CC BY
18
УДК 616.981.455:616-097
С.С.Ветчинин, П.Х.Копылов, Н.В.Киселева, О.Г.Николаева, А.В.Гаврюшкин
получение иммуномагнитных частиц для определения клеток РГАПС&ЕНА TULARENSIS
Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии, Оболенск
Получены иммуномагнитные частицы с иммобилизованными высокоспецифичными моноклональными антителами FB11-x к Кгап^еИа tularensis. Их использование в иммуноферментном анализе позволило определить 105 - 106 КОЕ / мл К tularensis. Связывание бактериальных клеток с ИМЧ подтверждено флуоресцентной микроскопией.
Ключевые слова: Francisella tularensis, иммуномагнитные частицы, моноклональные антитела, иммунофермент-ный анализ, флуоресцентная микроскопия.
S.S.Vetchinin, P.Kh.Kopylov, N.V.Kiseleva, O.G.Nikolaeva, A.V.Gavryushkin Obtainment of the Immunomagnetic Particles for Francisella tularensis Cells Detection
State Scientific Centre of Applied Microbiology and Biotechnology, Obolensk
Obtained are the immunomagnetic particles with the immobilized highly-specific monoclonal antibodies FB 11-x to Francisella tularensis. Their usage in enzyme-linked immunoassays made it possible to detect 105 - 106 CFU/ml of F. tularensis. The binding of the bacterial cells with IMP was confirmed by the results of fluorescent microscopy.
Key words: Francisella tularensis, immunomagnetic particles, monoclonal antibodies, enzyme-linked immunoassay, fluorescent microscopy.
Особо опасные инфекции, относящиеся преимущественно к карантинным и природно-очаговым, в эпидемиологическом плане не теряют актуальности. В течение 2005 г. в России наблюдался резкий рост заболеваемости туляремией, который привел к госпитализации 831 человека (из них 109 детей в возрасте до 14 лет), и повышению показателя заболеваемости до 0,58 на 100 тыс. населения. Эпидемиологическая ситуация характеризовалась преимущественным инфицированием городских жителей (более 80 % случаев), в частности, в Москве впервые было зарегистрировано 230 случаев. Заражение происходило на территории Московской, Рязанской и Владимирской областей. Предположительно, причиной болезни людей стала активизация природного очага среди мышевидных грызунов. Ситуация существенно осложняется ошибками в индикации К tularensis и продолжает оставаться нестабильной. Поэтому разработка новых методов идентификации возбудителей опасных инфекционных болезней в различных объектах внешней среды остается актуальной ввиду ее социальной значимости. Использование традиционных методов культивирования патогенных бактерий и определение их биохимических маркеров в объектах окружающей среды может приводить к недооценке воздействия ряда сублетальных факторов, изменяющих метаболизм и репродуктивную способность бактерий при выращивании на искусственных питательных средах. Это приводит к задержке их роста и увеличению продолжительности анализов, как минимум, на одни сутки, особенно при низких
концентрациях микробов. Одним из подходов для решения этой проблемы может быть использование предварительной иммуномагнитной сепарации патогенов [6, 12]. Повышенный интерес к использованию магнитных носителей представляется правомерным, так как лежит в русле передовых тенденций создания полностью автоматизированных систем экспресс-диагностики патогенных микроорганизмов.
Целью работы было получение магнитных частиц (МЧ) и создание на их основе иммуномагнитных частиц (ИМЧ), пригодных для определения возбудителя туляремии.
Материалы и методы
Бактериальные штаммы. В работе использовали бактериальные штаммы из коллекции ФГУН ГНЦ ПМБ: Staphilococcus epidermidis ATCC 14990, Providencia rettrigeri, Pseudomonas aeruginosa ATCC 10145, Klebsiella pneumonia ATCC 13883, Pasteurella multocida ATCC 43137, Corynebacterium diphtheria № 75, Citrobacter diversus, Morganella morgani 1253, Salmonella typhimurium 79, Yersinia pseudotuberculosis шт. 1 (Pfeiffer), Yersinia enterocolitica 348-01, Legionella micdadei 11731 (NCTC), Esherichia coli ATCC 25922, Proteus mirabilis F-392, Burkholderia pseudomallei 109 (Roos) и Burkholderia mallei Z-12, Francisella tularensis штамм 15, Francisella novicida штамм 112.
Реактивы. Полиаллиламингидрохлорид и поли-стиролсульфонат (Aldrich, США), сульфаты двух- и
трехвалентного железа, гидроокись калия, тетраэток-сисилан, однозамещенный и двузамещенный фосфаты натрия, хлористый натрий, глутаровый альдегид, Трис, HEPES, бикарбонат натрия, натрий йоднокислый мета, боргидрид натрия, сухое обезжиренное молоко, твин-20, о-фенилендиамин, лимонная кислота (FLUKA, США), сефароза - белок А, стрепта-видин, Л-гидроксисукцинимидный эфир биотина. Д^’-диметилформамид, флуоресцинизотиоцианат (ФИТЦ), пероксидаза хрена, конъюгат антимыши-ных антител с пероксидазой хрена и натрий уксуснокислый (SIGMA, США), остальные реактивы - отечественного производства с квалификацией «х.ч.» или «о.с.ч.».
Получение модифицированных магнитных частиц с иммобилизованным стрептавидином. Магнитные частицы получали конденсацией сульфатов двух- и трехвалентного железа [10], силико-нировали [4] и покрывали полимерными слоями полиаллиламингидрохлорида (ПАА) и полистирол-сульфоната (ПСС), несущими чередующиеся противоположные заряды [11]. Последовательно повторяя процедуру обработки, наносили восемь полимерных бислоев: (ПАА-ПСС)8. Контроль поверхностного заряда магнитных частиц на каждом этапе обработки полимерами подтверждали измерением их электрофоретической подвижности [9]. Размеры магнитных частиц и их концентрацию в суспензии определяли методом световой микроскопии [1]. Для иммобилизации стрептавидина на поверхности магнитных частиц использовали 1 % раствор глутарового альдегида, 0,3 мл которого смешивали с 1,0 мл суспензии магнитных частиц в 0,1 М ФСБ, содержащей 0,005 % стрептавидина. Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 120 мин со скоростью 150 об./мин-1. Несвязавшиеся реагенты удаляли центрифугированием, осадок МЧ суспензировали в 1 мл 0,5 М трис-HCl (рН 8,5) и инкубировали при температуре 10 °C в течение ночи, после чего модифицированные МЧ с конъюгированным стрептавидином промывали 0,1 М ФСБ, рН 7,5.
Получение модифицированных моноклональных антител FBH-х. Использовали моноклональные антитела FB11-x [3, 8], которые очищали аффинной хроматографией на сефарозе - белок А. По результатам твердофазного ИФА их титр составлял не менее 1:100000 для концентрации МКАТ равной 1 мг/мл. Перекрестное взаимодействие МКАТ FB11-x с клетками перечисленных выше видов патогенных микроорганизмов определяли в твердофазном ИФА [2]. Биотинилирование МКАТ FB11-x проводили Л -гидроксисукцинимидным эфиром биотина [7]. Для флуоресцентного анализа МКАТ FB11-x обрабатывали флуоресцинизотиоцианатом по методу [5]. Пероксидазу хрена и МКАТ FB11-x конъюгировали перйодатным методом [13].
Получение иммуномагнитных частиц. Для определения оптимального соотношения МКАТ и магнитных частиц в микропробирки емкостью 0,2 мл
вносили по 2 мкл 10 % суспензии магнитных частиц, покрытых стрептавидином, и по 20 мкл биотинили-рованных антител в ФСБ с концентрациями от 0,05 до 1,0 мг/мл. Смесь инкубировали при непрерывном перемешивании в течение 30 мин при комнатной температуре и пятикратно промывали 0,01 М фосфатносолевым буферным раствором (рН 7,2), содержащим 0,05 % твина-20 (ФСБТ), удерживая частицы постоянным магнитом. Для уменьшения вероятности неспецифического связывания компонентов ИФА на последующих этапах комплекс МЧ - МКАТ FBH-х инкубировали со 100 мкл 5 % раствора обезжиренного молока в ФСБТ при тех же условиях. Избыток молока удаляли трехкратной промывкой ФСБТ и добавляли в каждую пробирку по 100 мкл раствора (1 :2000) антимышиных антител, конъюгированных с пероксидазой хрена. Суспензию инкубировали при перемешивании в течение 40 мин при температуре 37 °С. После пятикратной промывки ФСБТ в микропробирки вносили по 100 мкл субстрата, содержащего 0,003 % перекиси водорода и 0,04 % раствора о-фенилендиамина в 0,05 М цитрат-фосфатном буфере, рН 5,0. Через 10 мин реакцию останавливали добавлением 50 мкл 1 М раствора серной кислоты и регистрировали оптическую плотность продукта реакции при 492 нм. За оптимальную концентрацию МКАТ FBH-х принимали ее значение, при котором величина оптической плотности достигала предельной величины.
Определение клеток F. tularensis с использованием иммуномагнитных частиц. К 2 мкл 10 % суспензии иммуномагнитных частиц (ИМЧ) добавляли 30 мкл клеток F. tularensis, инкубировали при температуре 37 °С и перемешивали в течение 30 мин. Несвязавшиеся микробные клетки удаляли пятикратной промывкой ФСБТ. Как и в предыдущем разделе, варьировали концентрацию биотинилиро-ванных МКАТ FBH-х при постоянной концентрации клеток возбудителя туляремии, составлявшей 3,3-108 КОЕ / мл буферного раствора. Затем ИМЧ обрабатывали моноклональными антителами FBH-х, конъюгированными с пероксидазой хрена (1 мг/мл), разведенными 1:3000. Обработку, промывку и регистрацию результатов ИФА проводили, как указано в предыдущем разделе.
В другой серии вариантов ИФА использовали корректированную в предыдущих экспериментах концентрацию биотинилированных МКАТ FBH-х и варьировали концентрацию клеток F. tularensis, инактивированных на кипящей водяной бане в течение 15 мин, в интервале от 103 до 107 КОЕ / мл.
Флуоресцентная микроскопия клеток F. tu-larensis. Иммуномагнитные частицы, связанные с клетками F. tularensis (109 в 1 мл), инкубировали с раствором ФИТЦ-меченных МКАТ FBH-х (разведение 1:1000) в ФСБТ в течение 1 ч при температуре 37 °С при непрерывном перемешивании. Затем проводили семикратную промывку частиц тем же буфером. Осадок суспензировали в 50 мкл 50 % раствора
глицерина в 100 мМ трис-буфере, рН 8,5. Суспензию переносили на предметное стекло, накрывали препарат покровным стеклом и анализировали на флуоресцентном микроскопе (Opton, Германия). Контрольные пробы содержали МЧ, не обработанные биотинили-рованными МКАТ FB11-х.
Результаты и обсуждение
В экспериментах получены частицы магнетита (окись-закись железа), представляющие собой гранулы овальной формы размером 0,5-1 мкм. Начальные этапы модифицирования МЧ включали силикониро-вание поверхности оксидных микрогранул ферромагнетика с последующим нанесением чередующихся слоев полимеров, противоположные заряды которых обеспечивали их удерживание на поверхности. Величины электрофоретической подвижности частиц, покрытых полимерными слоями, измеренные на каждом текущем этапе модификации, составляли в среднем 0,28 мкмхсм*в-1хс-1 и - 1,16 мкмхсм*в-1хс-1 для слоев ПАА и ПСС соответственно.
Стрептавидин ковалентно иммобилизовали на аминогруппах внешнего слоя ПАА, что давало возможность варьировать природу биотинилированных лигандов и, в итоге, изменять функциональную активность ИМЧ в отношении различных возбудителей. Концентрация МЧ, покрытых стрептавидином, составляла 1010 частиц в 1 мл суспензии.
Связывающую способность МЧ с иммобилизованным стрептавидином определяли титрованием биотинилированными МКАТ FB11-x с последующей детекцией образованного аффинного комплекса в ИФА. Максимальное связывание биотинилиро-ванных МКАТ с МЧ наблюдали при концентрации антител равной 0,5 мг/мл. Так как ИМЧ создавались с целью идентификации клеток, для подтверждения предыдущего результата была использована систе-
Рис. 1. Иммуноферментный анализ связывания клеток F. tularensis иммуномагнитными частицами, образованными различными инкубационными концентрациями биотинилированных М^АГ FBll-x
Рис. 2. Определение клеток Е tularensis с помощью иммуномагнитных частиц иммуноферментным анализом
ма ИФА, включающая ИМЧ, бактериальные клетки и конъюгат МКАТ FB11-x с пероксидазой хрена. Введение клеток Е tularensis в эту систему показало, что для их определения в ИФА оптимальной является концентрация биотинилированных антител равная 0,2 мг/мл, а не 0,5 мг/мл (рис. 1). Этот эффект, вероятно, был обусловлен особенностями пространственного взаимодействия ИМЧ с бактериальными клетками. В связи с этим в последующих экспериментах с микробными клетками, образующими комплекс с ИМЧ, использовали концентрацию биотинилирован-ных МКАТ FB11-х равную 0,2 мг/мл. Такая система регистрировала в ИФА 105-106 КОЕ / мл Е tularensis в 1 мл (рис. 2).
Результаты взаимодействия МКАТ FB11-x, меченных ФИТЦ, с комплексом ИМЧ - бактериальные клетки представлены на рис. 3. Интенсивное зеленое свечение иммуномагнитных частиц, наблюдаемое в поле зрения флуоресцентного микроскопа, свидетельствовало об эффективном связывании ФИТЦ-меченных МКАТ FB11-x с клетками возбудителя Е Ш-larensis (рис. 3, В). Флуоресценция ИМЧ без добавления туляремийных клеток имела желтый цвет, что от-
„ Л Р’
• , 4» • • ' "
• • I* »'*4*
Т а» • • с , с V ♦. I
• г * , •. ^ »
'..I
*..K .
Рис. 3. Микроскопия комплекса иммупомагпитпых частиц и бактериальных клеток:
А - ИМЧ в видимом свете в отсутствии клеток F. tularensis;
Б - аутофлуоресценция ИМЧ в отсутствии клеток F. tularensis;
В - флуоресценция ИМЧ с клетками F. tularensis
ражало отсутствие взаимодействия ФИТЦ-меченных МКАТ FB11-x и магнитных частиц (рис. 3, Б).
Представленные результаты свидетельствуют о возможности использования ИМЧ для определения клеток Е tularensis в ИФА, так как чувствительность метода не уступает его твердофазному варианту на микропланшетах. Полученные высокоспецифичные ИМЧ могут успешно применяться для концентрирования клеток возбудителя из объектов окружающей среды. Простота, специфичность и наглядность определения патогена не требуют дополнительного культивирования клеток после их концентрирования и подтверждаются иммуноферментным и иммуноф-луоресцентным анализом.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Белый В.А., Пинчук Л.С. Введение в материаловедение герметизирующих систем. Минск: Наука и техника; 1980. 169 с.
2. Егоров А.М., Осипов А.П., Дзантиев Б.Б., Гаврилова Е.М. Теория и практика иммуноферментного анализа. М.: Высшая школа; 1991. 288 с.
3. ХлебниковВ.С., ГоловлевИ.Р., ТохтамышеваН.В., Аверин С.Ф., Кулеватский Д.П., Аверина А.А. и др. Определение антигенной детерминанты превентивных моноклональных антител, специфичных к липополисахариду Francisella tularensis. Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1993; 1:83-8.
4. Шляпникова Е.А., Шляпников Ю.М., Афанасьев В.Н., Афанасьева Г.В., Гаврюшкин А.В., Белецкий И.П. Исследование качества амино-модифицированных подложек, используемых для гибридизационного анализа. Биоорганическая химия. 2007; 33(2):261-8.
5. Goding J.W. Conjugation of antibodies with fluorochrome: modifications to the standard methods. J. Immunol. Meth. 1976; 13:215-26.
6. GrantI.R., BallH.J., Rowel M.T. Isolation ofMycobacterium paratuberculosis from milk by immunomagnetic separation. Appl. Environ. Microbiol. 1998; 64(9):3153-8.
7. Hofmann K., Finn FM., Kiso Y. Avidin-biotin affinity columns. General methods for attaching biotin to peptides and proteins. J. Amer. Chem. Soc. 1978; 100(11):3585-90.
8. Khlebnikov V.S., Vetchinin S.S., Tochtamycheva N.V., Golovljov I.R., Grechko G.K., Kulevatsky D.P. et al. Preventive of monoclonal antibodies specific to LPS Fracisella tularensis and lo-
calisation of antigenic determinant. 11th Meeting Europ. Federat. Immunol. Soc. Abstracts. Finland; 1991. P. 23-4.
9. Lvov Y., Mohwald H., Dekker M., editors. Protein architecture: interfacing molecular assemblies and immobilization biotechnology. New York; 2000. P. 125-67.
10. MassartR. Preparation of aqueous magnetic liquids in alkaline and acidic media. IEEE Trans. Magn. 1981; 2:1247-8.
11. Petrov A.I., Gavryushkin A.V, Sukhorukov G.B. Effect of temperature, pH and shell thickness on the rate of Mg2+ and Ox2- release from multilayered polyelectrolyte shells deposited onto microcrystals of magnesium oxalate. J. Phys. Chem. B. 2003; 107:868-75.
12. Pyle B.H., Broadaway S.C., McFeters G.A. Sensitive detection of Escherichia coli O157:H7 in food and water by immunomagnetic separation and solid-phase laser cytometry. Appl. Environ. Microbiol. 1999; 65(5):1966-72.
13. Wilson M.B., Nakane P.P. Recent developments in the periodate method of conjugating horseradish peroxidase (HRPO) to antibodies, in immunofluorescence and related staining techniques. In: Knapp W., Holubar K., Wick G., editors. Immunofluorescence and Related Staining Techniques. ElsevierINorth Holland Biomedical, Amsterdam; 1978. P. 215-24.
References (Presented are the Russian sources in the order of citation in the original article)
1. Belyi VA., Pinchuk L.S. [Introduction to the Material Engineering of Sealing Systems]. Minsk: Nauka i Tekhnika; 1980. 169 p.
2. Egorov AM., Osipov A.P., Dzantiev B.B., Gavrilova EM. [Theory and practice of enzyme-linked immunoassay]. M.: Vys. Shkola; 1991. 288 p.
3. Khlebnikov VS., Golovlev I.R., Tokhtamysheva N.V, Averin S.F., Kulevatsky D.P., Averina A. A. et al. [Epitope detection of the preventive monoclonal antibodies, specific for Francisella tularensis lipopolyssacharide]. Zh. Mikrobiol. Epidemiol. Immunobiol. 1993; 1:83-8.
4. Shlyapnikova E.A., Shlyapnikov YuM., Afanas’ev VN., Afanas’eva G.V, Gavryushkin A.V, Beletsky I.P. [Examination of the quality of amino-modified bases, used for the hybridization analysis]. Bioorganic Chemistry. 2007; 33(2):261-8.
Authors:
Vetchinin S.S., Kopylov P.Kh., Kiseleva N.V., Nikolaeva O.G., Gavryushkin A.V. State Research Center for Applied Microbiology and Biotechnology. Obolensk, Moscow Region, 142279, Russia. E-mail: [email protected]
Об авторах:
Bemчuнuн C.C., Копылов П.Х., Киселева НВ., Николаева О.Г., Гаврюшкин АВ. Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии. 142279, Оболенск, Московская обл. E-mail: [email protected]
Поступила 27.07.10.
