CC BY
49
Л. В. Маслиенко,
доктор биологических наук Е. Ю. Шипиевская,
кандидат биологических наук
А. М. Асатурова,
научный сотрудник ГНУ ВНИИ масличных культур
РАЗРАБОТКА ЭЛЕМЕНТОВ ТЕХНОЛОГИИ ПРОИЗВОДСТВА РАЗЛИЧНЫХ ПРЕПАРАТИВНЫХ ФОРМ МИКРОБИОПРЕПАРАТОВ ПРОТИВ ВОЗБУДИТЕЛЯ ФОМОПСИСА ПОДСОЛНЕЧНИКА НА ОСНОВЕ ПЕРСПЕКТИВНЫХ ШТАММОВ ГРИБОВ-АНТАГОНИСТОВ
УДК 633.854.78:632.937
Введение. Одним из наиболее вредоносных заболеваний подсолнечника остаётся карантинный объект фомопсис Phomopsis helianthi Munt.- Cvet., Mihal. et Petr. Проблема защиты подсолнечника от фомоп-сиса может быть реализована комплексом мероприятий, в том числе и разработкой биологических мер борьбы, с применением новых высокоэффективных микробиопрепаратов.
Для разработки микробиопрепаратов во ВНИИМК создана коллекция перспективных штаммов-антагонистов возбудителей наиболее опасных болезней подсолнечника (Маслиенко, 2003). В результате ступенчатого скрининга отобраны 2 штамма, обладающие высокой фунгицидной активностью к возбудителю фомопсиса и другим патогенам и высокой ростостимулирующей активностью на растения подсолнечника: PV-3 Pénicillium verrucosum Dierckx var. cyclopium Westling, Samson et al. и PF-1 Pénicillium funiculosum Thom. (Шипиевская, Маслиенко, 2001; Маслиенко, Шипиевская, Асатурова, 2007).
Материалы и методы. При стационарном культивировании штаммы-продуценты биопрепаратов выращивали в стеклянных баллонах объёмом 3 л, на модифицированной жидкой питательной среде Рудакова (Маслиенко, 2005), взятой по 300 мл, при температуре 25 оС - PV-3 Pénicillium verrucosum var. cyclopium и 30 оС - PF-1 Pénicillium funiculosum, и оптимальных значениях рН среды 7 и 5 соответственно. С целью определения максимального выхода биомассы при поверхностном способе, в зависимости от срока культивирования, штаммы-продуценты биопрепаратов выращивали в течение 20 суток. Накопление биомассы фиксировали на 6, 10, 15 и 20-е сутки культивирования. По окончании культивирования определяли сухую массу мицелиальной пленки высушиванием влажного мицелия при температуре 105 оС до постоянного веса.
Глубинное культивирование штаммов PV-3 Pénicillium verrucosum var. cyclopium и PF-1 Pénicillium funiculosum осуществляли на круговой качалке с оборотом двигателя 200 об./мин., в колбах Эрлен-мейера (750 мл), при объёмах среды Рудакова 150 мл, при температуре 22 и 25 оС в течение 4 су-
ток.
С целью увеличения сроков хранения жидкой препаративной формы при глубинном культивировании, нами отрабатывалось добавление к биомассе гриба стабилизаторов и питательных добавок: поли-винилпирролидона (ПВП) 1, 3 и 5 %, гумата натрия 5, 10 и 20 %, аскорбиновой кислоты 0,1 и 0,25 %, глицерина 5 и 10 %, хлористого магния 5, 10 % и сульфата магния 5, 10 %. Биопрепараты хранили в холодильнике при температуре 10 оС и в условиях переменной температуры (18-25 оС) в лаборатории.
С целью увеличения срока хранения биопрепаратов отрабатывалась препаративная форма порошок. Глубинную культуру штаммов продуцентов смешивали с перлитом (вспученной вулканической лавой) в соотношении 1:0,4. После просушивания при комнатной температуре препараты хранили в пакетах из крафт-бумаги при переменной температуре (1828 оС) в лаборатории.
Титр препарата определяли микробиологическим способом (Егоров, 2004). 1 г (мл) препарата вносили в колбу со 100 мл стерильной воды и ставили на качалку на 30 мин. Из полученной суспензии готовили разведения от 1:10 до 1:1000000000. Суспензию из соответствующего разведения закапывали по 1 мл в 10 чашек Петри. Затем заливали в чашки по 1520 мл среды, расплавленной и остуженной до 4550 оС, и тщательно перемешивали с посевным материалом вращательным движением. После застывания перевёрнутые чашки Петри ставили в термостат с оптимальной температурой и через 48-96 ч вели подсчёт колоний. Титр вычисляли по формуле:
т_Ах 10" ~ V '
где: Т - титр препарата, количество колониеобра-зующих единиц (КОЕ/г, мл);
А - среднее количество колоний в 10 чашках Петри;
10п - коэффициент разведения;
V - объем микробной суспензии, закапываемой
в чашки Петри.
Результаты и обсуждение.
Стационарное культивирование штаммов PV-3
Pénicillium vérrucosum var. cyclopium и PF-1 Pénicillium funiculosum
В условиях покоя все стадии цикла развития антагонистов протекали последовательно и одинаково: сначала прорастали споры, образуя ростовые трубочки, которые через короткое время достигали значительной величины, разветвлялись, занимая все большее пространство. Гифы, разрастаясь, образовывали грибницу, которая всплывала на поверхность питательной жидкой среды, где наибольшая обеспеченность кислородом, и начинали формировать воздушный мицелий, а затем и конидиальный газон. Постепенно разрастаясь, грибной газон превращался в сплошную пленку толщиной 3-4 мм.
С целью определения максимального выхода биомассы при поверхностном способе, в зависимости от срока культивирования, штаммы-продуценты биопрепаратов выращивали в течение 20 суток (табл. 1).
Таблица 1 - Накопление биомассы штаммов
грибов-антагонистов при стационарном способе, в зависимости от срока культивирования
Краснодар, ВНИИМК, 2006 г.
Срок культивирования, сутки Масса сухой мицелиальной пленки, г
PV-3 Pénicillium vérrucosum var. cyclopium PF-1 Pénicillium funiculosum
6 2,0 ± 0,10 2,5 ± 0,20
10 2,7 ± 0,15 3,6 ± 0,17
15 4,0 ± 0,17 5,2 ± 0,17
20 4,3 ± 0,21 5,6 ± 0,23
Через 6 суток культивирования мицелиальные газоны штаммов PV-3 Pénicillium verrucosum var. cyclopium и PF-1 Pénicillium funiculosum были сплошными и занимали всю поверхность питательной среды, на них обильно формировались конидиеносцы с конидиями. Средняя масса сухого мицелия достигала 2,0 и 2,5 г соответственно. Через 10 суток мицелиальные пленки антагонистов становились более толстыми, складчатыми, а также отмечалось обильное спороношение. Масса сухого мицелия в каждом варианте увеличилась примерно в 1,4 раза. По истечении 15 суток толщина газонов продолжала расти и приблизительно равнялась у штамма PV-3 Pénicillium vérrucosum var. cyclopium 3 мм, а у PF-1 Pénicillium funiculosum - 4 мм. При этом средняя масса сухого мицелия также увеличивалась в 2 раза и более, до 4,0 и 5,2 г соответственно. Через 20 суток культивирования существенных изменений в развитии мицелиальных пленок не отмечено, что подтвердилось при определении массы сухого мицелия.
Таким образом, максимальный выход биомассы
при поверхностном способе культивирования штаммов-продуцентов биопрепаратов и при оптимальной температуре происходит через 15 суток.
Глубинное культивирование штаммов PV-3
Pénicillium vérrucosum var. cyclopium и PF-1 Pénicillium funiculosum.
Работу по подбору среды для промышленных ферментаций начинают с культивирования микроорганизмов в колбах на качалке. Отработав оптимальные параметры и добившись максимального выхода продуктов в этих условиях, переходят к более масштабным ферментациям, во время которых определяют потребность в дальнейших модификациях. Известно, что интенсивная аэрация является одним из главных условий быстрого развития микроорганизмов. Вследствие этого, глубинное культивирование способствует более активному развитию грибов-антагонистов и более быстрому накоплению биомассы (Мосичев, Складнев, Котов, 1982; Позмогова, 1991).
Изучение кинетики развития грибов при выращивании на круговой качалке показало, что уже через 24 ч культивирования большинство конидий посевного материала прорастали и образовывали бесцветный, слабосептированный мицелий, что приводило к незначительному загущению питательной среды. Через 48 ч культивирования отмечено значительное увеличение количества молодого, бесцветного, утолщённого, септированного мицелия. Утилизация среды составила 40 %, и ее консистенция стала желеобразной. Уровень pH во всех вариантах PV-3 Pénicillium vérrucosum var. cyclopium снизился с 7 до 5, PF-1 Pénicillium funiculosum - с 5,0 до 4,5. Через 72 ч культивирования объем мицелия в жидкости увеличился еще в 4-5 раз. Отмечено наличие толстого, слегка потемневшего, септированного и молодого слабосептированного, бесцветного мицелия, pH среды остался на том же уровне. Утилизация среды составила 70 %, и она слегка обесцветилась. Через 96 ч культивирования зафиксировано наличие толстого, сероватого, септирован-ного мицелия с гранулированной цитоплазмой. Отмечено начало лизиса старого мицелия. Утилизация среды составила 70 %, pH остался на том же уровне.
Таким образом, изучение кинетики развития грибов при глубинном культивировании показало, что наиболее интенсивный рост мицелия происходил в интервале 48-72 ч, что приводило к загущению культуры. В этот период происходило снижение pH культуральной жидкости.
При определении титра препаратов установили, что наиболее важным для максимального образования спор в условиях глубинного культивирования оказался температурный фактор. К 96 ч культивирования штамма PV-3 Pénicillium vérrucosum var. cyc-lopium при температуре 22 оС утилизация среды составила 10 %. Препарат был неоднородным, и со-
стоял из мицелиальных глобул разного диаметра, от 2 до 20 мм, титр равнялся 8,0х108 КОЕ/мл. Тогда как при температуре 25 оС утилизация среды составила 70 %, и титр увеличивался до 7,4х1010 КОЕ/мл (табл. 2).
Таблица 2 - Влияние температуры на рост штамма РУ-3 РетсШшш verrucosum гаг. еус1оршт в условиях глубинного культивирования
_Краснодар, ВНИИМК, 2006-2007 гг.
Питательная среда Срок культивирования, сутки Температура, 0С Утилизация среды, % Титр, КОЕ/мл
Рудакова 4 22,0 10,0 8,0 х 108 ± 1,3 х 106
25,0 70,0 7,4 х 1010 ± 2,2 х 108
Культивирование штамма PF-1 Pénicillium funicu-losum при температуре 22 оС показало, что утилизация среды также составила 10 % и титр равнялся 1,6х107 КОЕ/мл, тогда как при 30 оС утилизация среды составила 70 %, а титр увеличивался до 5,3х108 КОЕ/мл (табл. 3).
Таблица 3 - Влияние температуры на рост штамма PF-1 Pénicillium funiculosum в условиях глубинного культивирования
_Краснодар, ВНИИМК, 2006-2007 гг.
Питательная среда Срок куль-тиви-рования, сутки Температура, 0С Утилизация среды, % Титр, КОЕ/мл
Рудакова 4 22,0 10,0 1,6 х 107 ± 1,3 х 105
30,0 70,0 5,3 х 108 ± 2,2 х 106
В связи с тем, что в последние годы возникли затруднения с поставкой некоторых ингредиентов среды Рудакова, а именно кукурузного экстракта, а сахароза является довольно дорогим реактивом, то, с целью удешевления состава питательной среды, установили возможность замены кукурузного экстракта глютеном и дрожжевым экстрактом, а сахарозы -мелассой свекловичной (табл. 4, 5).
Таблица 4 - Влияние источников углеродного питания на рост штамма PV-3 Pénicillium verrucosum var. cyclopium в условиях глубинного культивирования
_Краснодар, ВНИИМК, 2006 - 2007гг.
Питательная среда Срок куль-тиви-рова-ния, сутки Источник углерода Норма, г или мл на литр воды Утилиза-ция среды, % Титр, КОЕ/мл
Рудакова 4 Сахароза 50,0 70,0 7,4х109 ± 1,9х107
Меласса 50,0 80,0 1,2х1010 ± 1,5х108
Использование в составе среды Рудакова мелассы в качестве источника углеродного питания показало возможность замены сахарозы. Титр, на примере штамма PV-3 Pénicillium verrucosum var. cyclopium, через четверо суток культивирования незначительно, но даже превышал эталон - 7,4х109-1,2х1010 КОЕ/мл.
Таблица 5 - Влияние источников азотного питания на рост штамма PV-3 Penicillium vérrucosum var. cyclopium в условиях глубинного культивирования
Краснодар, ВНИИМК, 2006-2007 гг.
Питательная среда Срок куль-тиви-рова-ния, сутки Источник углерода Норма, г или мл на литр воды Утилиза-ция среды, % Титр, КОЕ/мл
Рудакова 4 Куку- ру3- ный экстракт 10,0 80,0 2,0х109 ± 1,3х107
Глютен 5,0 80,0 4,0х109 ±4,3х107
10,0 80,0 1,3х109 ±3,5х107
15,0 80,0 3,0х109 ±1,3х107
Дрожжевой экстракт 10,0 80,0 2,0х109 ±2,4х107
15,0 80,0 6,0х109 ±1,8х107
20,0 80,0 8,0х109 ±2,9х107
Несмотря на замену в среде Рудакова кукурузного экстракта глютеном и дрожжевым экстрактом, титр биопрепарата оставался высоким.
Таким образом, вышеизложенное позволяет рекомендовать для глубинного культивирования штаммов-продуцентов модифицированную среду Рудакова, в которой в качестве источника азота можно использовать как кукурузный экстракт, так и глютен или дрожжевой экстракт, а в качестве источника углерода - мелассу.
Условия хранения различных препаративных форм биопрепаратов на основе штаммов-продуцентов PV-3 Penicillium verrucosum var. cyclopium и PF-1 Penicillium funiculosum.
Жидкая препаративная форма биопрепаратов, получаемая при глубинном культивировании, имела титр 108-1010 КОЕ/мл, г и была технологична в применении. Препараты хранились без изменения титра как в условиях холодильника, так и в условиях переменной температуры в течение 1,5 месяцев. Учитывая сроки наработки биопрепаратов и высокую производительность при данной технологии, установили, что глубинный способ наиболее перспективен для промышленного производства.
Микробиологические препараты, полученные на искусственных питательных средах, кроме клеток культур продуцентов и биологически-активных ве-
ществ, должны включать питательные добавки, стабилизаторы и другие вещества, увеличивающие длительность хранения биопрепаратов и облегчающие его применение в производственных условиях.
Для стабилизации биопрепаратов многие исследователи применяли крахмал, сахарозу, кукурузное масло, кремний, глицерин, полиэтиленгликоль, поли-винилпироллидон, карбоксилметилцеллюлозу, гумат натрия, хлористый магний, сульфат магния, бензойную кислоту, сорбиновую кислоту, сульфат натрия и др. (Гринько, 1995; Недорезков, 2002; Коломбет, 2006).
Нами отрабатывалась препаративная форма жидкая культура, при глубинном культивировании с добавлением к биомассе гриба ряда стабилизаторов и питательных добавок.
Установлено, что у биопрепарата веррукозина, на основе штамма-продуцента PV-3 Pénicillium verrucosum var. cyclopium, в препаративной форме жидкая культура (глубинное культивирование) при закладке на хранение титр варьировал в пределах 1,1-5,3х109 КОЕ/мл (табл. 6).
Таблица 6 - Влияние стабилизаторов и сроков хранения на титр веррукозина в препаративной форме жидкая культура
(глубинное культивирование) при температуре 10 оС
Краснодар, ВНИИМК, 2006-2007 гг.
Стабилизатор, % Титр, КОЕ/мл
перед закладкой на хранение через, месяцев
1,5 3 6
ПВП 1,0 1,4х109±1,3х10/ 2,7х109±1,3х10/ 4,4х109±2,2х10/ 1,9х108±1,3х106
3,0 1,2х109±1,2х107 1,5х109±1,0х10/ 5,0х109±2,4х10/ 1,0х109±1,0х10/
5,0 1,(М09±1,(М0/ 1,3х109±1,0х10/ 6,6х109±3,5х10/ 8,9х108±2,7х106
Гумат натрия 5,0 4,6х109±2,2х10/ 6,6х109±2,4х10/ 1,1х109±1,0х10/ 1,0х109±1,3х10/
10,0 1,1х109±1,0х10/ 3,1х109±2,0х10/ 1,1х108±1,0х106 6,3х10/±3,5х105
20,0 1,1х109±1,0х107 3,0х109±1,9х10/ 3,2х108±1,3х106 4,7х107±2,2х105
АсюрЗи-нвапсишла 0,1 2,0х109±13х10/ 6,5х109±3,5х10/ 1,0х108±1,7х106 5,3х10/±3,3х105
0,25 3,5х109±1,9х10/ 8,9х109±3,0х10/ 1,7х108±1,3х106 5,7х10/±3,5х105
Глицерин 5,0 3,0х108±2,0х106 3,0х109±2,0х10/ 8,3х108±3,3х106 7,0х106±2,4х104
10,0 5,3х109±2,2х10/ 2,5х109±1,3х10/ 6,7х108±3,5х106 4,3х105±2,2х103
Хлористый магний 5,0 1,2х109±1,0х10/ 5,0х109±2,3х10/ 1,4х109±1,3х10/ 1,1х108±1,3х106
10,0 2,8х109±1,3х10/ 4,6х1010±2,2х108 2,8х109±1,7х10/ 3,0х106±2,2х104
Сульфат магния 5,0 1,2х109±1,0х10/ 6,8х109±3,5х10/ 1,5х109±1,1х10/ 1,3х10/±1,3х105
10,0 1,9х109±1,3х10/ 2,8х109±1,9х10/ 2,2х109±1,3х10/ 1,0х108±1,0х106
Без стабилизатора (контроль) 4,3х109 ±3Дх10/ 2,6 х109±1,0х10/ 7,0х108±3,0х106 3,4х10/±1,3х105
Через 3 месяца хранения в лучших вариантах - ПВП, солями магния и 5 % гуматом натрия, титр также сохранился без изменения - 1,1-6,6х109 КОЕ/мл. В остальных вариантах и в контроле титр снизился на один порядок. Через 6 месяцев хранения максимальный титр верруко-зина сохранился в условиях температуры 10 оС с добавкой 3 % ПВП и 5 % гумата натрия.
В условиях переменной температуры в лабораторном помещении через 1,5 месяца титр веррукозина также сохранился без изменения - (109 КОЕ/мл) как в контроле, так и в вариантах (табл. 7).
Через 3 месяца хранения титр в контроле и во всех вариантах снизился, по сравнению с первоначальным на 1, 2 и более порядков. Лучшими вариантами отмечены 3 % ПВП, 5 и 20 % гумат натрия и 5 % сульфат магния (1,0 х 109, 8,7 х 108, 6,9 х 108 и 6,0 х 108 КОЕ/мл соответственно). Через 6 месяцев хранения глубинной культуры в условиях переменной температуры максимальный титр веррукозина сохранился с добавкой 3 % ПВП и 10 % сульфата магния - 1,7 х 107 и 3,7 х 107 соответственно. В контроле и в других вариантах за этот период титр снизился до 106 КОЕ/мл.
У биопрепарата фуникулозума, на основе штамм-ма-продуцента PF-1 Pénicillium funiculosum, в препаративной форме жидкая культура, титр при закладке на хранение варьировал в пределах 1,1-9,7х108 КОЕ/мл (табл. 8).
При хранении жидкой культуры в холодильнике в течение месяца титр оставался без изменения в вариантах с ПВП, глицерином, сульфатом магния и гуматом натрия. В вариантах с аскорбиновой кислотой, хлористым магнием и в контроле титр снизился на один порядок. Через 2 месяца хранения исходный титр биопрепарата сохранился только с добавкой 3% ПВП. Через 3 месяца хранения титр во всех вариантах и в контроле снизился до
103-4 КОЕ/мл.
При хранении жидкой культуры в холодильнике титр в течение полутора месяцев оставался без изменения - в пределах 1,3-8,9 х 109 КОЕ/мл.
При ранении глубинной культуры фуникуло-зума, в условиях переменой температуры, через месяц титр оставался без изменения в вариантах с ПВП и 5 % гума-том натрия, а с глицерином и сульфа-том магния вырос на один порядок (табл. 9).
Таблица 7 - Влияние стабилизаторов и сроков хранения на титр веррукозина в препаративной форме жидкая культура (глубинное культивирование) при температуре 18-25 оС
Краснодар, ВНИИМК, 2006-2007 гг.
Стабилизатор, % Титр, КОЕ/мл
Перед закладкой на хранение через, месяцев
1,5 3 6
ПВП 1,0 1,1х109±1,0х10' 9,3х109±3,3х10/ 7,8х108±3,1х106 2,0х106±1,3х104
3,0 1,4х109±1,3х107 3,6х109±1,7х107 1,0х109±1,3х107 1,7х107±1,1х105
5,0 1,6х109±1,1х10' 5,3х109±2,7х107 1,0х105±1,3х103 6,7х104±1,3х102
Гумат натрия 5,0 1,5х109±1,3х107 6,6х109±2,7х107 8,7х108±2,3х106 3,3х106±1,3х104
10,0 1,5х109±1,2х10' 4,9х109±2,2х107 1,3х107±1,3х105 1,0х106±1,3х104
20,0 1,2х109±1,0х10' 5,5х109±2,5х10/ 6,9х108±2,3х106 3,3х106±2,3х104
Глицерин 5,0 1,4х109±1,3х10' 2,3х109±1,1х10/ 1,3х107±1,3х105 1,0х105±1,3х103
10,0 1,5хЮ9±1,1хЮ' 2,9х109±1,0х107 1,7х10'±1,0х105 1,0х105±1,0х103
Хлорис-тый магний 5,0 2,2х109±1,7х107 1,4х109±1,3х107 9,5х107±2,7х105 1,0х107±1,1х105
10,0 1,0х109±1,0х10' 1,1х1010±1,3х108 5,0х10,±2,3х105 1,0х106±1,3х104
Сульфат магния 5,0 1,1х109±1,1х107 8,5х109±3,0х107 6,0х108±3,0х106 2,3х106±1,7х104
10,0 1,6х109±1,3х107 5,5х109±2,2х10/ 3,6х108±2,1х106 3,7х107±2,3х105
Без стабилиза-тора (контроль) 1,7х109±1,3х107 5,6х109±2,3х107 1,5х108±1,3х106 3,3х106±1,7х104
Таблица 8 - Влияние стабилизаторов и сроков хранения на титр фуникулозума в препаративной форме жидкая культура (глубинное культивирование) при температуре 10 оС
Краснодар, ВНИИМК, 2006-2007 гг.
Стабилизатор, % Титр, КОЕ/мл
перед закладкой нахранение через, месяцев
1 2 3
ПВП 1,0 6,9х108±3,0х106 5,9х108±2,7х106 1,3х107±1,0х105 5,0х10!±2,7х10
3,0 1,6х108±1,2х106 2,8х108±2,0х106 2,4х108±1,8х106 5,0х10'±2,2х10
5,0 5,0х108±22х106 3,6х108±2,3х106 1,0х106±1,1х104 1,0х103±1,1х10
Гумат натрия 5,0 3,6х108±2,0х106 2,1х108±1,0х106 1,0х106±1,0х104 1,3х104±1,2х102
10,0 2,2х108±2,1х106 4,0х108±22х106 1,0х106±1,0х104 1,0х103±1,0х10
20,0 2,2х108±1,9х106 7,0х107±3,3х105 1,0х106±1,0х104 1,0х103±1,1х10
Аскорбиновая кислота 0,1 7,9х№3,0х106 7,0х10,±3,0х105 1,0х104±1,0х102 1,0х103±1,0х10
0,25 6,8х108±3,3х106 3,0х10,±1,7х105 1,0х104±1,0х102 1,0х103±1,0х10
Глицерин 5,0 3,0х108±2ДхЮ6 2,1х108±1,3х106 1,0х104±1,0х102 1,0х103±1,0х10
10,0 3,3х108±2,0х106 22х10±2,0х106 5,7х107±3,3х105 1,0х103±1,0х10
Хлористый магний 5,0 7,8х108±2,7х106 6,0х10/±2,8х105 1,0х1СГ±1,0х102 1,0х103±1,0х10
10,0 2,3х108±2,0х106 2,3х10/±2,1х105 1,0х1С4±1,0х102 1,0х103±1,0х10
Сульфат магния 5,0 9,7х108±4,0х106 1,0х109±1,0х107 13х10±13х105 5,0х10=ь2,2х10
10,0 5,1х108±2,0х106 1,2хЮ9±2,0хЮ/ 1,7хЮ,±1,2х10' 1,Сх1Сf4±1,1х102
Без стабилизатора (контроль) 3,0х108±1,0х106 3,7х107±1,0х105 7,0х105±1,0х103 1,0х103±1,0х10
Таблица 9 - Влияние стабилизаторов и сроков хранения на титр фуникулозума в препаративной форме жидкая культура (глубинное культивирование) при температуре 18-25 оС
Краснодар, ВНИИМК, 2006-2007 гг.
Стабилизатор, % Титр, КОЕ/мл
перед закладкой нахранение через, месяцев
1 2 3
ПВП 1,0 5,1х108±3,3х106 6,0х108±2,7х106 7,3х107±3,7х105 5,0х103±2,7х10
3,0 1,2х108±1,1х106 3,0х108±2,2х106 3,0х108±2,1х106 5,0хК0±2,3х10
5,0 1,3х108±1,3х106 4,2х108±23х106 2,0х10,±2,1х105 1,0х103±1,7х10
Гумат натрия 5,0 7,8х108±3,5х106 1,9х108±1,3х106 5,0х10,±2,7х105 1,7х104±1,1х102
10,0 1,2х108±1,2х106 1,0х107±1,0х105 1,0х104±1,0х102 1,0х103±1,3х10
20,0 1,5х108±1,0х106 1,3х107±1,3х105 1,0х106±1,1х104 1,0х103±1,4х10
Аскорбиновая кислота 0,1 6,3х108±2,2х106 2,3х10'±1,7х1(C 1,0х106±1,1х104 1,0х103±1,2х10
0,25 7,7х108±3,7х106 22х10,±13х105 1,0х106±1,2х104 1,0х103±1,1х10
Глицерин 5,0 1,7х108±1,1х106 1,7х109±1,1х107 1,7х108±1,3х106 1,0х103±1,3х10
10,0 1,2х108±1,3х106 1,5х109±1,3х10' 3,1х108±2,1х106 1,0х103±1,2х10
Хлористый маний 5,0 1,6х108±1,3х106 3,0х106±2,1х104 1,0х105±1,1х103 1,0х103±1,0х10
10,0 1,6х108±1,2х106 1,0х10,±1,1х105 2,4х106±1,7х104 1,0х103±1,0х10
Сульфатмлния 5,0 8,3х10±4,3х106 1,1х109±1,0х107 1,5х108±1,1х106 5,0хК0±2Дх10
10,0 9,5х108±3,7х106 ^хЮ^^х!)7 1,2х108±1,0х106 1,0х10±1,1х102
Бгзсгабилизатора (контроль) 1,1х108±1,0х106 1,2х108±1,3х106 6,3х106±3,1х104 2,0хЮ±2,1х102
В остальных вариантах титр снизился до106-7 КОЕ/мл даже прежде, чем в контроле. Через 2 месяца хранения исходный титр биопрепарата сохранился с добавкой 3 % ПВП, глицерина и сульфата магния, при снижении в контроле до 6,3х106 КОЕ/мл. Через 3 месяца хранения глубинной культуры титр во всех вариантах и в контроле снизился до 103-4 КОЕ/мл.
С целью увеличения срока хранения биопрепаратов отрабатывалась препаративная форма порошок на перлите (табл. 10, 11).
тервале 48-72 ч, что приводило к загущению культуры и снижению pH культуральной жидкости.
3. Наиболее важным для максимального образования спор в условиях глубинного культивирования штаммов-антагонистов оказался температурный фактор. К 96 ч культивирования штамма PV-3 Pénicillium vérrucosum var. cyclopium при температуре 22 оС титр равнялся 10 8 КОЕ/мл, тогда как при температуре 25 оС титр увеличивался до 10 10 КОЕ/мл. При культивировании штамма PF-1 Pénicillium funiculosum при
Краснодар, ВНИИМК, 2005-2007 гг.
Вариант Титр, КОЕ/г
перед закладкой на хранение через, месяцев
1 3 6 9 12
Глубинная культура + перлит (1: 0,4) 7,8х109±3,3х107 1,0х1010±1,0х108 2,8х1010±1,3х108 2,2х109±1,1х107 7,0х108±2,7х106 6,0х104±2,2х102
Таблица 10 - Влияние срока хранения на титр веррукозина в препаративной форме порошок на перлите в условиях переменной температуры
Таблица 11 - Влияние срока хранения на титр фуникулозума в препаративной форме порошок на перлите в условиях переменной температуры
_Краснодар, ВНИИМК, 2005-2007 гг._
Вариант Титр, КОЕ/г
перед закладкой на хранение через, месяцев
1 3 4 5 6
Глубинная культура + перлит (1:0,4) 9,0х108±3,5х106 7,0х109±2,7х107 1,6х109±1,3х107 5,5х108±2,3х106 3,4х107±3,0х105 4,7х105±2,2х103
Установлено, что в течение первого месяца хранения порошка веррукозина в условиях переменной температуры лабораторного помещения титр даже незначительно вырос. В дальнейшем, через 9 месяцев хранения, происходило незначительное снижение титра, но он оставался довольно высоким 7,0х108 КОЕ/г. Через год титр снизился до104 КОЕ/г.
У биопрепарата фуникулозума в препаративной форме порошок на перлите через месяц хранения в условиях переменной температуры титр также немного повысился. В дальнейшем, происходило снижение титра до 108 КОЕ/г - через 4 месяца, и до 10 КОЕ/г - через полгода (см. табл. 11).
С целью увеличения сроков хранения порошка на перлите фуникулозума устанавливали оптимальные питательные добавки. При добавлении к порошку на перлите 25 % отрубей титр биопрепарата сохранялся на уровне 107 КОЕ/мл в течение года, тогда как без добавок снизился в течение полугода до 105 КОЕ/г (табл.12).
Выводы.
1. Максимальный выход биомассы при поверхностном способе культивирования штаммов-продуцентов биопрепаратов происходил при оптимальной температуре через 15 суток.
2. Наиболее интенсивный рост мицелия при глубинном культивировании штаммов происходил в ин-
температуре 22 оС титр равнялся 107 КОЕ/мл, тогда как при 30 оС титр увеличивался до 108 КОЕ/мл.
4. С целью удешевления питательной среды для глубинного культивирования штаммов-продуцентов биопрепаратов можно рекомендовать модифицированную среду Рудакова, в которой в качестве источника азота можно использовать как кукурузный экстракт, так и глютен или дрожжевой экстракт, а в качестве источника углерода - мелассу.
5. Максимальный срок хранения жидкой культуры при глубинном культивировании в условиях переменой температуры установлен для веррукозина с добавлением 3 % ПВП или 10 % сульфата магния 3-5 месяцев, для фуникулозума с добавлением 3 % ПВП или 5 % сульфата магния, или 5 % глицерина - 2 месяца.
6. Срок хранения порошка на перлите в условиях переменой температуры для веррукозина - 9 месяцев, для фуникулозума, с добавлением к перлиту 25 % отрубей - 12 месяцев.
Работа выполнена при поддержке гранта РФФИ № 06 - 08 - 00946-а
Таблица 12 - Влияние срока хранения и питательных добавок на титр фуникулозума в препаративной форме порошок на перлите (при температуре 18-25 оС)
Краснодар, ВНИИМК, 2006-2007 гг.
Вариант Титр, КОЕ/г
перед закладкой нахранение через, месяцев
1 4 6 8 12 18
Контроль (без питательной добавки) 7,0х108±2,7х106 1,0х109±6,7х107 3,0х108±4,1х106 1,7х105±2,5х103 0 0 0
Глицерин, 5 % 2,3х107±1,2х105 1,3х107±2,2х105 2,1х107±1,5х105 1,3х104±1,9х102 0 0 0
Гумат Ж 5 % 5,0х108±2,0х106 5,9х108±7,0х106 2,5х107±2,1х105 5,8х104±4,3х102 0 0 0
Сахароза, 5 % 8,5х108±1,1х106 1,3х109±2,1х107 3,1х108±2,9х106 1,0х106±2,3х106 0 0 0
Меласса, 5 % 3,5х108±2,5х106 4,4х108±1,7х106 9,1х108±1,8х106 1,7х107±2,9х105 1,3 х107±3,1х105 0 0
Отруби, 25 % 1,0х109±3,5х107 1,0х1010±2,0х108 3,8х1010±3,4х108 1,0х109±1,6х107 1,7х108±3,3х106 1,0х107±4,0х105 2,3х106±1,0х104
Литература
1. Маслиенко Л. В. Лаборатория биологических средств защиты растений (вчера, сегодня, завтра) // История научных исследований во ВНИИМКе за 90 лет. - Краснодар, 2003. - С. 273-281.
2. Шипиевская Е. Ю. Маслиенко Л. В. Поиск и отбор штаммов грибов-антагонистов возбудителя фомопсиса подсолнечника // Науч. -техн. бюл. ВНИИ маслич. культур. - Краснодар, 1999. - Вып. 120. -С. 73-75.
3. Маслиенко Л. В., Шипиевская Е. Ю., Асатуро-ва А. М. Перспективные биологические агенты для защиты подсолнечника от возбудителя фомопсиса // Информационный бюллетень ВПРС МОББ. - С.-П., 2007. - № 38. - С. 164-166.
4. Маслиенко Л. В. Обоснование и разработка микробиологического метода борьбы с болезнями подсолнечника // Дис. ... докт. биол. наук: защищена 03. 06. 05: утв. 07.10. 05. - Краснодар, 2005. - 377 с.
5. Егоров Н. С. Основы учения об антибиотиках. -М.: Наука, 2004. - 525 с.
6. Мосичев М. С., Складнев А. А., Котов В. Б. Общая технология микробиологических производств. - М.: Лёгкая и пищевая промышленность, 1982. - 263 с.
7. Позмогова И.Н. Культивирование микроорганизмов: итоги науки и техники, сер. Микробилогия. - М.: ВИНИТИ, 1991. - 208 с.
8. Гринько Н. Н. Экологизированная система защиты овощных культур закрытого грунта (для зоны влажных субстратников) // Регион. рек. ВНИИ биол. защиты растений. - 1995. - № 1. - С. 182-185.
9. Недорезков В. Д. Биологическая защита пшеницы от болезней в условиях Южного Урала. - М.: МСХА им. К.А. Тимирязева, 2002. - 172 с.
10. Коломбет Л. В. Научное обоснование и практическая реализация технологии создания грибных препаратов для защиты растений от болезней // Ав-тореф. дис. докт. биол. наук. - М., 2006. - С. 48.
