлона-3 и Рудакова их было значительно меньше. рН среды на Чапека 6,5, на Тайлона-3 - 5,0, на Рудакова - 5,5. Утилизация среды составляла: Чапека - 0 %, Тайлона-3 - 10 %, а Рудакова -20 %.
Через 48 часов культивирования на всех средах отмечено увеличение количества молодого, бесцветного, утолщённого, несеп-тированного, с негранулированной цитоплазмой, но с ещё большим количеством отростков или выростов мицелия. Во всех средах присутствовали свободные сумкоспо-ры. Уровень рН среды снизился и составлял на среде Чапека 5,0, на среде Тайлона-3 - 4,5 и на среде Рудакова - 5,0. Утилизация среды составляла: Чапека - 10 %, Тайлона-3 - 40 % и Рудакова - 50 %.
Через 72 часа культивирования на всех средах отмечено наличие толстого сероватого, изросшегося в виде бусинок, наростов, септированного, с гранулированной цитоплазмой и молодого слабосептированного
Таблица 3
Кинетика развития культуры штамма Хк-1-4 СНа&отшш оНуасвит при глубинном культивировании
Краснодар, ВНИИМК
Срок культи-виро-вания, час Питательная среда Морфологические изменения культуры и спорообразование Утилизация среды, % рН среды Титр, КОЕ/мл
Чапека Мицелий бесцветный, несептированный, средний по толщине, с выростами, с негра-нулированной цитоплазмой; много не-проросших сумкоспор 0 6,5 4,9 х102
24 Тай-лона-3 -//-* Мицелий скручивается в комочки 1,02,0 мм; присутствуют сумкоспоры 10 5,0 1,9 х 102
Рудакова -//-* Мицелий скручивается в комочки 1,0-4,0 мм; присутствуют сумкоспоры 20 5,5 2,5 х 102
48 Чапека Мицелий бесцветный, несептированный, утолщённый, с большим количеством выростов, с негранули-рованной цитоплазмой; присутствуют свободные сумкоспоры 10 5,0 2,5 х 104
Тай-лона-3 -//-* Мицелий скручивается в комочки 1,0-2,0 мм 40 4,5 2,0 х 104
Рудакова -//-* Мицелий скручивается в комочки 1,0-4,0 мм 50 5,0 2,9 х 104
72 Чапека Мицелий сероватый, толстый, изросшийся с бусинками, септиро-ванный, с гранулированной цитоплазмой и мицелий молодой, бесцветный, слабосеп-тированный; присутствуют свободные сумкоспоры 10 5,0 5,6 х 106
Тай-лона-3 -//-* комочки 1,0-2,0 мм 50 4,5 7,3 х106
Рудакова комочки 1,0-4,0 мм 50 5,0 1,9 х 107
96 Чапека Мицелий сероватый, толстый, с выростами и бусинками, с гранулированной цитоплазмой и мицелий молодой, средний, септиро-ванный, с гранулированной цитоплазмой. Начало лизиса старого мицелия. Свободных сумкоспор мало 10 5,0 6,9 х 106
Тай-лона-3 -//-* комочки 1,0-2,0 мм 50 4,5 8,5 х 106
Рудакова комочки 2,0-3,0-4,0 мм 60 4,5 2,3 х 10'
* описание мицелия соответствует таковому на среде Чапека
мицелия. Во всех средах присутствовали в незначительном количестве свободные сум-коспоры. рН среды оставался на том же уровне. Утилизация среды составляла: Чапека
- 10 %, Тайлона-3 и Рудакова - 50 %. Титр составлял: на среде Чапека - 5,6 х 106 КОЕ/мл, на Тайлона-3 - 7,3 х 106 КОЕ /мл и на Рудакова - 1,9 х 107 КОЕ/мл.
Через 96 часов культивирования на всех средах отмечено наличие толстого, сероватого, с многочисленными выростами и бусинками мицелия и молодого, среднего, септированного мицелия с гранулированной цитоплазмой. Отмечено начало лизиса старого мицелия. Свободных сумкоспор во всех средах было мало. Отмечено начало образования плодовых тел. рН снизился на среде Рудакова до 4,5. Утилизация среды составляла: Чапека - 10 %, Тайлона-3 - 50 %, Рудакова -60 %. Титр на среде Чапека 6,9 х 10 КОЕ/мл, на Тайлона-3 - 8,5 х 106 КОЕ/мл, на Рудакова
- 2,3 х 107 КОЕ/мл.
Визуально:
- среда Чапека - прозрачная, ярко-жёлтая, мицелия в среде 10 %; комочков (глобул) не было;
- среда Тайлона-3 - прозрачная, светло-коричневая, мицелия в среде 50 %, имелись комочки (глобулы) диаметром 1,0-2,0 мм;
- среда Рудакова - мутная, коричневая, мицелия в среде 60 %, имелись комочки (глобулы) диаметром 2,0-4,0 мм.
Таким образом, выращивание штамма антагониста в глубинной культуре сопровождалось обильным ростом мицелиальной массы и не вызывало массового образования плодовых тел и спороношения, титр даже на лучшей питательной среде (Рудакова) не превышал 107 КОЕ/мл, тогда как на средах из естественных субстратов он составлял 109 КОЕ/г.
Заключение. Наиболее благоприятными естественными субстратами для штамма продуцента микробиопрепарата Хк-1-4 Chaetomium olivaceum являлись среды на основе семянок и лузги подсолнечника с различными добавками, отходы от очистки семян подсолнечника и кукурузная мезга. На этих средах наблюдался обильный рост мицелия, массовое образование плодовых тел и максимальный титр готового биопрепарата - 3,0-8,0 х 109 КОЕ/г.
При стационарном культивировании штамма Хк-1-4 Chaetomium olivaceum на жидких питательных средах сложного состава максимальный рост мицелиальной плёнки гриба обеспечивала среда Рудакова. На жидких питательных средах штамм-продуцент
ISSN 0202-5493.МАСЛИЧНЫЕ КУЛЬТУРЫ. Научно-технический бюллетень Всероссийского научно-исследовательского института масличных культур. Вып.2 (148-149), 2011
рос гораздо хуже, чем на естественных субстратах, и за десять суток культивирования ни на одной из испытанных сред плодовые тела не образовались.
Выращивание штамма при глубинном культивировании сопровождалось обильным ростом мицелиальной массы и не вызывало массового образования плодовых тел и споро-ношения. Титр даже на лучшей питательной среде (Рудакова) не превышал 107 КОЕ/мл, тогда как на средах из естественных субстратов он составлял 109 КОЕ/г.
Работа выполнена при финансовой поддержке гранта РФФИ № 11-08-96512-р юг ц.
Список литературы
1.Tiedemann, A.V. Versuche zur Eindämmung von Sclerotinia sclerotiorum durch Einsatz von Sclerotienparasitischen Antagonisten im Gewächshaus und Feld / A.V. Tiedemann, K. Hedke // Vort. 49 Dtsch Pflanzenschutzlag., Heidelberg (26-29 Sept. 1994) Mitt.Biol. Bun-desanst. Land-und Forstwirt Berlin-Dahlem. -
1994. - № 301. - P. 361.
2. Mc Laren, D.L. Biological ranto! of Sclerotinia wilt of sunflower with Talaromyces fla-vus and Coniothyrium minitans / D.L. Mc Laren, H.C. Huang, G.C. Kozub [et al.] // Plant Disease. - 1994. - 78, № 3. - P. 231-235.
3. Huang, H.C. Effect of allyl alcohol and fermented agricultural wastes on carpogenic germination of sclerotia of Sclerotinia scleroti-orum and colonization by Trichoderma sp. / H.C. Huang, I.W. Huang, G. Saindon [et al.] // Can. J. Plant Pathol. - 1997. - 19, № 1. - P. 43-46.
4. Маслиенко, Л.В. Бактерии-антагонисты возбудителей болезней подсолнечника / Л.В. Маслиенко, О.А. Лавриченко // Науч.-техн. бюл. ВНИИ маслич. культур. - Краснодар,
1995. - Вып. 116. - С. 27-35.
5. Калько, Г.В. Биологические обоснование создания биопрепаратов, эффективных в отношении фузариозных заболеваний сельскохозяйственных культур: автореф. дис. ... канд. биол. наук / Калько, Галина Валентиновна. - СПб, 1996. - 22 с.
6. Маслиенко, Л.В. Обоснование и разработка микробиологического метода борьбы с болезнями подсолнечника: автореф. дис. ...
док. биол. наук / Маслиенко, Любовь Васильевна. - Краснодар, 2005. - 49 с.
7. Новикова, И.И. Биологическое обоснование создания и применения полифункциональных биопрепаратов на основе микробов-антагонистов для фитосанитарной оптимизации агроэкосистем: автореф. дис. ... док. биол. наук / Новикова, Ирина Игоревна. -СПб., 2005. - 46 с.
8. Коломбет, Л.В. Научное обоснование и практическая реализация технологии создания грибных препаратов для защиты растений от болезней: автореф. дис. ... док. биол. наук / Коломбет, Любовь Васильевна. - М., 2006. - 48 с.
9. Маслиенко, Л.В. Выделение высокоэффективных биоагентов грибов-антагонистов возбудителя фомопсиса для создания на их основе полифункциональных микробиопрепаратов / Л.В. Маслиенко, Е.Ю. Шипиевская, А.М. Асатурова, Д.А. Курилова // Разработать и усовершенствовать новые биохимические методы создания и идентификации генотипов масличных культур с комплексом хозяйственно ценных признаков: завершённая зарегистрированная НИОКР ФГНУ «ЦИТиС», часть 5. - М., 2011.
10. Soitonq, K. Application of Chaetomium sp. (Ketomium) as a new broad spectrum biological fungicide for plant disease control / K. Soitonq, S. Kanokmedhakul, V. Kukonqviriyapa [et al.] // A review article Fungal Diversity. - 2001. - 7. - P. 1-15.
