CC BY
26
УДК 616.982.27-039:576.809.7
С.С.Ветчинин1, П.Х.Копылов1, Н.В.Киселева1, А.М.Баранов1,
Е.В.Баранова1, Е.В.Галкина1, А.И-Борзилов1,
И.Я.Калачев2
ПОЛУЧЕНИЕ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ К БЕЛКАМ НАРУЖНОЙ МЕМБРАНЫ BURKHOLDERIA PSEUDOMALLEI ШТАММА С-141
Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии, Оболенск;
2Филиал института биоорганической химии РАН им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова, Пущино, Московская обл.
Моноклональные антитела получали к очищенным мембранным белкам B. pseudomallei с молекулярными массами 29 (р29) и 45 кДа (р45). Антитела клонов 4F2 и 1G11 специфически взаимодействовали в непрямом иммуноферментном анализе (ИФА) и иммуноблоте с белком р29 B. pseudomallei и Burkholderia mallei. Антитела клона 3G4 обладали сродством преимущественно к белковой структуре, связанной с ЛПС этих микроорганизмов. Результаты анализа взаимодействия антител 4F2 и 1G11 с антигенами клеточных лизатов различных возбудителей подтвердили их высокую специфичность к белку р29 B. pseudomallei и B. mallei.
Ключевые слова: Burkholderia pseudomallei, Burkholderia mallei, белки наружных мембран, моноклональные антитела.
Клинические формы мелиоидоза варьируют от острой септической до хронически протекающей инфекции. Септическая форма встречается примерно у 60 % пациентов, большинство из которых умирает в течение 2-3 дней, при этом до 20 % больных погибает при проведении антибиотикотерапии. До четверти пациентов остаются носителями инфекции с рецидивами после хемо- и антибиотикотерапии [15]. Возбудитель мелиоидоза в хронической фазе инфекции может скрытно персистировать месяцы и годы, индуцируя неожиданные проявления болезни, которые появляются на фоне иммуносупрессивных состояний, вследствие травм, ожогов, после введения стероидов, цитостатиков, на фоне диабета, бактериальных и химических интоксикаций [3]. В связи с этим чрезвычайно важна не только ранняя диагностика мелиоидоза для эффективного лечения, но и периодический контроль как в процессе лечения заболевших, так и после него.
Последнее десятилетие характеризуется увеличением интенсивности исследований, посвященных антигенам бактерий B. pseudomallei [1, 2, 6]. Среди них мембранные белки традиционно являются диагностически значимыми. В частности, описана перспективность использования для идентификации возбудителя мелиоидоза антител к поверхностным белкам 19,5, 30, 39 kDa [7, 13]. Проведенная нами ранее in vitro оценка иммуногенности антигенов бактерий рода Burkholderia показала, что перспективными кандидатами для использования в составе потенциальных вакцин являются мембранные белки р29 (29 кДа) и р45 (45 кДа) [4, 5]. Цель настоящего исследования состояла в получении моноклональных антител (МКАТ) к высокоочищенным мембранным белкам 29 и 45 kDa возбудителя мелиоидоза и исследование возможности использования МКАТ для диагностики.
Материалы и методы
Бактериальные штаммы и условия культивирования. В работе использовали бактериальные штаммы из коллекции ФГУН ГНЦ ПМБ: B. pseudomallei С-141, B. mallei С-5, Proteus vulgaris 104g, Micobacterium tuberculosis H37Rv, M. tuberculosis H37Rb, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, Yersinia pseudotuberculosis Pfeifer, Yersinia enterocolitica H2604, Bacillus cepacii AtCc 17759, B. cepacii BTX, B. cepacii ATCC 17769, Bacilllus anthracis СТИ-1, Escherichia coli ATCC 10536, Legionella pneumophila ATCC 33153, Salmonella typhimurium 79, Yersinia pestis EV НИИЭГ, Listeria monocytogenes NCTC 11994, Francisella tularensis 15/10.
Для выделения мембранных белков использовали культуру штамма B. pseudomallei С-141, выращенную на плотной питательной среде (ППС) на основе агара, содержащего LB с добавлением 1 % глицерина, 1,2 мМ MgSO4-7 H2O и 0,1 мМ FeSO47 H2O. Культивирование проводили в течение 24 ч при 37 °С, после чего микробные клетки смывали раствором 0,15 М NaCl. В суспензии определяли концентрацию живых клеток высевом десятикратных разведений на ППС и контролировали чистоту культуры микроскопией мазков, окрашенных по Граму. Суспензию клеток стерилизовали у-облучением в дозе 1,2-104 Зв, замораживали и хранили при -70 °С. Стерильность облученных препаратов подтверждали бактериологически и биопробами на золотистых хомяках.
Выделение мембран. Фракции мембран получали из разрушенных ультразвуком клеток B. pseudomallei по методу Gotoh et al. [9]. Очищенные мембраны суспендировали в 0,5 мл 30 мМ трис-HCl (рН 8,0) буферного раствора и определяли в пробах концентрацию общего белка, активность сукцинатдегидрогена-
зы по восстановлению 2,6-дихлорфенолиндофенола, замораживали и хранили при -70 °С [12].
Электрофорез в полиакриламидном геле. Электрофорез как в аналитическом, так и препаративном вариантах, проводили по методу Лэмли в редуцирующих условиях [10]. Перед разделением пробы смешивали в соотношении 1:1 с буфером, содержащим 125 мМ трис-HCl (рН 6,8), 4 % додецилсульфа-та натрия, 20 % глицерина, 10 % 2-меркаптоэтанола, 0,02 % бромфенолового синего и прогревали на кипящей водяной бане в течение 5 мин. Белки в гелях окрашивали Кумасси G-250, для выявления ЛПС использовали метод Fomsgaard et al. [8].
Выделение мембранных белков. После электрофоретического разделения мембранные белки экстрагировали из измельченных полос полиакриламидного геля (2,5 мм х 3,0 мм х 140 мм) буферным раствором, содержащем 30 мМ трис-HCl (рН 8,0), 6 М мочевины, 2 % тритона Х-100 и осаждали при -20 °С двойным объемом ацетона. Осадки промывали ацетоном, сушили, растворяли в ФСБР, содержащим 2 % нонаноил-К-метилглюкамида (Sigma, США) и анализировали в ДСН электрофорезе. Пробы, содержащие гомогенные белки с одинаковой молекулярной массой, объединяли и подвергали повторной очистке тем же способом. Очищенные препараты хранили при -70 °С.
Выделение липополисахаридов. Липополиса-хариды (ЛПС) B. pseudomallei получали воднофенольной экстракцией [14].
Получение моноклональных антител. Мышей линии BALB/с иммунизировали подкожно 100 мкг антигенов р29 и p45 с полным адъювантом Фрейнда в соотношении 1:1, через 30 дней проводили повторную иммунизацию с неполным адъювантом. Далее следовали три внутривенные инъекции по 20 мкг соответствующих антигенов с десятидневными промежутками. Для гибридизации использовали спле-ноциты мышей с титрами сыворотки в иммунофер-ментном анализе (ИФА) не менее 1:10000. Слияние миеломных клеток линии P3-X63-Ag8.653 со спле-ноцитами иммунных мышей проводили с использованием 50 % полиэтиленгликоля (вес/объем) и 5 % ДМСО (объем/объем), рН 8,0 [11]. Селекцию гибридных клеток проводили на среде RPMI 1640, содержащей 20 % (объем/объем) эмбриональной сыворотки теленка, 1 мМ L-глютамина, 1 мМ гипоксантина. 0,1 мМ тимидина и 0,3 мкМ аминоптерина (Sigma, США). Скрининг гибридных клеток, продуцирующих МКАТ, проводили с помощью ИФА. Выбранные продуценты клонировали методом предельных разведений. Для получения препаративных количеств МКАТ мышам линии BALB/с вводили внутрибрю-шинно 0,5 мл пристана (Химмед, Россия) и через две недели - 1 ■ 107 гибридных клеток. Моноклональные антитела выделяли из асцитической жидкости мышей аффинной хроматографией на колонках, упакованных сефарозой с иммобилизованным белком А.
Иммуноблот. Белки переносили на нитроцеллю-
лозные мембраны в режиме постоянного тока 380 мА в течение 1,5 ч. Неспецифическое связывание блокировали 5 % раствором (вес/объем) обезжиренного молока в фосфатно-солевом буфере, содержащем 0,05 % (объем/объем) твина-20 (ФСБТ). Дальнейшие этапы включали инкубации мембран в растворах МКАТ и конъюгата антимышиных антител с перок-сидазой хрена (Sigma, США). Продолжительность инкубаций составляла 1 ч при 37 °C. Окраску проводили раствором, содержащим 2,2 мМ 3,3’-диамино-бензидина, 0,02 % NiCl2 и 0,015 % перекиси водорода в 50 мМ трис буфере (рН 7,4).
Иммуноферментный анализ. Планшеты сенсибилизировали соответствующими мембранными белками, растворенными в 0,1 М карбонатном буфере (рН 9,6), по 1 мкг в лунку в течение 18 ч при 4 °C. Неспецифическую сорбцию блокировали ФСБТ, содержащим 5 % фетальной сывороткой теленка (объем/объем). Для промежуточных промывок и разведения рабочих растворов МКАТ и конъюгата антимы-шиных антител с пероксидазой хрена использовали этот же буфер. Длительность инкубаций не превышала 1 ч при 37 °C. Субстратом служил 0,1 % раствор о-фенилендиамина и 0,03 % перекиси водорода в 50 мМ цитрат-фосфатном буфере (рН 5,0). Реакцию останавливали через 10 мин добавлением в рабочие лунки 50 мкл 2 М раствора серной кислоты.
Определение подклассов мышиных моноклональных антител проводили с использованием ИФА-набора реагентов (Sigma, США) по инструкции производителя.
Результаты и обсуждение
Характеристика выделенных мембран и мембранных белков. Очищенные препараты мембран различались белковым составом и содержанием ЛПС. Наименьшее значение активности сукцинат-дегидрогеназы соответствовало фракциям тяжелой части градиента сахарозы. Электрофорез показал наличие мажорных и минорных белков в препаратах мембран, положение которых в полиакриламидных гелях в основном соответствовало литературным данным [9]. Использование 6 М раствора мочевины обеспечивало высокий уровень экстракции мембранных белков (до 120 мкг белка из одной полосы геля после препаративного электрофореза). После оценки иммуногенности [4, 5] препараты белков р29 и р45, выбранные для внутривенной иммунизации мышей и анализа МКАТ, повторно разделяли электрофорезом, экстрагировали и осаждали ацетоном (рис. 1, линии 2, 3, 4, 5).
Получение гибридом и анализ моноклональных антител. После гибридизации клетки высевали на 96-луночные планшеты, содержащие селективную среду. Скрининг культуральной жидкости (КЖ) на наличие моноклональных антител дал положительную реакцию в 8 лунках для белка р29 и 4 лунках для р45. Их повторная проверка в ИФА с дополнительно
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
20,1
14,2 ав шЬ
Рис. 1. Электрофорез и иммуноблот препаратов очищенных белков р45, р29 и ЛПС B. pseudomallei:
Числами в верхней части геля обозначены номера линий: 1 - маркеры молекулярных масс, кДа; курсивом справа; 2, 4, б - белок р45; і, З, ?, S - белок р29; P, 10, 11, 12 - ЛПС B. pseudomallei С-141.
Гель окрашен кумасси G-250, линии 1 - і; окраска серебром с окислением, линии 4, З, P; блоты обработаны моноклональными антителами: 3G4 - линии б, 10; 1G11 - линии 7, 11; 4F2 - линии 8, 12
очищенными белками показала уменьшение взаимодействия антител для большинства КЖ. Только для КЖ лунок 1G11, 4F2 (белок р29) и для 3G4 (белок р45) связывание МКАТ с белками сохранялось на первоначальном уровне. Обработка белковых препаратов протеиназой К приводила к потере взаимодействия антигена с МКАТ гибридом 1G11, 4F2 и 3G4 в ИФА. что свидетельствовало о сродстве антител именно к белковой части препарата. Гибридные клетки этих лунок клонировали и использовали для наработки МКАТ как в культуре клеток, так и в мышах.
Моноклональные антитела полученных гибридом относились к IgG1. В непрямом твердофазном ИФА и иммуноблоте моноклональные антитела не взаимодействовали с ЛПС возбудителя мелиоидоза (рис. 1, линии 10, 11, 12). Специфичность полученных МКАТ к белкам р29 и р45 проверяли имму-ноблотом (рис. 1, линии 6, 7, 8). Моноклональные антитела 1G11 и 4F2 выявляли мажорную полосу в области 29 кДа, совпадающую с молекулярной массой специфического белка. Антитела клона 3G4 выявляли в препарате р45, не только ожидаемую полосу в области 45 кДа, но и дополнительную диффузную полосу с наибольшей интенсивностью окраски в области 17 кДа. (рис. 1, линия 6).
Перекрестную активность МКАТ 3G4, 1G11. 4F2 анализировали в иммуноблоте с панелью антигенных препаратов 17 микроорганизмов, включая B. pseudomallei C-141 и B. mallei С-5. Антигенные препараты представляли собой ультразвуковые де-зинтеграты микроорганизмов. По данным иммуно-блота МКАТ, 3G4 активно взаимодействовали не только с антигенным профилем B. pseudomallei, но и B. mallei в диапазоне молекулярных масс от 55 до 15 кДа. Характер взаимодействия свидетельствует о сложной природе специфической мишени для данных антител (рис. 2А, линии 17, 18). Моноклональные антитела клонов 1G11 и 4F2 показали высокую специфичность к р29 B. pseudomallei и B. mallei (рис. 2Б
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19
А
- 72 55
35
24
17
11
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 g
72
55
U
24
17
11
1 2 3 4 5 б 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19
В
72 55
35
24
17
11
Рис. 2. Иммуноблот лизатов бактериальных культур с МКАТ против белков р45, р29 B. pseudomallei:
Числами обозначены номера линий в верхней части каждой мембраны. Иммуноблоты обрабатывали МКАТ: А - 3G4; Б - 1G11;
В - 4F2. Линии: 1 - P. vulgaris 104g; 2 - M. tuberculosis H37Rv; і - M. tuberculosis H37Rа; 4 - P. aeruginosa ATCC 27853;
З - Y. pseudotuberculosis Pfeifer; б - Y. enterocolitica H2604;
7 - B. cepacii ATCC 17769; S - B. cepacii BTX; P - B. cepacii ATCC 17759; 10 - B. anthracis СТИ-1; 11 - E. coli ATCC 10536;
12 - L. pneumophila ATCC 33153; 13 - S. typhimurium 79;
14 - Y. pestis EV НИИЭГ; 13 - L. monocytogenes NCTC 11994;
1б - F. tularensis 15/10; 17 - B. pseudomallei С-141; 1S - B. mallei С-5;
1P - маркеры молекулярных масс, кДа, курсивом слева
и 2В, линии 17, 18). Перекрестное взаимодействие моноклональных антител, полученных к белкам B. pseudomallei, с белками B. mallei показывает гомологию соответствующих белков этих микроорганизмов в структуре наружной мембраны. Слабо выраженные полосы на иммуноблоте с лизатами P. aeruginosa, Y pseudotuberculosis, L. pneumophila, S. typhimurium (рис. 2А, линии 4, 5, 12, 13 на мембране А) могут свидетельствовать о наличии сходных структур в составе лизатов исследуемых грамотри-
цательных микроорганизмов.
Таким образом, на основании анализа перекрестных реакций полученных МКАТ Ш11, 4Б2 и 304 было установлено, что антитела обладают выраженной специфичностью к белкам р29 и р45 возбудителей сапа и мелиоидоза.
Работа поддержана грантом № 1176 Международного научно-технического центра.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Авророва И.В., Пивень Н.Н, Жукова С.И. и др. Журн. микробиол. 2004; 5:29-33.
2. Викторов Д.В., Меринова Л.К., Алексеев В.В. и др. Мол. генет. 2005; 4:17-21.
3. Захарова И.Б., Викторов Д.В., Меринова О.А. и др. Пробл. особо опасных инф. 2006; 1(91):35-8.
4. Иванова О.А., Ганина Е.А., Борзилов А.И. и др. В кн.: Матер. VII межгос. науч.-практ. конф. государств-участников СНГ. Оболенск; 2006. С. 145-6.
5. Калачев И.Я., Борзилов А.И., Иванова О.А. и др. В кн. Матер. научн. конф. Предотвращение распростр. биол. оружия. The Cooper. Biol. Res. Ann. Rev. СПб; 2004. С. 42-4.
6. Пивень Н.Н, Рыбкин В.С., Плеханова Г.Н. и др. Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 2001; 1:29-33.
7. Anuntagool N., Rugdech P., Sirisinha S.J. Clin. Microbiol. 1993; 31:1232-6.
8. Fomsgaard A., Freudenberg M.A., Galanos C. J. Clin. Microbiol. 1990; 28:2627-31.
9. Gotoh N., White N.J., Chaowagul W. et al. Microbiology. 1994; 140:797-805.
10. Laemmli U.K. Nature. 1970; 227:680-5.
11. Nowinski R.C., Lostrom M.E., Tam M.R. Virology. 1979; 93:111-26.
12. Owen P., Freer J.H. Biochem. J. 1970; 120:237-43.
13. Pongsunk S., Thirawattanasuk N., Piyasangthong N. et al. J. Clin. Microbiol. 1999; 37:3662-7.
14. WestphalA., Lann H. Meth. Carbohydr. Chem. 1965; 5:8391.
15. Wuthiekanun V.D., Dance A.B., Chaowagul W. et al. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. 1990; 9:654-8.
S.S.Vetchinin, P.C.Kopylov, N.V.Kiseleva, A.M.Baranov, E.V.Baranova. E.V.Galkina, A.I.Borzilov, I.Y.Kalachev
Production of Monoclonal Antibodies against Outer Membrane Proteins of Burkholderia pseudomallei, Strain С-141
State Research Center for Applied Microbiology and Biotechnology, Obolensk; Branch of Shemyakin and Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry, Pushchino, Moscow Region
Monoclonal antibodies (MAb) were produced against two B. pseudomallei high-purified membrane proteins with Mr 29 kDa (p29) and 45 kDa (p45). Monoclonal antibodies from culture supernatant fluids of 4F2 and 1G11 clones showed specific interaction with protein moiety of p29 both Burkholderia pseudomallei and Burkholderia mallei in ELISA and Western blotting. However, MAb of 3G4 clone were bound to the LPS-protein structures of these microbial cells. Analysis of interaction of Mabs from 4F2 and 1G11 clones with antigens of different lysates of pathogenic cells confirmed high specificity of these antibodies to p29 membrane protein of B. pseudomallei and B. mallei.
Key words: Burkholderia pseudomallei, Burkholderia mallei, outher membrane proteins, monoclonal antibodies.
Об авторах:
Ветчинин С.С. (зав. сект.), Копылов П.Х. (зав. сект.), Киселева Н.В. (с.н.с.), Баранов А.М. (зав. отд.), Баранова Е.В. (вед.н.с.), Галкина Е.В. (н.с.), Борзилов А.И. (зав. лаб.). ГНЦ прикладной микробиологии и биотехнологии, Оболенск. E-mail: [email protected]
Калачев И.Я. (с.н.с.). Филиал института биоорганической химии им. М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН. Пущино, Московская обл. E-mail: [email protected]
Поступила 14.03.08.
